(FBIOyF) Producción de Grado - Tesinas, Residencias Educativas, Trabajos Finales

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    Estudio de isoformas de citrato sintasa en Glycine max y su rol en la acumulación de sustancias de reserva en semillas
    (2023) Ruzzo, Andrés Iván; Gerrard Wheeler, Mariel Claudia; Calace, Paula
    Entre las macromoléculas biológicas, las enzimas juegan un papel crucial en cada célula como catalizadores de prácticamente cualquier reacción bioquímica. Dentro de las enzimas de vías metabólicas se encuentra la citrato sintasa (CS), encargada de catalizar la condensación aldólica de acetil-CoA (AcCoA) y oxaloacetato (OAA), para la formación de citrato. Es una enzima clave para la respiración celular por su participación tanto en el ciclo de Krebs como en el ciclo de glioxilato. Se encuentra altamente conservada a lo largo de la evolución y está ampliamente distribuida en la naturaleza, por lo que podemos encontrarla en un amplio rango de organismos como el ser humano, otros animales, plantas y hasta en levaduras y bacterias; y localizada en diversos compartimentos subcelulares. De acuerdo a evidencia previa, CS facilitaría el exporte de carbono derivado de aminoácidos y otros ácidos orgánicos desde la mitocondria al plastidio, sitio en el que se produce la síntesis de precursores de compuestos de almacenamiento durante el desarrollo de las semillas. Dado que estos resultados nominan a CS como un target provisorio para el mejoramiento de cultivos, en este trabajo se estudiaron las propiedades bioquímicas y el patrón de expresión de las dos isoformas CS mitocondriales de soja. Primero, las enzimas fueron expresadas en un huésped bacteriano y purificadas por afinidad. Así, se determinó la actividad de ambas en función del pH, sus velocidades máximas de catálisis, sus afinidades por sus sustratos, sus estados oligoméricos y su regulación por compuestos efectores. Además, se cuantificó la abundancia de ambos transcriptos en respuesta a distintas condiciones nutricionales y hormonales usando cultivos in vitro de embriones. A pesar de la alta similitud de secuencia, los resultados indicaron diferencias sutiles que podrían indicar una contribución diferencial de ambas isoformas CS al flujo de carbono durante el llenado de las semillas de soja.
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    Estudio de expresión de RAC1 y su efecto sobre el desarrollo de resistencia a quimioterapéuticos de uso convencional en el tratamiento de cáncer colorrectal
    (2023) Otterstedt Boglione, Katia Belén; Menacho Márquez, Mauricio; Anselmino, Luciano; Malizia, Florencia
    El cáncer colorrectal (CCR) tiene una alta incidencia y mortalidad a nivel mundial. Su tratamiento involucra el uso de drogas citotóxicas como el 5-fluorouracilo (5-FU), uno de los quimioterapéuticos más utilizados contra este tipo tumoral. Sin embargo, es común que los pacientes desarrollen resistencia a este tratamiento. Cada vez más evidencia apunta a que la ruta de las Rho GTPasas podría ser un importante objetivo para paliar la resistencia a quimioterapéuticos en diferentes tipos de cáncer. Entre las Rho GTPasas más estudiadas y mejor conservadas en las especies eucariotas se encuentra Rac1. Se ha descrito que cumple un papel central en la reorganización del citoesqueleto de actina y que actúa regulador transcripcional de varios genes involucrados en la proliferación y el ciclo celular. En la mayoría de los cánceres, una expresión elevada de RAC1 se correlaciona con una menor probabilidad de sobrevida para el paciente. Por otro lado, el reposicionamiento de drogas se refiere al uso de fármacos en el tratamiento de patologías para las cuales no fueron originalmente formulados. Este enfoque es preferido sobre el diseño de fármacos de novo debido a que permite el ahorro tanto de tiempo como de recursos económicos. En este proyecto proponemos utilizar técnicas bioinformáticas para generar un perfil de expresión génica asociado a una alta expresión de RAC1 en pacientes de cáncer colorrectal con el fin de identificar vías celulares enriquecidas en el fenotipo. También se evalúa la posibilidad de utilizar un fármaco en reposicionamiento como agente resensibilizante para poder sobrepasar el obstáculo que la resistencia a 5-FU presenta para la terapia contra el CCR.
