(FBIOyF) Posgrado - Tesis

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Embargo
Estudio y aplicación de lodos biológicos de origen industrial para la biorremediación de hidrocarburos: análisis de las comunidades microbianas y de los bioprocesos degradativos involucrados en la eliminación del diésel
(2024) Olivera, Camila; Salvatierra, Lucas Matías; Pérez, Leonardo Martín
A pesar del crecimiento de las energías renovables, el petróleo y el gas natural continúan siendo las principales fuentes de energía a nivel global, representando cerca del 80% del consumo total. Las actividades asociadas a su extracción, refinación y transporte generan grandes volúmenes de residuos contaminantes, siendo los hidrocarburos (HC) una de las principales causas de contaminación de suelos y aguas. En particular, el diésel representa un contaminante frecuente debido a su uso extendido en múltiples sectores. Frente a esta problemática, la biorremediación —un proceso basado en el uso del metabolismo microbiano para degradar contaminantes— se posiciona como una alternativa eficiente, económica y sustentable frente a los métodos físico-químicos tradicionales. Esta puede implementarse mediante bioestimulación o bioaumentación, siendo esta última especialmente útil cuando las comunidades microbianas nativas no presentan capacidad degradadora suficiente. En esta Tesis se estudió la aplicabilidad de lodos residuales de alta carga bacteriológica, provenientes de digestores anaeróbicos, para la biorremediación de hidrocarburos del diésel. Precedidos por una detallada explicación de la metodología experimental, los resultados obtenidos permitieron analizar cambios en la eficiencia de biodegradación, como así también de la actividad metabólica y estructura de la comunidad microbiana bajo distintas condiciones operativas, origen del inóculo y sistema de escalado. Durante los años de trabajo de doctorado se destinó un gran esfuerzo al diseño y mejora de los sistemas experimentales, al mismo tiempo que a la incorporación de herramientas de química analítica, microbiología, biología molecular y bioinformática. Con un primer estudio que buscó evaluar la capacidad del consorcio microbiano del lodo para degradar diésel comercial en medio líquido. Los resultados fueron satisfactorios, respaldando la formulación de las hipótesis y la presentación del plan de Tesis doctoral. La separación entre la fase acuosa (medio con microorganismos) y orgánica (diésel comercial en fase libre) obligó a un replanteo experimental. Para sortear este efecto, se comenzaron a realizar ensayos en peceras de unos 3 litros, llenas de arena saturada de humedad por el agregado del lodo, pero sin líquido libre en la superficie. Estos cambios incrementaron notablemente la eficiencia de degradación. El resultado de estas modificaciones, luego de varios intentos e iteraciones, fueron plasmados en la construcción de sistemas a escala piloto de aproximadamente 200 litros. Paralelamente, y para poder estudiar simultáneamente múltiples variables, se procedió a reducir la escala, llevándola nuevamente al laboratorio. Se emplearon así tubos estériles de polipropileno de 50 ml, rellenos de arena sin saturación de fase líquida libre. El uso de arena permitió resultados semejantes con una manipulación mucho más simple. Para poder llevar adelante mediciones periódicas, cada determinación se llevó a cabo a partir del contenido total de un tubo reactor. De esta forma, una misma condición bajo estudio involucró muchas unidades individuales preparadas de idéntica manera. Al momento de realizar un análisis, un tubo del set era retirado al azar y utilizado para tal fin, mientras sus idénticos continuaban el ensayo hasta que les tocase su turno. Todo este recorrido, permitió obtener un sistema experimental robusto y óptimo para el seguimiento de la degradación de los hidrocarburos bajo distintas condiciones y en forma simultánea, resolviendo la complejidad del muestreo estadístico de un gran reactor voluminoso. Estos sistemas permitieron, entre otras cosas, verificar la capacidad de degradación de diésel de 5 inóculos provenientes de diversos biodigestores. La caracterización de la estructura de la comunidad bacteriana y sus modificaciones brindaron un remarcable fortalecimiento de las discusiones y conclusiones obtenidas.
Embargo
Aislamiento e identificación de biocontroladores autóctonos de cepas fitopatógenas
(2024) Santone, Antonella; Campos Bermúdez, Valeria Alina; Spampinato, Claudia P.
El uso de los microorganismos como agentes de control biológico (ACBs) para prevenir o controlar enfermedades causadas por la infección de patógenos en las plantas cultivadas es una alternativa sustentable que ha mostrado ser efectiva en un amplio número de especies vegetales. Los mecanismos de acción de dichos microorganismos se basan en la competencia por los nutrientes o el espacio, la producción de antibióticos o la activación de mecanismos de resistencia en la planta. Ampliar el conocimiento de los modos de acción de diferentes hongos y bacterias que presentan efecto antagónico sobre otros microorganismos permitiría generar productos de control biológico (CB) más eficientes para proteger a las especies de interés agronómico contra las enfermedades producidas por los fitopatógenos. Asimismo, existen ACBs que poseen la capacidad de aumentar la biodisponibilidad de nutrientes del suelo, conduciendo a un incremento en la biomasa de la planta y en el rendimiento del cultivo. Por lo tanto, la aplicación de microorganismos con capacidad para actuar como biocontroladores y al mismo tiempo, para promover el crecimiento vegetal (PGP, del inglés, plant growth promotor) representaría una alternativa eficiente al uso de agroquímicos. Las especies del género Trichoderma se han estudiado ampliamente como microorganismos beneficiosos para las plantas y representan las especies de hongos más utilizadas para el CB y para la PGP. Considerando la diversidad de los mecanismos de acción de Trichoderma y sus diferentes roles ecológicos, es de interés en este trabajo de tesis evaluar el efecto protector inducido por distintas cepas y especies de Trichoderma frente a fitopatógenos con diferentes estrategias de ataque y estudiar la capacidad de PGP y los compuestos involucrados. El presente trabajo se enfoca, por un lado, al estudio de la respuesta de defensa desencadenada en Arabidopsis thaliana a partir de la colonización de las raíces por Trichoderma. Para ello, se evaluó la protección contra el ataque de un patógeno biotrófico como es Pseudomonas syringae y contra uno de tipo necrotrófico como es Botrytis cinerea, mediante el análisis de la expresión diferencial de genes de defensa durante el priming en Arabidopsis thaliana. Los resultados obtenidos demuestran que Trichoderma activaría tanto las vías del ácido salicílico (SA) como del ácido jasmónico (JA) y del etileno (ET), desencadenando así una respuesta de defensa en A. thaliana contra patógenos con diferentes estilos de vida. Por otro lado, se llevó a cabo una selección de cepas nativas mediante distintos ensayos de CB y de PGP y se evaluó la interacción de dichas cepas con dos especies vegetales de interés agrícola: soja (Glycine max (L.) Merrill) y tomate (Solanum lycopersicum) a través de ensayos in planta. Se encontró una cepa nativa de Trichoderma con capacidad de proteger al cultivo de soja contra el cancro del tallo, enfermedad causada por el hongo Diaporthe phaseolorum y de promover el crecimiento y el rendimiento del tomate. Estos resultados comprenden las bases para el desarrollo futuro de productos bioactivos o bioinoculantes a partir de esta cepa de Trichoderma, lo que representaría una alternativa sustentable a la aplicación de agroquímicos.
