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Item type:Ítem, Caracterización funcional de genes involucrados en la síntesis de flavonoides glicosilados en plantas de maíz. Roles en la calidad nutricional y en la defensa frente al estrés(Universidad Nacional de Rosario. Facultad de Ciencias Bioquímicas y Farmacéuticas, 2025) Petrich, Julieta; Falcone Ferreyra, María Lorena; Casati, PaulaLos flavonoides son metabolitos especializados muy abundantes en plantas (más de 9.000 identificados). Su estructura básica es C6–C3–C6, formada por dos anillos aromáticos unidos a un heterociclo, y se clasifican según el grado de oxidación del anillo C. Se originan a partir de la vía de los fenilpropanoides y luego experimentan modificaciones como glicosilaciones, metilaciones, acilaciones y prenilaciones, que aumentan su diversidad y actividad biológica. Estos compuestos cumplen funciones protectoras frente a estrés abiótico y biótico, y regulan procesos del desarrollo vegetal. También actúan en la rizósfera como aleloquímicos o señales para microorganismos. En humanos y animales, los flavonoides tienen efectos antioxidantes, antiinflamatorios, anticancerígenos y moduladores hormonales, dependiendo de su clase (flavanoles, flavanonas, flavonoles, antocianinas, isoflavonas, chalconas). El maíz, uno de los cultivos de mayor relevancia, enfrenta pérdidas por eventos climáticos extremos como sequías y por plagas o enfermedades fúngicas. Por ello, el estudio y la utilización de los flavonoides presentes en el maíz constituye una estrategia natural y sostenible para mejorar la resistencia del cultivo frente a amenazas bióticas y abióticas, además de su calidad nutricional. Para el mejoramiento a largo plazo del maíz es fundamental contar con información detallada sobre las vías de síntesis de compuestos protectores como las flavonas glicosiladas. Aunque se ha caracterizado la síntesis de maicina y de flavonoides agliconas, aún existen pasos desconocidos en la biosíntesis de flavonas, flavonoles y otros flavonoides glicosilados en granos, raíces y hojas. A partir de datos previos de ARN-seq, ChIP-seq, análisis de asociación genómica y filogenia, seleccionamos dos UGTs putativas (O-glicosiltransferasas) posiblemente involucradas en estas vías: ZmUGT85W2 (Zm00001d041763) y ZmUGT707A8 (Zm0001d045254), cuyos genes son regulados por P1, el principal QTL asociado a la acumulación de maicina y otros flavonoides glicosilados. Además, una FNSII putativa (ZmCYP93G6, Zm00001d024943) presenta alta similitud con una enzima ya caracterizada (ZmCYP93G7), por lo que evaluamos si posee la misma actividad mediante ensayos in vivo en levaduras y análisis metabólicos empleando una línea mutante para esta enzima.Item type:Ítem, Estudio de la relación entre la biosíntesis de flavonoides y el metabolismo del ácido salicílico: implicancias fisiológicas y moleculares en la respuesta de defensa frente a estrés biótico(Universidad Nacional de Rosario. Facultad de Ciencias Bioquímicas y Farmacéuticas, 2025) Serra, Paola; Casati, Paula; Falcone Ferreyra, María LorenaLos flavonoides comprenden un grupo de metabolitos especializados que han cobrado particular interés debido a los múltiples roles biológicos con los que se los asocia, desempeñando funciones claves en la fisiología, el crecimiento y el desarrollo de las plantas, así como en la protección frente a diferentes tipos de estrés. Trabajos previos de nuestro grupo de trabajo lograron identificar una proteína de Arabidopsis thaliana, AtDMR6, con la capacidad de sintetizar flavonas, uno de los grupos principales de flavonoides. Sin embargo, el grupo de Zhang y col. (2017) reportó actividad salicílico hidroxilasa para la misma proteína, siendo capaz de hidroxilar la fitohormona asociada a la respuesta de defensa, ácido salicílico (AS). En este trabajo de tesis, se confirmó el carácter bifuncional de AtDMR6 mediante ensayos de actividad enzimática in vitro, proponiendo un vínculo entre la biosíntesis de flavonoides y el metabolismo del AS. Asimismo, la incubación de hojas de maíz con distintos flavonoides evidenció la capacidad de estos