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    Caracterización funcional de las proteínas del virus de la necrosis del tabaco cepa A (TNVA) en la modulación de la respuesta hipersensible asociada a enfermedad en tabaco
    (2023) Depetris, Daiana Alexandra; Garcia , Lucila; Marano , María Rosa
    Las pérdidas económicas en la agricultura debido al estrés biótico representan entre un 26,3 y un 40,6 % de las pérdidas anuales, dependiendo del cultivo. En el caso de las infecciones virales, no hay métodos efectivos de control o erradicación. Las estrategias agronómicas se centran en semillas libres de virus y plantas resistentes obtenidas mediante mejoramiento genético. Identificar cómo los virus vegetales evaden las defensas de las plantas es clave para desarrollar cultivos resistentes y estrategias de control. Los virus vegetales son patógenos intracelulares que dependen de la célula hospedadora tanto para su replicación como para su movimiento célula-célula. La planta hospedadora responde a la infección viral en primera instancia a través del silenciamiento del ARN viral y la inmunidad activada por receptores de membrana, que se activa luego del reconocimiento de patrones moleculares asociados a patógenos (PAMPs), conocida también como PTI. Una segunda línea de defensa, conocida como inmunidad activada por efectores (ETI), se asocia generalmente con una respuesta hipersensible (HR) de muerte celular programada (PCD) que contiene al patógeno en el sitio de infección. Recientemente, hemos demostrado que las lesiones necróticas en hojas de Nicotiana tabacum inoculadas con el virus de la necrosis del tabaco cepa A (TNVA) son el resultado de la inducción de una respuesta de defensa ineficiente a la cual llamamos respuesta hipersensible asociada a la enfermedad (HRe). Esta respuesta no inhibe el movimiento viral a tejidos distales no inoculados, causando síntomas sistémicos como clorosis y enanismo. En este proyecto se clonaron y expresaron de manera transitoria en plantas de tabaco, tres proteínas de TNVA: la proteína de la cápside viral (CP), una proteína con posible función asociada la replicación viral (ORF1), y una de sus proteína pequeñas asociada al movimiento del virus (ORF3); con el objetivo de evaluar si las mismas están involucradas en la inducción de lesiones necróticas y/o poseen actividad supresora del silenciamiento del ARN, como se ha demostrado previamente para proteínas de la cápside viral de la familia Tombusviridae. La expresión transitoria de cada una de estas proteínas, no generó lesiones necróticas en hojas de N. tabacum. Sin embargo, CP y ORF1 fueron capaces de suprimir la respuesta de silenciamiento del ARN. Esta actividad supresora podría explicar el movimiento de TNVA hacia tejidos distales y la aparición de síntomas sistémicos. En relación a estos síntomas, demostramos que la clorosis y el enanismo están asociados con un desbalance en el estado redox celular, ya que las plantas capaces de reducir la generación de ROS son menos susceptibles a TNVA en comparación con las plantas Wild-type (WT). Estudios próximos se centrarán en determinar si las lesiones necróticas son inducidas por dsARNs y en evaluar si TNVA es capaz de modular la expresión de proteínas asociadas a la homeostasis de ROS.
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    Remediación de aguas contaminadas con molibdatos, empleando algas pardas como biosorbente
    (2023) Carnevale, Betina; Bertoni, Fernando A.
    El acceso al agua potable segura es uno de los desafíos más importantes a los que nos enfrentamos en la actualidad. El agua desempeña un papel crucial en la salud pública, el crecimiento económico y la sostenibilidad del medio ambiente. La ocurrencia natural de altas concentraciones de molibdeno en aguas subterráneas y la potencial generación de descargas al ambiente por la industria, hacen que resulte esencial encontrar métodos para removerlo. La biosorción ofrece una alternativa a las técnicas convencionales dado su bajo costo, sustentabilidad y simplicidad. Específicamente, las algas pardas, utilizadas como biomasa muerta, son un sorbente atractivo por su falta de valor económico y su elevado contenido de polímeros con potencial capacidad de retener oxoaniones. La participación de los grupos carboxilo e hidroxilo del adsorbente en la retención de molibdeno fue confirmada por análisis FT-IR. Las imágenes MEB mostraron modificaciones en la forma de la superficie del biosorbente post-adsorción. Se realizaron estudios en lote y en sistemas continuos. El mecanismo seguiría una cinética de pseudo-segundo orden, con una unión en dos pasos: atracción electrostática y unión química. Mediante el ajuste utilizando la ecuación de Langmuir, se observó una capacidad de adsorción de 1376 ± 2 mg.g-1 a 20 °C y pH= 1.0. Los datos de adsorción en continuo ajustaron mejor con el modelo Dosis-Respuesta modificado. Aplicando el modelo BDST se evaluó el comportamiento de la columna. La altura de lecho crítica fue 1.7 cm.
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    Efecto de la expresión de una flavodoxina cianobacteriana en mitocondrias de plantas
    (2023) Pagani, Constanza Elizabet; Lodeyro, Anabella F.; Vicino, Paula
    Tanto el estrés biótico como el abiótico generan un desbalance entre la producción y la neutralización de las especies reactivas del oxígeno (EROs), generando estrés oxidativo en la célula. En cianobacterias y algas, las respuestas frente al estrés oxidativo generalmente consisten en reemplazar los blancos sensibles al estrés por alternativas isofuncionales que no se vean afectados ante el estrés. Un ejemplo es la flavodoxina (Fld), que reemplaza la ferredoxina (Fd). La Fd es una proteína con centros Fe-S que participa en la cadena transportadora de electrones fotosintética (CTEF) y su expresión disminuye en condiciones de estrés oxidativo. La Fld es isofuncional a la Fd, pero en lugar del centro Fe-S tiene un grupo prostético flavina mono nucleótido (FMN). Acepta electrones del fotosistema I (FSI) y permite que el flujo de electrones se mantenga, además de competir con el O2 en reacciones de reducción y así disminuir la producción de EROs. A pesar de que las algas y cianobacterias son ancestros de las plantas, no se encuentra codificada la Fld en el genoma de estas últimas. Al generar plantas transgénicas que expresaban Fld en cloroplastos, se observó un aumento de la resistencia al estrés biótico, abiótico y xenobiótico, lo que demostró la capacidad de la proteína en complementar la deficiencia de Fd, disminuir la producción de EROs en cloroplastos y reestablecer el flujo de electrones fotosintético. La contribución del metabolismo redox de las mitocondrias vegetales en condiciones de estrés no es muy conocida. Existe una diversificada red metabólica asociada a la actividad de los citocromos P450 (CYP), enzimas oxidorreductasas con centros Fe-S que participan en procesos de síntesis de diversos componentes celulares y están involucrados en la protección frente a condiciones adversas, con actividad antioxidante, así como también en procesos de señalización. El dador de electrones para la reducción de los CYP es una Fd específica de mitocondrias denominada adrenodoxina (ADX). Aunque su estructura es diferente a la de las Fd de cloroplastos, es isofuncional y puede ser sustituida in vitro por la Fld. Por lo tanto, se propone que la complementación con dicha proteína en mitocondrias podría tener un impacto favorable en la tolerancia al estrés. Esta hipótesis es puesta a prueba en este trabajo de Tesina utilizando líneas de Arabidopsis y tabaco que expresan Fld en mitocondrias.