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Sistemas micelares biocompatibles formados por surfactantes sintéticos y biológicos: formulación, análisis y aplicaciones
(2024) Martini, Georgina; Pellegrini Malpiedi, Luciana; Bustillo, Soledad
El presente trabajo de tesis se centró en el desarrollo y caracterización fisicoquímica de nuevas formulaciones de micelas mixtas biocompatibles, formadas por biosurfactantes (BS) y surfactantes (SF) sintéticos no iónicos. Inicialmente, se estudiaron las propiedades fisicoquímicas y aplicaciones de un extracto de BS del tipo lipopéptidos (LP) producido por Pseudomonas syringae pv. tabaci (PTA) en un biorreactor con columna de fraccionamiento de espumas. Tras 14 h de fermentación, se obtuvo un índice de emulsificación (IE) del 63% y una concentración de BS de 550 mg/L. La concentración micelar crítica (CMC) fue de 1.844,68 mg/L, reduciendo la tensión superficial a 30,07 mN/m. Al estudiar el efecto del pH en soluciones acuosas de citrato de sodio (NaCit), se observó una disminución significativa en la CMC, la cual disminuyó hasta 863,20 mg/L en pH 5,00 y hasta 341,98 mg/L en pH 7,00. El diámetro hidrodinámico (Dh) de los autoensamblados formados fue de 87,63 nm en agua, incrementando su valor hasta 173 nm en presencia de NaCit. Las emulsiones formadas con hidrocarburos mostraron una estabilidad superior al 90% después de 24 horas. Posteriormente, se abordó la formulación y caracterización fisicoquímica de sistemas micelares mixtos combinando surfactantes sintéticos (SF) como Tergitol 15-S-7 (Tg7) y Genapol X-080 (GX) con biosurfactantes (BS) como ramnolípidos (RL) comerciales y extracto de LP producido en nuestro laboratorio. Se encontró que la CMC de Tg7 y GX en agua fue de 18,23 mg/L y 21,14 mg/L, respectivamente. Ambos valores disminuyeron en presencia de aniones comsmotrópicos como el NaCit. Al combinar los SF con BS, se observó sinergia en los sistemas con LP, mientras que los sistemas con RL mostraron interacciones desfavorables. Se determinó la concentración necesaria para reducir la tensión superficial en 20 mN/m (C20), con valores de 13,75 mg/L para Tg7 y 10,55 mg/L para GX en agua, mejorando en medios con NaCit y en sistemas con LP. El análisis hidrodinámico mostró un aumento en el Dh de las micelas con el pH y la presencia de NaCit, indicando la formación de estructuras más asimétricas en ambientes de alta fuerza iónica. En cuanto al potencial zeta (ζ), la adición de RL aumentó la carga negativa en pH 7,00. En cambio, los LP no modificaron significativamente el ζ. Finalmente, las curvas de coexistencia para la separación de fases revelaron que los sistemas en NaCit a pH 7,00 alcanzaron las temperaturas de separación de fase más bajas, lo que, junto con la presencia de LP, favoreció la separación de fases a menores temperaturas, lo que puede ser útil en procesos de extracción de biomoléculas y aplicaciones industriales sostenibles. En una tercera etapa, se exploró el uso de sistemas micelares de dos fases acuosas (SMDFA) para la extracción de biomoléculas, específicamente tocoferoles (TF) y el colorante azul cibacron (AC), empleando combinaciones de SF sintéticos (Tg7 y GX) y BS (RL y LP). Los resultados mostraron que los valores de coeficiente de reparto (Kr) para AC en SMDFA sin BS fueron mayores a 5, con preferencia por la fase superior rica en micelas. La adición de RL y LP mostró efectos distintos en la extracción de AC, siendo el extracto de LP el que presentó menor eficacia, probablemente debido a su composición química. Un diseño factorial 2³ identificó las mejores condiciones extractivas para los TF, que consistieron en utilizar Tg7 al 9% p/p y RL al 0,25% p/p en NaCit 100 mM a pH 5,00 y 56°C, logrando una recuperación casi completa de TF en la fase superior, con alta actividad antioxidante. Además, se compararon dos metodologías de recuperación de TF de desodorizado de soja: saponificación modificada seguida de extracción con SMDFA y saponificación convencional seguida de extracción con solventes. La saponificación modificada seguida de extracción con SMDFA superó al método convencional, alcanzando un índice de acidez de 1,44% y una recuperación de γ-tocoferol del 91,98% en la fase superior micelar. Además, se obtuvo una alta eficiencia de asociación (94% para α-tocoferol), sugiriendo que los SMDFA también pueden mejorar la estabilidad y biodisponibilidad de los TF. Finalmente, se evaluó la citotoxicidad y actividad antimicrobiana de los SF Tg7, GX y el extracto de LP de PTA en células eucariotas y bacterianas. En células C2C12, Tg7 y GX demostraron baja citotoxicidad a concentraciones menores de 0,05 mg/mL, mientras que el extracto LP no fue citotóxico hasta 5 mg/mL. En mezclas de surfactantes, el efecto citotóxico se atribuyó a las mayores concentraciones de Tg7 y GX. Además, se observó que el extracto LP indujo necrosis celular, confirmado mediante pruebas de morfología y liberación de LDH. En cuanto a su potencial antitumoral, el LP inhibió en un 58% la adhesión de células tumorales LM3 y en un 37% su migración, sugiriendo que puede obstaculizar la propagación de células cancerígenas. Los ensayos antimicrobianos mostraron inhibición significativa de Staphylococcus aureus con el extracto LP y otros surfactantes, mientras que no hubo actividad inhibitoria contra Escherichia coli. Estos resultados evidencian la baja citotoxicidad y el potencial del extracto LP como agente antimicrobiano y antitumoral en distintas aplicaciones biotecnológicas.
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Desarrollo de compuestos de alto valor agregado a partir de biomasa residual
(2024) Crespo Guridi, Carmela Ariadna; Mangione, María Inés
La química orgánica sintética representa una herramienta fundamental para el desarrollo de nuevos productos químicos. En las últimas décadas, con la producción de compuestos quirales enantioméricamente puros, se ha puesto en evidencia los beneficios de emplear los carbohidratos, ya que constituyen materiales de partida muy versátiles para la construcción enantioespecífica de estructuras complejas con aplicaciones químicas, biológicas e industriales. Levoglucosenona es un compuesto perteneciente al grupo de derivados quirales de carbohidratos, y ha sido empleada como sintón quiral para la síntesis de una amplia variedad de productos. La misma se obtiene de la pirólisis de material celulósico y posterior destilación a presión reducida del bio-aceite obtenido, y constituye una unidad estructural enantioméricamente pura con un gran potencial para su transformación en diversos derivados quirales. En este trabajo de Tesis, levoglucosenona fue el material de partida propuesto para la construcción del esqueleto carbonado de un potencial agente herbicida, herbarumin I, y para la síntesis de otros derivados estructurales como potenciales sustratos con actividad biológica. En el Capítulo I se describe la optimización lograda de la secuencia sintética hacia el intermediario clave tri-O-acetil-D-alal a partir de levoglucosenona, la cual ya había sido patentada por nuestro grupo de investigación. Dicha secuencia pudo optimizarse con la disminución de tiempos de reacción, cantidades de solventes y reactivos tóxicos, lográndose un aporte significativo ambiental desde la óptica de la Química Verde. En el Capítulo II se describen los avances logrados en la obtención del esqueleto carbonado de herbarumin I, alcanzando intermediarios avanzados para la secuencia de síntesis propuesta. La obtención de estos intermediarios forma parte de un intensivo trabajo de investigación, ya que han demostrado comportamientos químicos inesperados, lo cual constituye un gran aporte al conocimiento científico de interés teórico y experimental para la síntesis de la molécula objetivo. En el Capítulo III se presentan derivados de levoglucosenona que fueron evaluados de acuerdo a su actividad biológica, mediante distintos trabajos en colaboración, encontrándose potenciales agentes herbicidas, insecticidas y fungicidas. Los resultados presentados en este trabajo de Tesis Doctoral aportan datos experimentales de gran utilidad en la obtención de compuestos enantioméricamente puros de alto valor agregado, así como también un notable avance en la secuencia de síntesis para la obtención de herbarumin I desde tri-O-acetil-D-alal.