metabolitos para modular la expresión de genes asociados a la biosíntesis y el metabolismo del AS, mientras que análisis transcriptómicos mostraron el efecto negativo de la acumulación de la fitohormona sobre la expresión de genes biosintéticos de los flavonoides, sugiriendo una regulación antagónica entre ambas rutas metabólicas. Ensayos de infección realizados en líneas transgénicas que acumulan flavonas y en plantas mutantes de la vía biosintética de los flavonoides confirmaron un rol negativo de estos metabolitos durante la respuesta inmune, interviniendo en la respuesta de defensa salicílico-dependiente. Finalmente, se identificó y caracterizó la primera enzima salicílico hidroxilasa de maíz (ZmS5H), que también presentó actividad flavonol sintasa, reforzando la conexión entre ambas rutas metabólicas. Las plantas mutantes s5h de maíz presentaron menor susceptibilidad respecto de líneas salvajes en ensayos con el patógeno fúngico Colletotrichum graminicola, menor altura y número de hojas, y senescencia prematura, confirmado mediante la determinación de parámetros fotosintéticos, la expresión de genes asociados a la senescencia y la cuantificación de sustancias reactivas al ácido tiobarbitúrico.Item type:Ítem, Ingeniería metabólica para la producción de nuevos compuestos lipídicos en Escherichia coli(Universidad Nacional de Rosario. Facultad de Ciencias Bioquímicas y Farmacéuticas, 2025) Bracalente, Fernando; Arabolaza, Ana Lorena; Gramajo, Hugo CesarLa sociedad moderna depende en gran medida de los combustibles fósiles, como el petróleo y el gas natural, para una amplia gama de productos industriales. Sin embargo, estos recursos son finitos y su combustión contribuye significativamente al cambio climático. Los oleoquímicos, productos industriales derivados de lípidos naturales ofrecen una alternativa renovable y neutra en carbono a los petroquímicos. Estos compuestos tienen diversas aplicaciones industriales, desde jabones y lubricantes hasta biocombustibles y cosméticos, y su aplicabilidad depende de la estructura química del lípido del cual deriva. En la actualidad, la mayor parte de la industria oleoquímica depende de aceites de origen vegetal como materia prima. Si bien estos aceites tienen relativamente bajo costo de obtención, la producción de oleoquímicos a partir de aceites comestibles genera fuertes debates sociopolíticos respecto al uso de tierras cultivables y alimentos para la producción de productos químicos y biocombustibles. Además, los ácidos grasos que los componen presentan limitada diversidad estructural respecto al largo de cadena y un alto grado de instauración, otorgándoles inestabilidad térmica y oxidativa, lo que restringe su espectro de aplicaciones. En este contexto, los microorganismos emergen como una plataforma con gran potencial para la producción de oleoquímicos. Por un lado, comparados con organismos superiores como las plantas, los microorganismos poseen un ciclo de vida mucho más corto, se requiere pequeñas superficies para su crecimiento y ofrecen la posibilidad de utilizar fuentes de carbono alternativas y sustentables. Por otro lado, la ingeniería genética y de proteínas, permite manipular su metabolismo para generar lípidos con mayor diversidad estructural que puedan cubrir los distintos requerimientos de la industria. En esta tesis, se aplicaron estrategias de ingeniería metabólica y biología sintética en la bacteria Escherichia coli para modificar su vía nativa de síntesis lipídica, y establecer y optimizar rutas de biosíntesis de lípidos no-naturales. En particular, los esfuerzos se centraron en la obtención de ácidos grasos y ésteres metil-ramificados. La introducción de una cadena lateral corta en una molécula acilada con alto grado de saturación, impide el empaquetamiento a bajas temperaturas por motivos estéricos, disminuyendo su punto de fusión, mientras mantiene inalterada su estabilidad química. Ambas propiedades son deseadas, por ejemplo, en el desarrollo de biocombustibles avanzados y biolubricantes. El primer capítulo aborda la producción de ésteres de cadena larga multi-metil-ramificados, a través