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    Sistema reportero para estudiar la interacción del péptido señal del sistema TAT con componentes del sistema de transporte
    (2022) Maradei, Cecilia Alejandra; Rodríguez, Fernanda
    En biotecnología, el estudio de los sistemas de secreción de proteínas en bacterias ha adquirido gran relevancia debido a su papel fundamental en numerosos procesos celulares. Uno de los sistemas de secreción más destacados es el sistema Tat (Twin-Arginine Translocation), el cual desempeña un rol crucial en la exportación de proteínas plegadas al periplasma bacteriano. La comprensión de este sistema y su aplicación en diversos campos, como la ingeniería de proteínas y la producción de biomoléculas, ha despertado un creciente interés en la comunidad científica. El sistema Tat es un sistema de transporte altamente conservado, presente en bacterias Gram negativas y Gram positivas, así como en algunas arqueas y plantas. A diferencia de otros sistemas de secreción, como el sistema Sec, el sistema Tat tiene la capacidad de exportar proteínas plegadas en su conformación nativa. Esto lo convierte en un sistema de transporte único y sumamente eficiente. En E. coli, el sistema Tat está compuesto por tres proteínas integrales de membrana: TatA, TatB y TatC. Mientras que en Gram positivos, como Bacillus subtilis, solamente está formado por TatA y TatC. Estas proteínas trabajan en conjunto para reconocer y transportar selectivamente las proteínas hacia el periplasma bacteriano. Aunque se ha logrado un progreso significativo en la caracterización de estos componentes, aún existen muchos aspectos que requieren una investigación más profunda. En el presente trabajo de tesina se diseñaron los procesos de obtención de dos proteínas recombinantes en E. coli: SUMO-eGFP (enhanced Green Fluorescent Protein) y SUMO-sp-eGFP (signal peptide eGFP). La presencia de SUMO (Small Ubiquitin-like MOdifier) protege al péptido señal Tat durante la purificación y, posteriormente, puede ser escindido utilizando la SUMO proteasa (Ulp1) para exponer el péptido señal y evaluar su interacción con componentes del sistema Tat y la chaperona molecular DnaK. Se llevaron a cabo la obtención y el clonado de los genes tatB y tatC de E. coli, y la posterior expresión y purificación del producto de este gen, el complejo TatBC. Se intentó observar cómo interactúan con el péptido señal Tat empleando ensayos de pull down y cromatografía de exclusión molecular.
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    Evaluación de la extracción de polifenoles de la semilla de chía utilizando sistemas micelares
    (2022) Gaudenzio, María Celeste; Boeris, Valeria; Pellegrini Malpiedi, Luciana
    En este trabajo se evaluaron metodologías alternativas amigables con el medio ambiente para la extracción de polifenoles (PFs) naturales de semillas de chía. La metodología propuesta en este trabajo estuvo basada en la extracción sólido-líquido empleando sistemas micelares acuosos (SMA) formados por Genapol X-080, Tergitol 15-S-7, citrato de sodio y agua. En la primera etapa se extrajeron los PFs utilizando diferentes solventes orgánicos y SMA, y se observó que los SMA estudiados permitieron extraer PFs con una mayor eficiencia. En la segunda etapa, se determinó su capacidad antioxidante mediante los métodos de captura de radicales DPPH (2,2-difenil-1- picrilhidrazil) y ABTS (monocatión de 2,2'-azinobis- (ácido 3-etilbenzotiazolina-6-sulfónico)), y en sistemas alimentarios mediante la actividad inhibitoria del pardeamiento de frutas y la inhibición de la peroxidación lipídica. Al comparar la eficiencia extractiva de los SMA formados por Genapol X-080 y Tergitol 15-S-7 disueltos en citrato de sodio a pH 5,00 y 7,00 respecto a los solventes orgánicos, se observó que la extracción con los SMA permitió obtener una cantidad significativamente mayor de PFs naturales. El SMA con Genapol X-080 pH 7,00 presentó la mayor eficiencia de extracción. Sin embargo, la mayor actividad antioxidante se observó para el SMA que contenía Tergitol 15-S-7 pH 7,00.
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    Expresión de determinantes de resistencia bacteriana en Escherichia coli Shigatoxigénica bajo la influencia aditivos alimentarios
    (2014) Bolognino, Ignacio; Casabonne, Cecilia
    El fenotipo Mar se caracteriza por una susceptibilidad disminuida a múltiples antimicrobianos debido a la pérdida de la porina Fy al incremento en la expresión de sistemas de expulsión (acrAB- TolC). El objetivo del trabajo fue analizar la influencia de determinados conservantes alimentarios en la expresión de los activadores transcripcionales del fenotipo de múltiple resistencia en Escherichia coli Shigatoxigénica. Se seleccionaron E. coli Shigatoxigénicas aisladas de heces y alimentos. En cepas sin inducir e inducidas con concentraciones subinihibitorias de propionato de sodio y sorbato de potasio, se determinó la concentración inhibitoria mínima (CIM) a cloranfenicol, tretaciclina y ciprofloxacina, el eflujo activo mediante el incremento de la tolerancia al solvente ciclohexano , el perfil de proteínas de membrana externa por SDS-PAGE y la expresión de genes acrA, acrB, y marA mediante Real Time PCR. En los aislamientos inducidos con los conservantes de observó un aumento de la CIM a cloranfenicol, tetraciclina y ciprofloxacina, un aumento de la tolerancia al ciclohexano, pérdida de la porina OmpF y un incremento de la expresión de los genes estudiados. Los aditivos alimentarios propionato de sodio y sorbato de potasio inducen el fenotipo Mar en los aislamientos de E. Coli Shigatoxigénica ensayados.