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Biorremediación de metales pesados en aguas y efluentes: bioprospección y generación de algas genéticamente modificadas
(2024) Burdisso, María Lucía; Pagani, María Ayelén; Gómez Casati, Diego Fabián
Las actividades humanas liberan metales al ambiente, y los métodos fisicoquímicos para separarlos presentan numerosas desventajas. Las algas son útiles debido a su rápido crecimiento, bajo costo y capacidad biorremediadora. Ésta última podría mejorarse sobreexpresando proteínas de unión a metales como las metalotioneinas (MTs) o las frataxinas. Hasta la fecha, se han identificado numerosas MTs en plantas, no así en algas. Los objetivos de esta tesis fueron generar y caracterizar microalgas con el fin de mejorar su capacidad quelante, e identificar nuevas secuencias de MTs de algas con potencial para la biorremediación. Se generaron líneas transgénicas de Chlamydomonas reinhardtii que expresan la MT de soja GmMT3 (CrGmMT3), la frataxina endógena (CrFH), y la frataxina de maíz en citosol (CrZmFH2) y en mitocondria (CrCoxZmFH2). Mediante ICP-MS, se observó que las líneas fueron capaces de acumular mayores cantidades de Cu y Zn comparadas con la cepa salvaje y fueron más eficientes en la acumulación de Fe, Zn, Ni, Mn y Cr provenientes de un lodo de desecho industrial. Los consorcios de las microalgas generadas mejoraron la eficiencia de biorremediación de las microalgas individuales, especialmente el consorcio V (CrGmMT3, CrZmFH2 y CrCoxZmFH2). Adicionalmente, las algas fueron inmovilizadas en esferas de alginato para facilitar el escalado. En general, la inmovilización mejoró la eficiencia biorremediadora y protegió a la biomasa. Con el objetivo de encontrar nuevas MTs con características útiles para ser usadas en biorremediación, se realizaron análisis bioinformáticos y se identificaron 124 nuevas posibles secuencias de MTs en los tres grupos de algas (Chlorophytas, Rodophytas y Ochrophytas). Estas secuencias se caracterizaron mediante redes de similitudes y alineamientos de secuencias, observándose heterogeneidad en su disposición, y patrones de distribucion de cisteínas que en general no se asemejan a los de las plantas, ni a otras MTs ya caracterizadas. Las MTs de Chlorophytas presentaron mayor heterogeneidad en sus secuencias que las de Rodophytas y Ochrophytas, que mostraron mayor similitud entre sí. En base a la prevalencia de Cys en las secuencias se seleccionaron cuatro posibles MTs de algas, correspondientes a Ectocarpus siliculosus (EsilMT1 y EsilMT2), a Auxenochlorella prototheicoides (AproMT) y a Galdieria sulphuraria (GsulMT), y se evaluaron sus preferencias y capacidad de unión a metales y resistencia a un agente pro-oxidante (H2O2). Se sintetizaron los complejos metal-MT in vivo en presencia de iones metálicos de estas proteínas y se caracterizaron por ICP-AES y ESI-MS. Los resultados mostraron que una mayor cantidad de residuos Cys aumenta la cantidad de iones Zn, Cd o Cu que pueden unir las proteínas. EsilMT1 demostró tener alta afinidad por Zn y Cu, afinidad intermedia por Cd y menor resistencia al H2O2 que las otras MTs. EsilMT2, presentó baja afinidad a metales, pero confirió resistencia al H2O2. AproMT, exhibió mayor afinidad por Zn e intermedia para Cd y Cu, aunque favoreció el crecimiento en presencia de éstos últimos o de H2O2. GsulMT mostró alta afinidad por Zn y Cd, creció bien en medios ricos en dichos metales o en presencia de H2O2, pero con baja afinidad por Cu y sin ventajas de crecimiento en su presencia. Esta tesis subraya el potencial de las microalgas, y las MTs de algas como estrategias prometedoras para la biorremediación de aguas contaminadas con metales.
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Análisis genómico funcional de bacterias
(2024) Torres Manno, Mariano A.; Espariz, Martín; Blancato, Víctor Sebastián
El presente estudio busca establecer un marco teórico para la clasificación racional y efectiva de cepas del grupo Lactococcus lactis, así como desarrollar una herramienta bioinformática destinada a la minería génica y el perfilamiento funcional de cepas bacterianas. Adicionalmente, se pretende diseñar un sistema de clasificación integral para las genomoespecies del grupo Bacillus cereus, integrando datos moleculares, ecológicos y evolutivos. Por último, se utilizarán datos de secuenciación metagenómica para inferir rasgos funcionales (positivos y negativos) asociados al microbioma del rumen.
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Caracterización genética y molecular de los efectores TAL PthA de Xanthomonas citri subsp. citri AT, cepa supresora de la cancrosis bacteriana de los cítricos
(2024) Uviedo, Facundo; Marano, María Rosa; Roeschlin, Roxana Andrea; https://orcid.org/0000-0003-0437-589X
Resultados preliminares demuestran que los genes pthA de la cepa X. citri AT presentan un patrón polimórfico diferente al de la cepa de referencia X. citri 306, lo que sugiere su posible implicancia en la patogenicidad específica del hospedador cítrico analizado (Siciliano, 2009; Roeschlin, 2015). La enzima de restricción BamHI permite separar los diferentes genes de pthA (Al‐ Saadi y col., 2007; Shiotani y col., 2007) y así obtener un perfil de bandas de ADN correspondiente a los diferentes genes pthA codificados por los plásmidos de las cepas X. citri AT y X. citri 306. Los ensayos de Southern Blot, utilizando una sonda específica para pthA permitieron identificar los diferentes alelos de pthA (Siciliano, 2009). Resultó interesante observar que la cepa de referencia X. citri 306 presenta un fragmento de 3,3 kb que correspondería al gen pthA4 (da Silva y col., 2002; Al‐Saadi y col., 2007; Shiotani y col., 2007), mientras que en la cepa X. citri AT se identificó un fragmento de menor tamaño, aproximadamente 2,3 kb correspondiente a un nuevo alelo presente en esta variante. Además, se detectó un fragmento diferencial de 3,8 kb en X. citri AT. En el presente Capítulo, se propone caracterizar funcionalmente los genes de pthA identificados en la cepa X. citri AT, los cuales difieren de sus homólogos en X. citri 306. Para ello, se plantearon los siguientes objetivos: i) Evaluar la capacidad del efector TAL PthA4 en restaurar la virulencia de X. citri AT en C. limon y C. sinensis; ii) Complementar cepas mutantes de X. citri 306 en los genes pthA con los diferentes plásmidos recombinantes conteniendo los efectores TAL de X. citri AT; iii) Verificar la expresión de los PthA mediante Western Blot utilizando anticuerpos monoclonales anti-3xFLAG; iv) Evaluar el comportamiento de las cepas complementadas con los diferentes efectores TAL de X. citri A T a través de ensayos de patogenicidad en Citrus spp. utilizando dos métodos de inoculación: infiltración e hisopado.
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Rol de la transducción de señales y de los mecanismos endocítico-degradativos en colestasis: Su modulación por el agente terapéutico ácido ursodesoxicólico
(2024) Medeot, Anabela Carolina; Roma, Marcelo Gabriel; Crocenzi, Fernando A.