de la introducción de metil-ramificaciones en el motivo alcohol de dichos ésteres. Previamente, el grupo de trabajo donde se realizó esta tesis desarrolló una plataforma para la síntesis de ésteres metil-ramificados (EMR) en E. coli, mediante la introducción y adaptación del sistema de síntesis del ácido micoserósico de Mycobacterium tuberculosis. Estos EMR consistían en ácidos grasos tetra-metilramificados, esterificados con el alcohol de cadena lineal n-octanol, y demostraron tener propiedades fisicoquímicas compatibles con un potencial uso como biolubricante. En esta tesis, se amplió la diversidad estructural de estos EMR, adaptando y optimizando el sistema para la biosíntesis de EMR de alcoholes de cadena ramificada, isobutanol e isopentanol. Se implementó una vía metabólica para la síntesis endógena de estos alcoholes a partir de intermediarios del metabolismo de aminoácidos. Además, se diseñó una estrategia de co-cultivo compuesto por una cepa dadora de isobutanol y otra que lo utiliza para sintetizar los EMR. Este sistema resultó en productividades de novo similares a las obtenidas por el agregado externo de alcoholes. Por último, se evaluó la funcionalidad del co-cultivo en fermentaciones de alta densidad celular de tipo fed-batch. El segundo capítulo, tuvo a los ácidos grasos de E. coli como blanco para la introducción de metil-ramificaciones. El objetivo fue emular las propiedades del "ácido isoesteárico", un producto que consiste en una mezcla de ácidos grasos metil-ramificados (AGMR), y se considera que posee propiedades “ideales” para ser utilizado como biocombustible y biolubricante. Sin embargo, se obtiene mediante síntesis química a partir del ácido oleico presente en aceites vegetales, y su producción es costosa y limitada. Por lo tanto, este capítulo se centra en la reprogramación de la maquinaria nativa de síntesis de ácidos grasos (FAS II) de E. coli para producir AGMR. Se demostró que la FAS II posee la plasticidad necesaria para incorporar metilmalonil-ACP como unidad extensora, logrando sintetizar una mezcla compleja de ácidos grasos con grupos metilo en posiciones pares al azar (R-AGMR). Mediante la introducción de enzimas aciltransferasas para aumentar el suministro de la unidad extensora, la expresión de tioesterasas heterólogas específicas, y el cultivo en fermentaciones de alta densidad celular, se lograron incrementar significativamente los títulos alcanzados. Finalmente, el tercer capítulo se enfoca en superar las limitaciones catalíticas de la FAS II nativa mediante el diseño de sistemas de selección basados en el acoplamiento de la producción al crecimiento, con el fin de habilitar futuros procesos de evolución dirigida y aumentar los títulos de RAGMR producidos. Se exploraron dos estrategias: i) manipulación de los pools de acil-coenzima A mediante inhibición bioquímica de la acetil-CoA carboxilasa, en combinación con el control de precursores mediante el agregado exógeno de malonato/metilmalonato, buscando favorecer el uso de metilmalonil-CoA; y ii) evaluación de rol funcional de AGMR en la membrana. Mediante la construcción de cepas auxótrofas para ácidos grasos insaturados, se demostró que los AGMR (específicamente el ácido 10-metilheptadecanoico) son capaces de reemplazar a los ácidos grasos insaturados nativos, restaurando la fluidez de membrana y la viabilidad celular. Este hallazgo valida un sistema de presión selectiva para evolucionar enzimas con mayor especificidad hacia sustratos ramificados.Item type:Ítem, Rol de la acetilación en el mantenimiento y remodelación del citoesqueleto de Trypanosoma cruzi(Universidad Nacional de Rosario. Facultad de Ciencias Bioquímicas y Farmacéuticas, 2026) Martínez Peralta, Gonzálo; Alonso, Victoria Lucía; Cribb, PamelaLa enfermedad de Chagas es causada por el protozoo flagelado Trypanosoma cruzi. En los tripanosomátidos, incluido T. cruzi, el citoesqueleto subpelicular de los microtúbulos (MTs) constituye el principal determinante de la morfología y la estructura celular. Se ha postulado un mecanismo regulador para controlar la especialización de los MTs del citoesqueleto, el “código de tubulina”. Este sugiere que las modificaciones en la tubulina generan un código que especifica distintas funciones. Las modificaciones generadas pueden producirse de dos maneras: la expresión diferencial de los genes de α- y β-tubulina, que generan isotipos de tubulina; y por modificaciones postraduccionales (MPTs) de la tubulina. En T. cruzi se han identificado varias MPTs de tubulina, aunque sus funciones regulatorias aún no se comprenden completamente. Entre ellas, la acetilación de la α-tubulina en la lisina 40 (K40) ha sido descripta como una de las más conservadas y funcionalmente relevantes, relacionada con la estabilidad de los MTs, la morfogénesis y los procesos de diferenciación celular. No obstante, su papel específico en T. cruzi no había sido caracterizado en detalle. Este trabajo busca acrecentar el conocimiento acerca de los procesos de regulación y señalización mediados por acetilación en la remodelación y el mantenimiento del citoesqueleto en T. cruzi. Para explorar esto, en primer lugar, se analizó la función de la acetilación de α-tubulina en la dinámica del citoesqueleto mediante mutaciones puntuales en la K40 de dicha proteína. Se confirmó que la acetilación de la K40 juega un rol importante en la estabilidad de los MTs y, por lo tanto, en la morfología de T. cruzi. A fin de complementar este análisis funcional, se llevó a cabo un estudio proteómico en el cual se identificaron múltiples MPTs en α- y β-tubulina, no reportadas previamente en T. cruzi. Este mapeo constituye el punto de partida para la caracterización del código de tubulina del parásito, fundamental para comprender cómo las distintas modificaciones coordinan la estabilidad y funciones de los MTs. Por otro lado, se estudió el efecto de la pérdida de la acetiltransferasa TcATAT, enzima responsable de acetilar la K40 de la α-tubulina, a través de la construcción y caracterización de una línea knockout (KO) generada mediante el sistema CRISPR/Cas9. Los resultados refuerzan la idea de que la acetiltransferasa es esencial para T. cruzi, ya que los parásitos presentaron fenotipos con morfologías aberrantes, una menor tasa de duplicación y una capacidad infectiva disminuida. Además, la ausencia completa de TcATAT no es viable a largo plazo para la supervivencia del parásito. Por último, se realizó un estudio de interactómica mediante el sistema TurboID con el fin de encontrar proteínas interactoras de TcATAT y de TcBDF3 (proteína lectora de α-tubulina acetilada), y así identificar posibles interactores vinculados al citoesqueleto. Los resultados consolidan el uso de TurboID como herramienta para el mapeo de interacciones en tripanosomátidos y abren nuevas perspectivas para investigar los complejos proteicos implicados en la regulación del citoesqueleto y la dinámica de los MTs. Los resultados obtenidos en esta tesis demuestran que la acetilación de α-tubulina en K40 y la actividad de TcATAT constituyen componentes centrales de la regulación del citoesqueleto en T. cruzi. Las mutaciones en K40 alteran la estabilidad de los MTs y la morfología celular, mientras que la pérdida de TcATAT genera defectos severos en la división, la morfología y la infectividad, evidenciando que la acetilación es crítica para la supervivencia del parásito.Item type:Ítem, Trichoderma como herramienta biotecnológica(Universidad Nacional de Rosario. Facultad de Ciencias Bioquímicas y Farmacéuticas, 2026) Nunes Calumby, Rodrigo José; Campos Bermúdez, Valeria AlinaEl género Trichoderma ha sido ampliamente estudiado por su capacidad para interactuar con plantas y otros microorganismos, así como por su potencial para limitar el desarrollo de patógenos en distintos sistemas biológicos. En este contexto, Trichoderma se reconoce como una fuente relevante de moléculas fúngicas funcionales, entre ellas metabolitos secundarios y proteínas secretadas, como las hidrofobinas (HFBs). En particular, especies del complejo Trichoderma harzianum, entre ellas T. afroharzianum, han adquirido relevancia como herramientas biotecnológicas debido a la diversidad de mecanismos que sustentan sus efectos beneficiosos