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    Explorando las funciones moleculares de nuevos elementos regulatorios de la expresión génica de enzimas málicas vegetales
    (2022) Rolle, Luciana Margarita; Saigo, Mariana; Gismondi, Mauro
    La enzima málica NADP-dependiente (NADP-ME) cataliza la conversión reversible de malato a piruvato y dióxido de carbono, utilizando como cofactor NADP+ y un catión divalente esencial para su actividad. La NADP-ME está ampliamente distribuida en la naturaleza, y por lo general, cada organismo presenta más de una isoforma activa. En plantas, a excepción de las NADP-MEs implicadas directamente en la fotosíntesis, el rol biológico particular del resto de las isoformas es poco claro. Un análisis filogenético de la familia NADP-ME de plantas mono y dicotiledóneas distribuye estas enzimas en cuatro grupos, dentro de los cuales las proteínas presentan un alto grado de conservación tanto de rasgos peptídicos y estructurales como de abundancias espacio-temporales, que podrían estar relacionados con funciones conservadas. En particular, AtME1 de Arabidopsis thaliana y ZmNADP-ME3 de Zea mays pertenecen a un mismo grupo filogenético que abarca isoformas citosólicas de mono y dicotiledóneas, indicando una relación evolutiva estrecha y quizás una función altamente conservada en angiospermas, aún desconocida. Ambas enzimas se expresan casi exclusivamente durante el desarrollo del grano, son inducibles con el avance de la dormición del grano y mediante la hormona ABA. Mediante análisis bioinformáticos sobre los genes que codifican estas enzimas y de NADP-MEs embrionarias de especies monocotiledóneas, se identificaron arreglos conservados de elementos cis conocidos y desconocidos en la zona del inicio transcripcional anotada. Entre estos elementos se encuentra una díada de motivos de respuesta a ABA (ABRE). Con el fin de profundizar en la caracterización de la familia NADP-ME de maíz y en la identificación de características específicas de ZmNADP-ME3, se recopiló información genómica, transcriptómica y proteómica a partir de bases de datos y trabajos sobre análisis de expresión, obteniendo patrones de expresión únicos para cada isoforma NADP-ME de maíz. Además, se realizaron ensayos de expresión para demostrar la funcionalidad de diferentes fragmentos de la zona del inicio transcripcional del gen ZmNADP-ME3. Esto resultó en la identificación de regiones necesarias para regular el inicio transcripcional a partir de este promotor.
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    Estudio de la biodegradación de contaminantes persistentes y emergentes empleando microorganismos y / o lodos biológicos de origen industrial
    (Universidad Nacional de Rosario. Facultad de Ciencias Bioquímicas y Farmacéuticas., 2019-12) Baffo, Natacha Ailén; Pérez, Leonardo Martín; Loureiro, Dana Belén
    En el presente trabajo de tesina se evaluó la potencial aplicación de lodos residuales industriales de alta carga bacteriológica, obtenidos de una planta generadora de biogás, para la biorremediación de matrices líquidas impactadas con ibuprofeno, un fármaco comúnmente utilizado como analito modelo de los llamados contaminantes emergentes. Además, se realizó una caracterización fisicoquímica del lodo biológico, así como también el análisis metagenómico de la población microbiana pre-existente en dichas muestras. Se demostró un incremento significativo en la viabilidad celular de las bacterias facultativas presentes en el lodo crudo en presencia de ibuprofeno, encontrándose una interesante correlación entre la microbiota hallada en dichas muestras frente a la reportada en otros estudios orientados a la caracterización de comunidades microbianas con un importante rol en la degradación de xenobióticos Adicionalmente, se estudió la capacidad de bacterias previamente aisladas del lodo residual para utilizar hidrocarburos del diésel comercial (diésel B10) como fuente de energía para sus actividades metabólicas. En este caso, se pudo demostrar un incremento significativo en la viabilidad celular de dos de las tres cepas analizadas frente al contacto con diésel comercial como única fuente de carbono, en concordancia con una disminución en la fracción petroquímica y biodiésel del combustible utilizado en los ensayos de biodegradación. Sin embargo, se necesitan más estudios orientados a dilucidar las complejas interacciones que pueden co-existir entre los microorganismos que forman parte de nichos tan complejos, con el fin de diseñar estrategias biotecnológicas eficientes, seguras y confiables, para su aplicación en la biorremediación de sitios impactados con contaminantes persistentes y emergentes.
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    Caracterización del microambiente de un tumor de mama triple negativo en ratones híbridos derivados del cruzamiento de dos líneas endocriadas
    (2020) Capitani, María Celeste; Rozados, Viviana; Mainetti, Leandro
    El cáncer es una enfermedad de origen genético en la cual están incluidos muchos tipos diferentes; entre ellos, el cáncer de mama es el diagnosticado con mayor frecuencia entre las mujeres, a nivel mundial. El microambiente tumoral(MAT) comprende una masa de células heterogéneas que incluyen células inmunes, endoteliales, fibroblastos y citocinas, junto con células cancerosas. Todos estos componentes, pueden establecer una respuesta antitumoral protectora o inducir eventos que favorezcan la progresión tumoral. Los modelos animales son una herramienta fundamental para el estudio del cáncer. Nuestro objetivo fue estudiar el MAT y su participación en el crecimiento/rechazo del adenocarcinoma de mama M-406 en las líneas parentales CBi y CBi- , y en los híbridos F1. Se concluyó que, durante la fase aguda, la respuesta inmune innata, en parte y a través de los granulocitos eosinófilos, jugaría un rol muy importante en el rechazo tumoral en CBi - . Por otro lado, una respuesta innata poco efectiva, junto con la conformación de un MAT inmunosupresor serían, en parte, responsables del crecimiento exponencial de M-406 en CBi y la F1. La mayor expresión de HiF-1α (factor 1 inducible por hipoxia) y el mayor porcentaje de colágeno, en los tumores provenientes de F1, generó tumores más agresivos, determinado por la presencia de metástasis pulmonares.