El estradiol 17β-D-glucurónido (E217G) induce colestasis al desencadenar la endocitosis y una posterior retención intracelular de los transportadores canaliculares Bsep y Mrp2, a través de la activación de las vías de señalización cPKC y PI3K/Akt, respectivamente. La colestasis del embarazo, se asocia al aumento de los niveles hepatocelulares de E217G. El tratamiento de primera línea para esta patología es el ácido ursodesoxicólico. Dado que los mecanismos de acción protectores de AUDC en la colestasis inducida por E217G no han sido elucidados, en este trabajo de tesis evaluamos si el tauroursodesoxicolato (TUDC), principal metabolito activo de UDCA, previene la endocitosis de transportadores canaliculares al contrarrestar la activación cPKC y PI3K/Akt inducida por E217G. Para ello, estudiamos, en primera instancia, el efecto de TUDC en las fallas secretoras de los transportadores Bsep y Mrp2 producidas por E217G en los modelos de duplas aisladas de hepatocitos de rata e hígado aislado y perfundido de rata. En ambos modelos, encontramos que TUDC previene las alteraciones secretoras producidas tanto sobre Bsep como sobre Mrp2. Además, en el modelo de hígado aislado y perfundido de rata, evaluamos el efecto de TUDC sobre la disminución del flujo biliar producido por el estrógeno, encontrando que TUDC mejora dicho parámetro. En este último modelo, también realizamos estudios de la localización de los transportadores canaliculares de interés por inmunotinción seguido de microscopía confocal, lo cual reveló que TUDC previene la desinserción y deslocalización de ambos transportadores. Por otro lado, para estudiar las vías que participan en este mecanismo protector, mediante la utilización del modelo de hepatocitos aislados de rata y subsiguiente análisis por Western blot, pudimos determinar que TUDC previene el encendido de las vías de señalización cPKC y PI3K, evitando así que los transportadores permanezcan internalizados por acción de E217G. También demostramos que el mecanismo por el cual TUDC inhibe el encendido de dichas vías de señalización requiere del aumento de Ca2+ citosólico, la formación del complejo Ca2+-CaM y la subsiguiente activación de la CaMKII. Por otro lado, en este trabajo de tesis, indagamos sobre el destino post-endocítico de los transportadores canaliculares endocitados ante un insulto colestásico sostenido por tiempos prolongados. Observamos, utilizando el modelo de hepatocitos en sándwich de colágeno, que el transportador canalicular Mrp2, pero no Bsep, es degradado vía proteosomal a las 24 h de tratamiento con los agentes colestásicos E217G y taurolitocolato (TLC), viéndose afectadas tanto su localización como su función de transporte. Estas alteraciones fueron prevenidas cuando se cotrataron los hepatocitos con TUDC y E217G. Estos hallazgos aportan conocimientos sobre los patomecanismos colestásicos del E217G y los mecanismos por el cual el TUDC actúa como agente anticolestásico en patologías colestásicas provocadas por el compuesto estrogénico. Esto ayuda a la comprensión de los mecanismos anticolestásicos del TUDC, y permite contar con información novel acerca de los nuevos blancos terapéuticos en la colestasis por estrógenos, de potencial utilidad para el desarrollo de fármacos alternativos al TUDC, con acción terapéutica efectiva en mujeres con colestasis del embarazo no respondedoras al tratamiento convencional con el ácido ursodesoxicólico.
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Función de los cuádruplex de guanina en la regulación post-transcripcional de la expresión génica
(2024) Bezzi, Georgina; Armas, Pablo; https://orcid.org/0000-0002-2218-9364
Este trabajo de Tesis Doctoral se centra en los cuádruplex de guanina (G4), estructuras no canónicas del ADN y ARN que afectan todos los procesos que involucran a estas moléculas. Los G4 formados en ARNm se han descripto como reguladores de la traducción con diferentes funciones dependiendo de las regiones en las que se encuentren. En este trabajo se propuso investigar la función de variantes genéticas en la regulación post-transcripcional de genes relevantes para enfermedades humanas (principalmente oncogenes) dependientes de G4 y estudiar la función de los G4 en la regulación post-transcripcional de genes con funciones en el desarrollo embrionario. Mediante herramientas bioinformáticas y espectroscópicas estudiamos la presencia de variantes de un solo nucleótido (SNV) en las secuencias formadoras de G4 (SNV-sG4) previamente informadas como reguladoras de la traducción en un grupo de oncogenes. Demostramos que algunas SNV afectan la formación y estabilidad de los G4, lo que podría influir en la expresión génica y predisponer a enfermedades. Experimentos de clonado de las sG4 de genes específicos en plásmidos con genes reporteros y transfección en células HEK-293 confirmaron que las SNV alteran los niveles de traducción, lo que sugiere su implicación en la regulación post-transcripcional y refuerza su potencial como objetivos terapéuticos en el tratamiento de enfermedades humanas. Por otro lado, se utilizó una novedosa estrategia bioinformática para identificar nuevas secuencias con potencial de formar G4 (PG4) conservadas funcionalmente en H. sapiens, M. musculus y D. rerio en genes asociados al desarrollo embrionario. Utilizando métodos biofísicos y ensayos de genes reporteros en células en cultivo, determinamos la formación de G4 y verificamos su capacidad de regular la traducción. Las funciones de dos de los G4 identificados fueron ensayadas in vivo el pez cebra mediante la microinyección en embriones de ARNm que contienen las PG4 en estudio controlando al gen reportero GFP sintetizados con GTP (capaces de formar G4) o con 7-deaza-GTP (incapaces de formar G4). Además, se produjo la disrupción específica de los G4 fusionados a GFP o endógenos mediante microinyección de oligonucleótidos antisentido (ASO) complementarios a las PG4. Los resultados demostraron que los G4 regulan la traducción in vivo y pueden actuar como elementos conservados de ajuste fino de la expresión génica durante el desarrollo embrionario. Durante el inicio de este trabajo de doctorado, la pandemia de COVID-19 causada por el SARS-CoV-2 nos desafió a sumar una nueva línea de investigación. Utilizando herramientas bioinformáticas, encontramos PG4 dentro del genoma de ARN del SARS-CoV-2, tanto en la hebra de sentido positivo como negativo (+/-gRNA), conservadas en betacoronavirus relacionados. Utilizando técnicas biofísicas y moleculares confirmamos la formación de cuatro G4, dos de los cuales fueron los primeros caracterizados experimentalmente en el -gRNA. Además, determinamos que CNBP, la proteína humana que se une con mayor abundancia al +gRNA del SARS-CoV-2, reconoce y promueve el desplegamiento de los G4 identificados en ambas hebras del ARN viral, sugiriendo su papel en la regulación de la expresión génica y replicación viral. Estos hallazgos señalan a los G4 como posibles blancos en el desarrollo de terapias antivirales.
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Caracterización de una fosfolipasa C de Bacillus cereus con aplicación industrial en el desgomado de aceite
(2024) Di Nardo, Luisina; Rasia, Rodolfo M.
El propósito principal de este proyecto es profundizar en el conocimiento sobre la fosfolipasa C con especificidad por fosfatidilcolina de Bacillus cereus (BcPLC), con el objetivo de facilitar el diseño racional de variantes que presenten una mayor termoestabilidad y que puedan adaptarse mejor a las condiciones que impone el uso industrial.