sobre el crecimiento vegetal y el control de enfermedades. Sobre esta base, la presente tesis tuvo como objetivo evaluar el potencial de cepas nativas de T. afroharzianum (10BR1 y UEPA AR12), aisladas del suelo en Argentina, como herramienta biotecnológica desde una perspectiva funcional, química y biológica. El trabajo abordó distintas dimensiones del potencial biológico de estas cepas, considerando la producción de metabolitos secundarios y su actividad biológica, la modulación del metabolismo fúngico en respuesta a señales externas, y el rol funcional de proteínas específicas en la interacción hongo-planta. En una primera etapa, se caracterizó el potencial bioactivo de los metabolitos secundarios producidos por ambas cepas de T. afroharzianum. Los ensayos de enfrentamiento in vitro demostraron una marcada capacidad antagonista frente a fitopatógenos, tanto por contacto directo como mediante la emisión de compuestos orgánicos volátiles. Asimismo, los extractos crudos obtenidos de los sobrenadantes de cultivo exhibieron una actividad antifúngica consistente frente a patógenos de relevancia agrícola, evaluada mediante ensayos de difusión en agar, medio suplementado con extracto y microdilución en caldo, con valores de concentración inhibitoria mínima (CIM) comprendidos entre 0,125 y 5 mg/mL. Además, los extractos crudos promovieron el crecimiento vegetal y redujeron los síntomas de enfermedad en distintos modelos vegetales. De manera complementaria, los extractos mostraron actividad antimicrobiana frente a patógenos de relevancia clínica, con un espectro que incluyó bacterias Gram positivas y Gram negativas, así como diferentes especies del género Candida, junto con actividades antibiofilm y antioxidante, ampliando el alcance funcional de los metabolitos evaluados más allá del contexto agrícola. La caracterización química, realizada mediante TLC, GC-MS y HPLC-MS, permitió establecer perfiles metabólicos diferenciales entre cepas e identificar metabolitos previamente reportados con actividad biológica, aportando sustento químico a los efectos observados. En concordancia, el análisis genómico evidenció una elevada diversidad de clústeres biosintéticos, principalmente de policétido sintasas (PKS) y péptido no ribosomales sintasas (NRPS), sin detectarse rutas completas asociadas a tricotecenos, micotoxinas frecuentemente vinculadas a riesgos toxicológicos, bajo las condiciones evaluadas. En una segunda etapa, se evaluó el uso de un extracto vegetal de Larrea nitida como modulador del metabolismo de T. afroharzianum. La exposición al extracto indujo cambios fisiológicos y metabólicos en ambas cepas, reflejados en una mayor capacidad para inhibir fitopatógenos y en respuestas asociadas a la promoción del crecimiento vegetal en soja y tomate bajo distintas condiciones experimentales. En concordancia, los análisis cromatográficos evidenciaron una reconfiguración del perfil metabólico fúngico asociada a la activación con el extracto vegetal. Finalmente, se abordó el estudio de las HFBs, proteínas fúngicas de bajo peso molecular con relevancia funcional en la comunicación hongo-planta. Se analizó su expresión génica a lo largo del desarrollo fúngico, se desarrolló una estrategia de extracción a partir de biomasa cultivada en medio sólido y se confirmó su identidad mediante espectrometría de masas. Los ensayos funcionales mostraron que la aplicación de HFBs como bioinoculantes puede promover el crecimiento vegetal y ejercer un efecto preventivo de la infección frente a Botrytis cinerea, con respuestas dependientes de la cepa, la dosis y el modo de aplicación. Los resultados obtenidos evidencian el potencial de T. afroharzianum como una fuente versátil de moléculas bioactivas con aplicaciones que trascienden el ámbito agrícola. El abordaje integrado de metabolitos secundarios, estrategias de modulación metabólica y proteínas funcionales como las HFBs aporta bases conceptuales y metodológicas para el desarrollo de herramientas biotecnológicas sustentables y para futuras investigaciones orientadas a optimizar su aplicación en distintos contextos biológicos.