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    Estudio comparativo de los factores bioquímicos que inciden en la calidad de frutos de distintas variedades de arándano (vaccinium corymbosum) durante la maduración
    (2020) Valderramo, Lara; Tripodi, Karina E. J.; Montecchiarini, Marina L.
    Los arándanos (Vaccinium corymbosum) son considerados una de las bayas de mayor importancia económica a nivel mundial. En Argentina, su producción resulta atractiva debido a la rentabilidad que puede conseguirse por la oferta en contra-estación hacia países del hemisferio norte, cuando no hay disponibilidad local. Uno de los principales rasgos de calidad del arándano es la firmeza, puesto que incide de manera relevante en la aceptación del consumidor. El ablandamiento del fruto que acompaña el proceso de maduración, representa el cambio más dramático, que conduce a importantes pérdidas en su calidad. Está bien documentado que el ablandamiento del fruto responde a múltiples factores como el estado hídrico, daños en la membrana celular y modificaciones de la pared celular, entre otros. A su vez, estas características se ven influenciadas por las variedades, el clima y la composición del suelo, lo que dificulta establecer las causas de la pérdida de firmeza. En este trabajo se realizó una amplia caracterización de diferentes aspectos bioquímicos y moleculares en el epicarpio de frutos de tres variedades de arándano (‘Emerald’, ‘Snowchaser’ y ‘O'Neal’) que se diferencian en su firmeza, aspecto, sabor y tiempos de cosecha, en tres estadios del desarrollo diferentes (verde, pintón y maduro). Para ello, se seleccionó un enfoque enzimático, metabolómico e iónico. Además, se utilizó un enfoque microescructural para develar los cambios más claros que tienen lugar en la microestructura de la fruta entre las variedades de firmeza contrastante (‘Emerald’ y ‘O ́Neal’) en dos estadios de maduración distintos (verde y maduro). Los resultados presentados aquí muestran marcadas diferencias en ciertas variables en los estadios y variedades estudiados. La comparación de los datos obtenidos en primer lugar ayudó a caracterizar los eventos de cada etapa de maduración, comunes a todas las variedades. Se demostró que en fruto verde abundan los metabolitos relacionados con la división celular, el metabolismo antioxidante y la pared celular, así como con la síntesis de varias biomoléculas que acompañan este último proceso. En cambio, en fruto maduro se destaca el elevado contenido de metabolitos relacionados con la expansión celular y el metabolismo de la pared celular, así como también con la síntesis de moléculas involucradas en el sabor, el aroma y la calidad nutricional de la fruta. Mientras que, en fruto pintón, se encuentran niveles intermedios de los compuestos más contribuyentes a las etapas verde y madura. En tanto, la comparación de las variedades ayudó a diferenciar los procesos que en conjunto conducen a una mayor resistencia mecánica de la pared celular y a un mejor mantenimiento de la turgencia de las células y del estado hídrico en el fruto más firme.
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    Estudio de la contribución de la enzima málica NADP 1 de Arabidopsis thaliana durante el desarrollo de la semilla y la respuesta al estrés hídrico
    (2020) Torcolese, Giuliana; Arias, Cintia Lucía
    Arabidopsis thaliana (L.) Heynh posee tres enzimas málicas dependientes de NADP citosólicas (EM-NADP 1-3) y una plastídica (EMNADP4). EM-NADP2 y EM-NADP4 muestran expresión constitutiva y predominante, en contraste con EM-NADP1 y EM-NADP3, cuyas expresiones están restringidas a tejidos o condiciones específicas. Particularmente, el transcripto de EM-NADP1 es casi indetectable durante el crecimiento vegetativo normal; sin embargo, en este trabajo se demostró su inducción en las últimas etapas del desarrollo de las semillas. En semillas maduras deficientes de EM-NADP1, se observó una actividad total de EM-NADP significativamente menor que en semillas maduras del tipo salvaje, evidenciando así, la contribución de EM-NADP1 a la actividad total. Estas semillas mostraron a su vez, alteraciones en la viabilidad y en la capacidad germinativa. Además, los tratamientos con ácido abscísico (ABA), NaCl y manitol indujeron específicamente la acumulación de EM-NADP1 en plántulas. Finalmente, análisis fenotípicos de plantas deficientes en esta enzima evidenciaron una respuesta más débil al ABA sobre la inhibición del crecimiento de la raíz primaria y lateral y en el cierre de los estomas. Los resultados sugieren que EM-NADP1 desempeña un papel especializado, participando en la respuesta del ABA durante el desarrollo de la semilla, así como en la respuesta al estrés hídrico.