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Modulación de transportadores ABC hepáticos por prolactina en un modelo murino de obesidad e insulino-resistencia
(2024) Sedlmeier, María Guillermina; Francés, Daniel Eleazar; Ronco, María Teresa
El hígado es el órgano más importante en la metabolización de compuestos endógenos y exógenos. Los mismos son captados por los transportadores de la membrana basolateral del hepatocito, sufren luego reacciones de óxido-reducción e hidroxilaciones (reacciones de fase I) y reacciones de conjugación (reacciones de fase II) para aumentar su polaridad, facilitar su excreción y eventualmente disminuir su toxicidad. Los metabolitos son eliminados del hepatocito por vía apical a través de proteínas transportadoras específicas, pertenecientes a la familia de los ATP Binding Cassette (ABC), que incluye a la Glicoproteína P (PGP), Proteína asociada a resistencia a multidrogas 2 (MRP2) y la Proteína de resistencia al cáncer de mama (BCRP). La prolactina (PRL) es una hormona polipeptídica sintetizada principalmente por las células lactotropas de la adenohipófisis y está involucrada en múltiples funciones en el organismo, tanto fisiológicas (lactancia, reproducción, crecimiento y desarrollo, metabolismo) como patológicas (alteraciones en inmunidad y carcinogénesis). Las acciones de la PRL están mediadas por su receptor transmembrana, PRLR, el cual pertenece a la superfamilia de receptores de citoquinas y se encuentra expresado en diferentes tejidos: hígado, hipotálamo, pulmones, corazón, adipocitos, páncreas, estómago, intestino, riñón, bazo, ovario, glándula mamaria, etc. La vía clásica de señalización por PRL implica la unión de la hormona a su receptor predimerizado induciendo un cambio conformacional que conduce a la activación de Janus quinasa-2 (JAK-2) que fosforila residuos de tirosina en el dominio citoplasmático del receptor, seguido por el reclutamiento y fosforilación del factor de transcripción STAT5, un miembro de la familia de factores de transcripción Signal Transducers and activator of transcription. Este factor fosforilado se disocia del receptor, se dimeriza y se transloca al núcleo, activando la transcripción de genes diana. Vías alternativas que involucran la activación de proteínas quinasas (PI3K/AKT y MAPK) también han sido descritas. Generalmente, estas vías median la respuesta proliferativa y la diferenciación celular inducida por PRL. La obesidad resulta de la pérdida progresiva de la homeostasis entre el control de la ingesta de alimentos y el gasto de energía; la misma está altamente asociada con la resistencia a la insulina y constituye un factor de riesgo para el desarrollo de patologías como la diabetes mellitus tipo 2. El alto consumo de hidratos de carbono y/o grasas es uno de los principales factores ambientales que contribuyen a la actual epidemia mundial de obesidad. La obesidad y la resistencia a la insulina se encuentran generalmente acompañadas por un estado inflamatorio, caracterizado por un aumento en los niveles de citoquinas proinflamatorias tanto en la circulación como en los tejidos, así como por variaciones en los niveles séricos de distintas hormonas, entre ellas la PRL y la leptina. El hecho de que los niveles plasmáticos de PRL, entre los de otras hormonas, se encuentren alterados en diferentes modelos de obesidad e insulino-resistencia, sumado al aumento de interleuquinas pro-inflamatorias, sugieren la posible existencia de alteraciones en los sistemas de biotransformación y transportadores ABC en dichos modelos, con la consiguiente alteración del metabolismo y/o excreción biliar de compuestos que son sustratos, lo que conlleva a potenciales consecuencias sobre su eficacia y/o toxicidad. Se ha reportado que los niveles de PRL pueden encontrarse disminuidos o sin cambios en diferentes modelos de obesidad. Debido a esta discrepancia, nos propusimos evaluar los niveles de esta hormona en nuestro modelo de obesidad e insulino-resistencia inducido por una dieta rica en grasas (High Fat Diet, HFD) y evaluar cómo se encuentran los transportadores ABC hepáticos. Luego de 16 semanas de HFD los niveles plasmáticos de PRL en ratones C57BL/6 se encontraron aumentados significativamente, al igual que la expresión proteica de los transportadores PGP y BCRP en fracciones hepáticas enriquecidas en membrana canalicular. Además, para BCRP, también se evidenció un aumento a nivel de expresión de su mensajero (Abcg2). Asimismo, evaluamos el nivel de expresión del ARN mensajero para el receptor de PRL (Prlr), encontrándose aumentado significativamente en el grupo alimentado con HFD. Para evaluar si esos cambios en los transportadores se debían a la PRL, utilizamos bromocriptina (Brc), un agonista D2 dopaminérgico, que actúa sobre los receptores D2 de la hipófisis inhibiendo la secreción de PRL. En estos experimentos de inhibición corroboramos que los niveles plasmáticos de PRL en el grupo HFD se vieron disminuidos luego del tratamiento con Brc, observándose también una concomitante disminución en la expresión de los transportadores BCRP y PGP, sugiriendo que la PRL sería responsable, al menos en parte, del aumento de los niveles de expresión de dichos transportadores en el modelo de HFD. Se sabe que la expresión del gen Abcg2, que codifica para el transportador BCRP, es regulado transcripcionalmente por PRL a través de la vía que involucra a STAT5 en diferentes tipos celulares, pero se desconoce qué sucede en hígado. Por esta razón continuamos profundizando el estudio para conocer más sobre el mecanismo de acción de PRL sobre este transportador en hígado. Realizamos un análisis in silico para determinar la presencia de sitios putativos capaces de unir a STAT5 en el promotor de BCRP en hígado de ratón adulto, encontrando uno para STAT5b. Esto, sumado al hecho de que la dieta aumenta la translocación de STAT5 al núcleo, efecto que es contrarrestado por el uso de bromocriptina, nos sugiere que este factor de transcripción podría estar actuando en la modulación de BCRP hepático por PRL. Para confirmar la activación de STAT5 analizamos la expresión de algunos targets del mismo, como BCL-2 y BCL-xL, obteniendo una expresión proteica significativamente aumentada luego de la dieta, corrigiéndose este aumento con el uso de bromocriptina. Además, se observó el mismo comportamiento para el nivel de expresión del mensajero para el receptor de PRL, otro blanco de este factor de transcripción. Estos resultados en conjunto nos sugieren que la PRL modula la expresión de BCRP a través de una de sus vías canónicas mediadas por STAT5. El cuadro de obesidad e insulino-resistencia se caracteriza por un estado inflamatorio, donde los niveles de citoquinas pro-inflamatorias circulantes y en tejidos se encuentran aumentados y donde el tejido adiposo juega un papel central. En otros modelos de alteraciones inflamatorias, como el inducido por LPS que conduce al aumento de citoquinas como IL-1, IL-6 y TNF-, las cuales se sabe que son capaces de modular la expresión y actividad de transportadores hepáticos, particularmente IL-1 y TNF- up regulan la expresión de PGP, mientras que IL-6 la disminuye. Dado que en nuestro modelo no sólo está aumentada la PRL sino también el nivel de las citoquinas proinflamatorias IL-1 IL-6 y TNF- circulante y además como se ha descripto un efecto hipoglucemiante de la bromocriptina, evaluamos si los cambios observados en estos transportadores se deben a la modulación por PRL del componente hormonal e inflamatorio, o si esta hormona tiene un efecto directo sobre el hepatocito, teniendo en cuenta que su receptor se encuentra aumentado en hígado. Utilizando un modelo in vitro observamos el efecto directo de PRL sobre el hepatocito, encontrando un aumento tanto de proteína como ARNm de BCRP luego del tratamiento con la hormona, corroborando el efecto observado in vivo. El efecto de los altos de niveles de PRL sobre los transportadores se observó incluso luego del aislamiento en hepatocitos de ratones que recibieron la HFD. En distintos modelos de obesidad, la expresión del transportador canalicular BCRP se encuentra aumentada y la de otros transportadores hepáticos están modificadas, afectando a la disponibilidad y excreción biliar de sus sustratos. Para atenuar o contrarrestar los efectos que trae consigo la obesidad (hiperglicemia, hiperinsulinemia, hipertensión, dislipidemia, entre otros) los pacientes obesos reciben múltiples fármacos. La problemática reside en que la dosificación de los mismos basada en el peso o volumen corporal de los pacientes, puede no ser satisfactoria en términos de seguridad o eficacia para este grupo de pacientes. Para estimar in vivo la relevancia de las alteraciones de BCRP por PRL en nuestro modelo, realizamos un estudio de la depuración de glibenclamida, sustrato modelo del transportador y que además es un hipoglucemiante utilizado en pacientes con obesidad y diabetes mellitus tipo 2. Los resultados arrojaron que, en ratones alimentados con una HFD, la desaparición plasmática de glibenclamida está acelerada y la misma se correspondió con un aumento de metabolitos de este sustrato en bilis, confirmando la alteración en el manejo de sustratos de BCRP. Para poder determinar si el mayor decaimiento plasmático se debe (en humanos, CYP3a4) del cual se ha reportado que su nivel de expresión disminuye en un modelo de obesidad inducido por una HFD. Es por ello que resulta sumamente importante poder restablecer los niveles de PRL para normalizar la expresión de BCRP y de esa manera lograr que la droga logre el efecto deseado. Estos resultados, además, nos hablan de la necesidad de incluir a pacientes obesos en los estudios de farmacocinética para lograr su éxito terapéutico. sólo a la modificación del valor proteico de BCRP y no a una mayor captación de sustrato por el hepatocito, evaluamos la expresión de algunos transportadores localizados en la membrana basolateral del hepatocito, responsables del transporte de sulfonilureas al interior del mismo, puesto que también su expresión puede verse afectada con la dieta. Dado que se han reportado cambios en los niveles de expresión del mensajero de OATPs en distintos modelos de obesidad, analizamos en nuestro modelo el nivel de expresión del mensajero para los transportadores OATPs (1a1; 1b2) observando que los mismos no se modifican con la dieta, pero sí disminuye el mensajero que codifica para Oatp1a4, lo que nos sugiere que la mayor depuración del sustrato se debe principalmente al aumento de BCRP inducido por PRL y no a un mayor ingreso del mismo al hepatocito. También descartamos que se deba a una mayor actividad de los sistemas de biotransformación debido a que la glibenclamida es metabolizada por el citocromo 3a11 (en humanos, CYP3a4) del cual se ha reportado que su nivel de expresión disminuye en un modelo de obesidad inducido por una HFD. Es por ello que resulta sumamente importante poder restablecer los niveles de PRL para normalizar la expresión de BCRP y de esa manera lograr que la droga logre el efecto deseado. Estos resultados, además, nos hablan de la necesidad de incluir a pacientes obesos en los estudios de farmacocinética para lograr su éxito terapéutico.