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    Evaluación de la participación de la glucosa y las especies reactivas del oxígeno durante la capacitación espermática
    (2021) Savino, Santiago Luis; Teijeiro, Juan Manuel
    La capacitación es un requisito previo para una fecundación exitosa, por lo que es un tema de gran interés para la biología espermática. Éste es un evento extremadamente complejo que requiere de condiciones iónicas y energéticas específicas para apoyar estos cambios bioquímicos que abarcan numerosos procesos integrados que pueden ocurrir simultáneamente durante una misma ventana de tiempo. Los espermatozoides de cerdo en este sentido ofrecen claras ventajas como modelo para estudiar las vías de señalización. Estas células se encuentran relativamente inactivas en medios de conservación líquido hasta que se estimulan, lo que permite evaluar de manera relativamente fácil los cambios en su fisiología. Los espermatozoides de cerdo son muy susceptibles a las especies reactivas del oxígeno (ROS), pero se sabe que las ROS desempeñan un papel importante en la conducción de los cambios fisiológicos asociados con la capacitación. Las ROS estimulan una cascada de fosforilación de proteínas llevada a cabo por la proteína quinasa A (PKA). Cuando se generan en exceso, las ROS pueden inducir peroxidación de lípidos que, a su vez, altera las características de la membrana que son críticas para el mantenimiento de la función de los espermatozoides, incluida la capacidad de fecundar el óvulo. Los altos niveles de estrés oxidativo finalmente dañan el ADN en el núcleo del espermatozoide. La bioenergética de la capacitación de los espermatozoides es poco conocida a pesar de su papel fundamental en el mantenimiento de los eventos bioquímicos y moleculares que ocurren durante la activación de los gametos. La glucólisis y la fosforilación oxidativa mitocondrial (OXPHOS) son las dos principales vías metabólicas que producen ATP, la principal fuente de energía de los espermatozoides. Sin embargo, no está claro cómo el espermatozoide porcino reprograma el metabolismo de la glucosa, ni los mecanismos y efectos que desencadena sobre la capacitación de esta célula espermática. En este trabajo de tesina se propuso analizar el efecto de las ROS y la glucosa en la capacitación. Se suplementaron muestras de espermatozoides porcino con Na2CrO4 o con H2O2 tanto en presencia como en ausencia de glucosa; y se evaluó el contenido de ROS de las muestras de espermatozoides, el porcentaje de espermatozoides capacitados y la fosforilación de proteínas en motivos reconocidos por la PKA. Los resultados demostraron que tanto la glucosa como las ROS presentan efectos adversos en la capacitación de los espermatozoides. Sin embargo, los efectos combinados del H2O2 junto con la glucosa, estimulan este fenómeno, indicando que sería necesario una mínima cantidad de ROS y que éstos podrían provenir de un origen diferente al de la mitocondria. Todo este conocimiento en conjunto, además de su importancia obvia para la ciencia básica, podría eventualmente traducirse en el desarrollo de estrategias novedosas para el tratamiento de la infertilidad masculina, la reproducción artificial y los métodos de selección de espermatozoides.
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    Efecto de los componentes de la yerba mate sobre las células óseas
    (2021) Sanz, Natasha; Brun, Lucas; Ruiz, María Laura
    La yerba mate (YM) es una infusión ampliamente consumida en países de América Latina. Está compuesta por sustancias bioactivas como polifenoles y xantinas, que tienen acciones biológicas como antioxidantes, hipolipemiantes y disminución en el peso. Su actividad en el sistema óseo comenzó a estudiarse en los últimos años y se han reportado efectos positivos de las sustancias que componen la YM. Se observó un incremento en la densidad mineral ósea (DMO) in vivo, así como en la viabilidad y proliferación de las células preosteoblásticas en cultivo. También se reportaron efectos controversiales por parte de la cafeína, la cual tendría efecto negativo sobre la DMO; sin embargo, a bajas concentraciones de cafeína combinada con ácido clorogénico, también presente en YM, se vio un aumento en la proliferación de las células preosteoblásticas. Para profundizar los efectos de esta infusión en el tejido óseo en este trabajo nos propusimos evaluar el impacto de los compuestos cafeína, ácido clorogénico y rutina de forma individual y combinada, sobre células osteoblásticas diferenciadas y sobre células osteocíticas. Como resultado de este trabajo se logró poner a punto la diferenciación de células preosteoblásticas (MC3T3-E1) en medio de DMEM, SFB 10% y antibióticos suplementado con ácido ascórbico 50 µg/ml y β-glicerofosfato 5 mM. Por otro lado, no se alcanzaron resultados satisfactorios con la técnica de diferenciación de células mesenquimales obtenidas de medula ósea. Resta evaluar la viabilidad y proliferación de las células osteoblásticas diferenciadas al tratarlas con los componentes de la YM como rutina, ácido clorogénico y cafeínas. Las células MLO-Y4 se cultivaron en medio α-MEM con SFB 10% y antibióticos en placas previamente tratados con una solución de colágeno tipo I al 0.1% en PBS. Se encontró un aumento significativo en la viabilidad de células MLO-Y4 cuando fueron expuestas a concentraciones de rutina 1 µg/mL, o cafeína 0.66, 1.66, y 3.3 µg/mL (17.7%, 11.9%, 6.9%, 14.9% y 13.7% respectivamente) sin cambios en su morfología aparente. El tratamiento combinado de rutina y cafeína (R10/C0.66 µg/mL) produjo aumento la viabilidad celular (8.4%), pero la combinación de ácido clorogénico y cafeína (AC10/C0.66 µg/mL) no generó cambios. En síntesis, los resultados obtenidos en este trabajo sugieren que los efectos positivos de la YM a nivel óseo previamente descriptos, podrían deberse, al menos en parte, a la mayor supervivencia de las células óseas.
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    Selección de marcadores génicos de Bacillus para la resolución taxonómica a nivel de especie
    (2021) Petitti, Tomás; Espariz, Martín; Torres Manno, Mariano
    El grupo de Bacillus cereus abarca una amplia gama de cepas patógenas siendo B. anthracis y B. cereus eméticas y diarreicas las epidemiológicamente más relevantes. Por otro lado, B. thuringiensis cumple un rol importante en el control de plagas de insectos. Asimismo, las cepas del grupo B. cereus se adaptan a diversos nichos ambientales como el suelo o las plantas e incluso se han utilizado, como el caso de cepas de la especie B. toyonensis, como probióticos en mamíferos. La asignación de especies dentro del grupo B. cereus es muy desafiante habiéndose reportado numerosos casos de asignaciones incorrectas o incoherencias entre la asignación taxonómica, las características genómicas y fenotípicas de los aislamientos. Sin embargo, la correcta asignación a nivel de especie de las cepas de uso industrial o agronómico tiene un gran impacto en la forma en que se seleccionan, cultivan, aprueban para su uso y finalmente comercializan, debido al hecho de que dichas asignaciones, implícitamente o no, se utilizan para predecir la seguridad y el rendimiento de las bacterias. En este trabajo de tesina nos planteamos generar clasificadores que permitan determinar la identidad a nivel de especie de cepas del grupo B. cereus. Para ello, inicialmente las secuencias genómicas disponible de este grupo se descargaron de GenBank. Se determinaron los parámetros de los ensamblados y se seleccionaron aquellas secuencias genómicas que superaron los criterios de calidad y completitud en base al contenido de genes housekeeping. De esta manera, se determinó que 412 secuencias genómicas del grupo B. cereus de las 2460 secuencias disponibles en GenBank no superaron los valores de calidad establecidos. De las restantes, 63 secuencias no se consideraron completas debido a que carecían de genes housekeeping. La identidad taxonómica a nivel de especie de las cepas en estudio se validó o reasignó por análisis de identidad nucleotídica promedio y análisis de secuencias multi-locus. Se determinó que de las 343 secuencias genómicas del grupo B. cereus disponibles desde el 4 de abril de 2018 hasta el 01 de julio de 2020 en GenBank, 166, 140 y 37 corresponden a cepas de los Clados 1, 2 y 3, respectivamente. El 40,71%, 54,10% y 48,57% de las secuencias genómicas de buena calidad de los Clados 1, 2 y 3 recientemente disponibles en GenBank debieron ser reclasificadas ya que su denominación era incorrecto o desactualizada. A su vez, 5 cepas (CH140a_4T, B-9, DE0191, XIN1 y SH5_2) a las que denominamos genomoespecie 38, 39, 40, 41 y 42 se clasificaron como nuevas genomoespecies. Posteriormente con la finalidad de entrenar y evaluar clasificadores apropiados para el grupo B. cereus, se definieron al azar dos grupos de secuencias. Un grupo de entrenamiento que se utilizó para el entrenamiento de modelos predictivos de clasificación de cepas y un grupo de evaluación que se utilizó para la determinación del error del modelo. Para evaluar la precisión de cada clasificador basado en los genes marcadores reportados en la bibliografía y el método de machine learning Random Forest se realizaron validaciones cruzadas. Se observó que los clasificadores basados en el gen ARNr 16S mostraron precisiones inferiores al 75% indicando que este marcador no es apropiado para diferenciar cepas de distintas especies e incluso clados del grupo B. cereus. Sin embargo, los bosques clasificadores mostraron que 11 genes marcadores reportados en la bibliografía permitieron asignar las especies de los Clados 1, 2 y 3 y los clados del grupo B. cereus con una precisión y valores kappa estimados superiores al 98%. En contra de nuestra hipótesis inicial, no se identificaron genes del core que permitan generar clasificadores con precisiones superiores a los 11 marcadores seleccionados para cada clado. Por último, los clasificadores basados en los genes gyrB, pyc o lon mostraron ser los más precisos para identificar las especies o clados del grupo B. cereus. Finalmente, para determinar el error de los clasificadores se construyó una matriz de confusión con las predicciones realizadas por los clasificadores seleccionados sobre el grupo de evaluación. Se determinó el error de los clasificadores para las especies del Clado 1 y 2, y el clasificador de clados, el cual fue inferior al 1% mientras que para el Clado 3 fue menor al 4%. A su vez, los tiempos de ejecución para la clasificación de las cepas del grupo de evaluación fueron entre 0,1 y 0,85 segundos. Estos clasificadores permitirán realizar asignaciones masivas en análisis metagenómicos, así como asignaciones de nuevos aislamientos del grupo B. cereus con mayor precisión.
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    Desarrollo de un método rápido para detectar actividad fosfodiesterasa
    (2021) Limao, Melina Daniela; Rodriguez, Fernanda
    El sistema Tat (de sus siglas en inglés Twin Arginine Translocation), permite el transporte de proteínas completamente plegadas a través de membranas citoplasmáticas bacterianas, de arqueas y membranas tilacoidales de cloroplastos. La fosfatasa alcalina PhoD, es el único sustrato conocido del sistema TatAdCd de B.subtilis. PhoD es una enzima extracitoplasmática con actividad fosfoesterasa. Para su transporte PhoD inmadura (prePhoD) contiene en su extremo N-terminal una secuencia señal de 57 residuos que una vez transportada es escindida quedando PhoD madura (mPhoD). En este trabajo, prePhoD y mPhoD recombinantes se expresaron como proteínas de fusión con el dominio SUMO. Conteniendo además una secuencia blanco Strep en el extremo N-terminal que permitió su purificación. Con el propósito de desarrollar un método para determinar de manera sencilla la presencia de prePhoD y mPhoD, se evaluó su comportamiento en geles nativos de distintos porcentajes de acrilamida y pHs. La actividad fosfomonoesterasa y fosfodiesterasa de prePhoD y mPhoD se determinó utilizando los sustratos colorimétricos pNPP y bispNPP. Además, se puso a prueba la actividad de prePhoD en detergentes, comúnmente utilizados en estudios de interacción entre los componentes del sistema Tat. Por último, se utilizó la filtración en gel analitica para seguir la actividad fosfomonoesterasa de la proteína. Resultando esto, un método novedoso y eficiente para detectar de manera específica la presencia de PhoD en la muestra.