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Caracterización de pigmentos y enzimas producidas por una cepa aislada de Fusarium lichenicola
(2024) Melnichuk, Natasha; Romanini, Diana
La bioprospección implica la investigación de la biodiversidad para encontrar nuevos recursos de valor comercial como genes, organismos, metabolitos y proteínas. Las enzimas son un foco clave de la bioprospección debido a sus aplicaciones industriales. Estos catalizadores biológicos tienen una amplia variedad de usos, tanto en la naturaleza como en la industria. Un ejemplo de esto es su rol en la extracción de compuestos fenólicos (CF) a partir de la biomasa vegetal, un método más amigable con el medio ambiente en comparación con la extracción química tradicional. Además, este enfoque promueve los principios de la economía circular mediante la utilización de residuos agroindustriales para obtener CF de origen vegetal que son de alta relevancia por sus propiedades bioactivas. Por otro lado, los microorganismos productores de pigmentos también suelen ser blancos en un proyecto de bioprospección. Estas moléculas son alternativas interesantes a los colorantes sintéticos, ya que ofrecen funciones adicionales como bioactividad antibiótica, antifúngica o antioxidante. Esas ventajas hacen que los pigmentos microbianos sean de interés para diversas industrias como alimentaria, cosmética y textil. Este trabajo de tesis tuvo como objetivo el aislamiento de cepas de hongos filamentosos con potencial para producir pigmentos y enzimas para la extracción de compuestos fenólicos de la biomasa vegetal. En la figura 1 se esquematiza el trabajo de tesis realizado. En primer lugar, se realizó una bioprospección para aislar hongos filamentosos utilizando muestras de suelo recolectadas en un campo cercano a la localidad de Alcorta en Santa Fe, Argentina. Se aislaron cepas de hongos filamentosos y la cepa seleccionada para continuar con el trabajo fue Fusarium lichenicola ATC1. Mediante fermentación en estado sólido utilizando residuos agroindustriales como sustrato se evaluó la producción de tanasa, celulasa y pectinasa utilizando F. lichenicola ATC1. Además, se midió la capacidad antioxidante y los fenoles totales en los extractos de cultivo obteniéndose (44 ± 7) mmoles eq Trolox / 100 g SS y una concentración de fenoles de (3,1 ±0,3) gEAG/100 g SS. En cuanto al extracto pigmentado rojo, se evaluaron distintas estrategias de producción por fermentación y composición de medios de cultivo. Se avanzó en la caracterización química del extracto, sus propiedades bioactivas y sus posibles aplicaciones, entre las cuales se destacan la posibilidad de usarlo como colorante en la industria textil y su potente actividad antibiótica. Finalmente, se logró secuenciar el genoma de F. lichenicola ATC1, el cual no había sido depositado hasta la fecha lo cual permitió determinar la identidad taxonómica de la cepa ATC1. Actualmente, se está trabajando en la anotación de este genoma.
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Rol del sistema de reparación de apareamientos incorrectos en el ADN en respuesta al estrés genotóxico en Arabidopsis thaliana
(2023) Ramos, Rocío Soledad; Spampinato, Claudia P.
Como organismos sésiles, las plantas están continuamente expuestas a una variedad de factores ambientales adversos, tanto bióticos como abióticos, que pueden provocar daños en varias biomoléculas, entre ellas el ADN. Afortunadamente, todos los organismos vivos, incluidas las plantas, poseen una variedad de mecanismos para detectar y reparar los daños en el ADN con el fin de mantener la integridad del genoma. Uno de ellos es el sistema de reparación de apareamientos incorrectos en el ADN o MMR (por sus siglas en inglés, Mismatch Repair). Aunque las respuestas de las plantas al estrés, biótico o abiótico, y al daño en el ADN se han estudiado extensamente por separado, su posible interconexión sigue siendo relativamente inexplorada. Por ello, este trabajo de Tesis tuvo como objetivo investigar la función del sistema MMR, específicamente de las proteínas MSH6 (por sus siglas en inglés, MutS Homolog 6) y MSH7 (por sus siglas en inglés, MutS Homolog 7), en la respuesta de las plantas de Arabidopsis thaliana al estrés biótico y al estrés hídrico, ya que ciertos fitopatógenos, así como ciertos estreses abióticos, producen daños en el ADN. Los resultados obtenidos demostraron que MSH6 y MSH7 de A. thaliana tienen roles en la respuesta inmune a Pseudomonas syringae pv. tomato DC3000 (Pst DC3000). Más aún, estos roles serían diferenciales. Además, en este trabajo de Tesis, se demostró que la ausencia de MSH6 produce un fenotipo de menor susceptibilidad a Pst DC3000 en A. thaliana, presentando una menor apertura estomática y, en consecuencia, un menor ingreso bacteriano a la planta. Por otra parte, se demostró que la supresión de MSH6 produce una mayor acumulación del daño en el ADN y compromete la eliminación del peróxido de hidrógeno con respecto a las plantas salvajes (WT). Adicionalmente, se estudió la respuesta de las plantas mutantes msh6 frente al estrés hídrico, y se observó una menor inhibición de algunos parámetros fenotípicos frente al déficit hídrico y una menor tolerancia a la inundación en comparación con las plantas WT. Finalmente, se logró la mutagénesis sitio-dirigida del dominio Tudor del gen MSH6 de A. thaliana. En resumen, este Trabajo de Tesis, pudo demostrar la existencia de una interacción entre el sistema MMR y los mecanismos de la señalización del estrés en los organismos vegetales.
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Caracterización estructural y funcional de las proteínas sensoras de los sistemas de resistencia a β-lactámicos de Staphylococcus aureus
(2023) Mihovilcevic, Damila; Llarrull, Leticia Irene
Staphylococcus aureus resistente a meticilina (MRSA) es una de las amenazas clínicas multirresistentes más importantes a nivel mundial. MRSA posee dos mecanismos primarios de resistencia a antibióticos β-lactámicos: la producción de una serin-β-lactamasa, PC1, y la adquisición de una transpeptidasa accesoria, PBP2a, con baja afinidad por los antibióticos. Los genes que codifican para estas dos proteínas junto con los que codifican para los reguladores BlaI/MecI y BlaR1/MecR1, forman parte de los operones bla y mec, respectivamente. Las proteínas BlaR1 y MecR1 son proteínas integrales de membrana denominadas sensoras/transductoras, que presentan un dominio sensor extracelular capaz de detectar el antibiótico en el medio y disparar una señal al interior celular, que deriva en la transcripción de los genes involucrados en la resistencia. Sin embargo, hasta el momento el mecanismo de transducción de la señal es desconocido. Una de las dificultades más grandes radica en la expresión, purificación y caracterización de estas proteínas en sus versiones completas. La comprensión del mecanismo de transducción de señal es de sumo interés dado que ambas proteínas son posibles blancos para el diseño de nuevos inhibidores que puedan emplearse junto con los antibióticos actualmente disponibles. A fin de esclarecer el funcionamiento de ambos sistemas, nos propusimos comenzar con una primera caracterización estructural de la proteína MecR1. Luego de sobre-expresar, solubilizar y purificar la proteína de interés, determinamos que la misma se encuentra como dos especies en micelas de detergente. A partir de ensayos de SEC-MALS confirmamos las especies como dímero y monómero. Ensayos de dicroísmo circular nos permitieron determinar que ambas especies se encuentran plegadas en detergente y empleando diferentes antibióticos β-lactámicos probamos que el dominio sensor de ambas se encuentra correctamente plegado y es funcional. Además, realizamos dos screenings iniciales de condiciones para la preparación de grillas que permitan determinar la estructura de MecR1 empleando Cryo-EM. Si bien, hasta el momento no se han encontrado las condiciones de vitrificación óptimas, los resultados fueron alentadores para continuar trabajando en ello. Por otro lado, buscamos condiciones alternativas para la solubilización y purificación de la proteína de membrana. Se ensayaron dos polímeros para la preparación de nanodiscos, logrando la solubilización y purificación con el polímero SMALP 300 (3:1). Sin embargo, los rendimientos han sido menores que empleando detergentes, por lo que se debe continuar trabajando en la puesta a punto de las condiciones de solubilización. Al momento de comenzar este trabajo, sólo se conocían las estructuras cristalográficas de los dominios sensores de las proteínas BlaR1 y MecR1, en ausencia y en presencia de antibiótico. Sin embargo, las estructuras no mostraban diferencias que pudieran aportar información acerca del mecanismo de transducción de la señal hacia el dominio metaloproteasa, luego de la unión del antibiótico. Con el objetivo de dilucidar este mecanismo, propusimos desarrollar una metodología empleando el uso de lantánidos que permita evaluar los cambios conformacionales que ocurren en la proteína MecR1 al producirse la unión del antibiótico. Para ello, se introdujeron sondas espectroscópicas en bucles citoplasmáticos de MecR1 a partir de las cuales se pudieron obtener medidas de distancia, empleando Espectroscopia de Resonancia Paramagnética Electrónica (EPR) de alto campo y Transferencia de Energía de Luminiscencia por Resonancia (LRET). Esta metodología nos permitirá a futuro continuar con el estudio de los cambios conformacionales que ocurren en MecR1 al estar unida a antibióticos βlactámicos o en presencia del represor MecI. La cepa de referencia empleada para el estudio del mecanismo de resistencia de Staphylococcus aureus mediado por el operón bla es S. aureus NRS128. La cepa S. aureus MN8, presenta la misma secuencia que NRS128 para los genes blaI, blaZ y la región operadora, pero presenta una mutación puntual en el gen blaR1 que genera un cambio en el marco de lectura y un codón de STOP prematuro. Sin embargo, MN8 fue reportada como resistente a antibióticos βlactámicos. A lo largo de este trabajo se intentó esclarecer si alguna de las versiones truncas generadas en MN8, que poseen tanto el dominio metaloproteasa como el dominio sensor se estaría expresando y presentaría actividad metaloproteasa, dando lugar a la manifestación de resistencia. Confirmamos la presencia de la mutación puntual en MN8 y la resistencia frente a los antibiótico ampicilina y penicilina G. Además, empleando ensayos con el antibiótico cromogénico nitrocefina y utilizando cepas de S. aureus reporteras, confirmamos la expresión inducible de los genes que componen el operón bla en la cepa NRS128, en contraste con una expresión constitutiva en la cepa MN8. Esta tesis aporta nuevos avances en el estudio de la proteína integral de membrana MecR1. Además, se ha innovado en el uso de nanodiscos para la purificación de proteínas de membrana y la determinación de la estructura empleando la técnica de vanguardia Cryo-EM. Por otro lado, se dejan sentadas las bases del desarrollo de una nueva metodología empleando EPR y LRET para la determinación de medidas de distancias en diferentes condiciones, que permitirán continuar con el estudio del mecanismo de transducción de la señal empleado tanto por MecR1 como por BlaR1.
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Estudio de péptidos natriuréticos tipo planta en la interacción planta-patógeno
(2024) Di Paolo, Valeria; Ottado, Jorgelina
Las plantas superiores están de forma continua expuestas a condiciones adversas en su entorno. Por esto, cuando se enfrentan a un estrés biótico hacen frente al mismo a través de una inmunidad innata presente en sus células, o mediante una inmunidad sistémica, la cual se transduce al resto del organismo por medio de moléculas señal. En el presente trabajo de tesis se analizaron los roles desempeñados bajo dicho estrés por parte del receptor AtPNP-R1, el péptido natriurético vegetal AtPNP-A, ambos de A. thaliana y el péptido natriurético bacteriano XacPNP, sintetizado por X. citri subsp. citri. Por medio de la utilización de herramientas bioinformáticas se determinó la presencia de cis-elementos reguladores en la secuencia promotora putativa del gen codificante de AtPNP-R1. Además, se realizó una búsqueda de dominios conservados en la secuencia aminoacídica de las proteínas bajo estudio, pudiéndose establecer los péptidos señal para las mismas, y secuencias LRR para el receptor. También, se realizaron modelados de las secuencias terciarias, observándose una forma curvada general para el receptor vegetal y estructuras similares entre sí para los péptidos natriuréticos, con disposiciones en el espacio de las estructuras secundarias conservadas en este último caso. Por otro lado, se determinaron probables interacciones entre AtPNP-R1 con AtPNP-A y XacPNP, las cuales fueron una base para posteriores estudios in planta. Para ampliar los resultados anteriormente obtenidos se realizaron observaciones por medio de microscopía confocal, utilizando diferentes fusiones a fluoróforos de las proteínas bajo estudio. Se determinaron las localizaciones celulares de las mismas, siendo en el plano de la membrana plasmática asociado a ella para AtPNP-R1, y en el espacio extracelular para los péptidos vegetal y bacteriano. También se realizó una caracterización del movimiento del receptor a lo largo de la membrana plasmática a partir del cual se obtuvieron diferentes parámetros cinéticos. Además, se determinaron las interacciones AtPNP-R1/AtPNP-A y AtPNP-R1/XacPNP in planta. Con el objetivo de analizar el rol de las proteínas bajo estudio en las respuestas activadas frente a condiciones de estrés biótico se realizaron diferentes ensayos. Se observó un fenotipo de menor daño en el tejido infectado, causado por el péptido bacteriano en un contexto génico de presencia del receptor AtPNP-R1. Sumado a esto, se observaron expresiones significativamente aumentadas en los transcriptores correspondientes a AtPNP-A y AtPNP-R1 luego de una infección patogénica. Se amplió dicho resultado por medio de un análisis proteómico en vías de caracterizar las respuestas inducidas por las proteínas bajo estudio. Se determinó que las mismas actúan de forma similar en las modificaciones generadas en el metabolismo de la planta post-infección. Esto último, refuerza la idea de un accionar en conjunto en la activación de respuestas celulares frente a una situación de estrés biótico. Se observó que metabolismos anabólicos fueron reprimidos, mientras que vías de generación de intermediarios moleculares o poder reductor se vieron sobreexpresadas. Probablemente, esto se da con el objetivo de abastecer de componentes necesarios en las respuestas de defensa. Además, los mecanismos de regulación de los niveles de ROS se vieron aumentados, posiblemente con el objetivo de reducir el daño celular e intentar sobrevivir al ataque patogénico. Los resultados obtenidos en este trabajo de tesis ampliaron el conocimiento sobre el accionar de AtPNP-R1 y AtPNP-A de A. thaliana, y XacPNP de X. citri subsp. citri en la activación de respuestas frente a condiciones de estrés biótico. Además, permitieron determinar sus localizaciones celulares y la interacción entre los mismos in vivo. Dichos resultados sientan bases para profundizar en el mecanismo activado como respuesta a estrés biótico, corriente abajo del receptor AtPNP-R1 luego de la interacción con su ligando AtPNP-A, contribuyendo al avance en la investigación básica sobre la interacción planta-patógeno