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    Estudio bioinformático de las glutamato deshidrogenasas de alto peso molecular en Actinobacteria
    (2021) Giménez, Ariel Ignacio; Lisa, María Natalia
    Las glutamato deshidrogenasas (GDHs) son enzimas oligoméricas ubicuas que cumplen roles claves en la homeostasis de aminoácidos. La subfamilia de las glutamato deshidrogenasas de alto peso molecular (L-GDHs) incluye a las L-GDHs115, compuestas por monómeros de 115 kDa, y las L-GDHs180, compuestas por subunidades de 180 kDa. Recientemente en nuestro laboratorio se resolvió la estructura 3D de la L-GDH180 micobacteriana (mL-GDH180), la primera disponible para una L-GDH. Se encontró que mL-GDH180 adopta una organización cuaternaria única, radicalmente diferente a la de enzimas relacionadas de bajo peso molecular. Los contactos entre las subunidades de mL-GDH180 son provistos por un dominio C-terminal que adopta un nuevo plegamiento y un segmento N-terminal flexible que incluye dominios posiblemente involucrados en el monitoreo de señales metabólicas. En este trabajo se identificaron 21 L-GDHs115 y 140 L-GDH180 en 247 genomas completos y referenciados disponibles para Actinobacteria. Estas secuencias fueron agrupadas en base a la conservación de la estructura primaria y se seleccionó un conjunto de 13 L-GDHs representativas con las que se realizaron predicciones estructurales. Estos cálculos se llevaron a cabo empleando algoritmos ab initio que utilizan aprendizaje automático para inferir contactos entre residuos a partir de patrones de co-evolución. En su conjunto, los resultados obtenidos señalan que, a pesar de la baja conservación de las secuencias en las regiones N- y C-terminales de las L-GDHs, en especies distantes se mantiene la estructura terciaria de los módulos que componen los monómeros como también la ubicación de los residuos involucrados en la estabilización de la estructura cuaternaria. En consecuencia, este trabajo contribuye a sustentar la hipótesis de que las características estructurales encontradas para mL-GDH180 constituyen un tema común en la subfamilia de las L-GDHs.
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    Resistencia al tratamiento con sorafenib en el hepatocarcinoma celular: efectos de la inhibición de sirtuinas 1 y 2 en modelos in vitro
    (2021) Delprato, María Laura; Ceballos Mancini, María Paula
    La resistencia a multidrogas (MDR) disminuye la eficacia de sorafenib, un importante tratamiento de primera línea para el carcinoma hepatocelular (HCC). Las sirtuinas (SIRTs) 1 y 2 están asociadas con la progresión tumoral y la MDR. En este trabajo se trataron cultivos 2D y 3D (que mimetizan las características de los tumores in vivo) de líneas celulares de HCC con sorafenib solo o en presencia de inhibidores de SIRTs 1 y 2 (cambinol o EX-527: tratamientos combinados). Los cultivos sometidos a los tratamientos combinados mostraron una mayor disminución de la proliferación (expresión de PCNA, ciclina D1 y Ki-67), migración e invasión celular, así como un aumento de la apoptosis (actividad de caspasas-3/7) en comparación con aquellos tratados solamente con sorafenib. Debido a que la desregulación del ciclo celular y el bloqueo de la apoptosis son mecanismos asociados a la MDR, la modulación encontrada en las proteínas PCNA, ciclina D1, Ki-67 y caspasas-3/7 por cambinol y EX-527 probablemente esté cumpliendo un rol en el aumento de la sensibilidad de las líneas celulares de HCC a sorafenib. Además, EX-527 redujo la expresión de MRP3 y BCRP en las células de HCC tratadas con sorafenib. Como los transportadores ABC contribuyen a la MDR, la modulación hallada podría estar influyendo también en mejorar la respuesta de las células de HCC a sorafenib. Cabe destacar que los tratamientos continuaron siendo efectivos al pasar de los cultivos 2D a los 3D, reforzando la relevancia clínica de este estudio. Los hallazgos presentados avalan una potencial aplicación de los inhibidores de SIRTs 1 y 2 en combinación con sorafenib, para reducir la resistencia de las células de HCC al fármaco.
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    Extracción y purificación de proteínas de interés presentes en la cáscara de soja
    (2020) De Fazio, Natalia; Woitovich Valetti, Nadia
    Uno de los principales pilares de la economía argentina es la producción agrícola siendo uno de los cultivos mayoritarios el de soja [1]. En general, el procesamiento de los granos conlleva a una producción de residuos vegetales no aprovechados. En el caso de la soja, se produce la denominada cascarilla consecuencia de la ruptura primaria del grano. Éste es un residuo voluminoso sin valor. La cascarilla de soja está formada por un 40 % de celulosa, 9-10 % de hemicelulosas/xilano, 9-11 % galactomananos, 12 % de pectina, 1-3 % de lignina y 12 % de proteínas solubles [2]. Dentro de la fracción de proteínas solubles se encuentran las siguientes que, por su actividad biológica, son muy interesantes: peroxidasa, chitanasa, un grupo de proteasas aspárticas y el denominado inhibidor de proteasa tipo Bowman-Birk [3]. El objetivo principal del trabajo fue la recuperación de la enzima peroxidasa a partir de la cascarilla de soja. Para ello se realizó la extracción de las proteínas solubles presentes en dicho residuo mediante lixiviación y posteriormente se procedió a la purificación de la peroxidasa mediante precipitación con polielectrolitos. A partir de los resultados obtenidos se concluyó que el pH de trabajo se encuentra en un rango de 4,0-5,0 y que al trabajar con Eudragit L y Eudragit S se logra purificar la enzima de interés empleando concentraciones bajas de polímero, en el rango de 10-5 % P/V. Los mejores parámetros de rendimiento y factor de purificación fueron del 74 % y 2,5, respectivamente. Además, se logró concentrar 9 veces la muestra de partida reduciendo el volumen final al 10 %.