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Estudio de los sistemas de transporte de potasio y su contribución en la respuesta a diferentes condiciones de estrés en Enterococcus faecalis
(2024) Acciarri, Giuliana; Magni, Christian; Espariz, Martín
Entre los miembros del género Enterococcus se encuentran los microorganismos más controversiales de las bacterias ácido lácticas (BAL), y comprenden tanto bacterias de interés industrial, como comensales y patógenos. Un rasgo distintivo de los enterococos es la capacidad de persistir y prosperar en ambientes hostiles, lo que les permite una amplia dispersión en el ambiente. Dentro del género, Enterococcus faecalis, un habitante natural del tracto gastrointestinal, apareció en las últimas décadas como un patógeno intrahospitalario multirresistente. A pesar de su perfil controversial, E. faecalis forma parte de productos alimenticios. La capacidad de las bacterias de adaptarse a los ambientes fluctuantes, requiere del movimiento rápido de tres iones: protones, sodio y potasio. En los últimos años, se han caracterizado varios sistemas de transporte de potasio (K+) en microorganismos patógenos y no patógenos. Sin embargo, el conocimiento de la homeostasis de este catión es limitado en BAL y, particularmente, en Enterococcus. El desarrollo del presente trabajo de tesis permitió profundizar en el conocimiento de la función biológica del transporte de potasio en E. faecalis. Los estudios bioinformáticos realizados permitieron identificar cinco sistemas de captación de K+ en E. faecalis: Kdp, Kup, KimA y dos miembros del sistema Ktr. Además, los estudios de distribución de estos sistemas en E. faecalis mostraron que, mientras Ktr, Kup y KimA están presentes en la mayoría de las cepas analizadas, Kdp está presente en 21% de estas cepas, asociado con aislamientos clínicos. Estudios de expresión heteróloga y análisis del fenotipo de mutantes deficientes en el transporte de K+, indicaron que los sistemas Kup, KimA y Ktr de la cepa E. faecalis JH2-2 son funcionales y mostraron que, el sistema Ktr desempeña un papel importante en la adaptación al estrés hiperosmótico y al pH alcalino, y que Kup funciona de forma secundaria a Ktr. Además, estos estudios permitieron evidenciar que el transportador KimA es operativo a altas concentraciones de potasio. Los estudios transcripcionales de los genes que codifican para Kup y KimA de E. faecalis, reconocidos recientemente como miembros de la misma familia de transportadores de potasio KUP, mostraron, mediante fusiones a genes reporteros y cuantificación de transcriptos, una inducción de ambos genes a pH ácido. Sin embargo, se comprobó que la presencia de la secuencia de inserción IS6770 en la región promotora del gen kup en la cepa JH2-2, alteró su expresión a bajo pH. Asimismo, se observó una inducción de los genes kimA y kup frente a condiciones de estrés por bajo potasio y alta concentración de sales, cuando se evaluó su expresión en condiciones alcalinas. Por otro lado, en el ámbito de la señalización celular, se observó una regulación negativa de la actividad de Kup de E. faecalis por parte del segundo mensajero c-di-AMP, mientras que no se observó efecto sobre KimA. En cuanto a la distribución de los genes codificantes para Kup y KimA, estudios iniciales mostraron que la presencia de ambos transportadores no es exclusiva de E. faecalis, sino que se encuentran en otras bacterias de interés industrial y clínico
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Búsqueda de compuestos bioactivos que interfieran con la lipoilación de proteínas en microorganismos patógenos
(2024) Scattolini, Albertina; Mansilla, María Cecilia; https://orcid.org/0000-0001-7421-2039
El ácido lipoico (AL) es un compuesto organosulfurado distribuido ampliamente en la Naturaleza. Es un cofactor esencial requerido para el funcionamiento de seis complejos multienzimáticos involucrados en el metabolismo oxidativo (piruvato deshidrogenasa, PDH; 2-oxoglutarato deshidrogenasa; deshidrogenasa de cetoácidos ramificados; oxoadipato deshidrogenasa y acetoína deshidrogenasa) y de un carbono (sistema de clivaje de la glicina, GCS). El AL se encuentra unido covalentemente mediante un enlace amida a residuos de lisina presentes en dominios de lipoilación (DL) que se encuentran altamente conservados dentro de las subunidades E2 de las deshidrogenasas o la subunidad H del GCS (GcvH). Gran parte del conocimiento sobre el metabolismo del AL proviene de investigaciones realizadas en bacterias modelo como Escherichia coli y Bacillus subtilis. Mientras que la bacteria modelo Gram-negativa emplea la vía clásica para el metabolismo del AL, la Gram-positiva utiliza el mecanismo del "lipoyl-relay". En esta última, la octanoiltransferasa (LipM) modifica exclusivamente GcvH. La octanoil-GcvH generada se convierte en sustrato para la lipoato sintasa (LipA), que inserta dos átomos de azufre en los carbonos 6 y 8 del octanoato, culminando en la lipoilación de GcvH. Posteriormente, la amidotransferasa LipL, una enzima presente únicamente en la vía de tipo lipoyl-relay, transfiere la porción lipoílo a los restantes complejos enzimáticos dependientes de AL. Además, se identificó que esta bacteria utiliza la acción combinada de una lipoato ligasa (LplJ) y de LipL para modificar sus apoproteínas con AL proveniente del medio extracelular. Las vías de lipoilación, inicialmente descubiertas en bacterias, ofrecen información crucial sobre el metabolismo del AL en organismos eucariotas. En el caso de las plantas, emplean vías similares a las observadas en E. coli, mientras que los hongos y mamíferos utilizan rutas metabólicas más parecidas a las encontradas en B. subtilis. La investigación de las rutas de biosíntesis y utilización de AL en microorganismos ha ganado gran relevancia, especialmente en relación con la patogénesis, por lo que se constituye en un prometedor blanco para nuevas terapias antimicrobianas. En este trabajo nos propusimos identificar compuestos que afecten la actividad de enzimas requeridas para la lipoilación proteica en bacterias Gram-positivas patógenas y parásitos responsables de diversas enfermedades desatendidas a nivel mundial. Staphylococcus aureus es una bacteria Gram-positiva que puede causar enfermedades en prácticamente cualquier tejido y se manifiesta más comúnmente como bacteriemia, osteomielitis, neumonía e infecciones de la piel. Esta bacteria puede evadir los leucocitos fagocíticos produciendo factores de virulencia que inhiben su actividad antimicrobiana. Se demostró que S. aureus secreta la subunidad E2 de la PDH lipoilada al medio extracelular, que actúa como un inmunosupresor, promoviendo la virulencia de la bacteria. Por el contrario, la presencia de la E2-PDH no modificada, induce una mayor producción de citoquinas proinflamatorias por parte del huésped, permitiendo el control de la infección. La vía de rescate de AL en S. aureus incluye dos lipoato ligasas, LplA1 y LplA2, dos proteínas H y la amidotransferasa LipL, que da como resultado la lipoilación de los complejos deshidrogenasa, incluida la PDH. Para intervenir la lipoilación proteica, planteamos una estrategia que consiste en utilizar análogos de sustrato que puedan ser ligados a las E2s y afectar su funcionalidad. Se diseñaron compuestos dirigidos al sitio activo de LplA2 y se analizó su efecto en el crecimiento de dos bacterias Grampositivas, S. aureus y B. subtilis. Tres análogos afectaron el crecimiento en medio mínimo de una cepa salvaje de S. aureus, en concentraciones que oscilaron entre 6,6 y 24 µM, mientras que no produjeron ningún efecto en B. subtilis. Realizando un análisis más detallado con el compuesto más potente, Lpl-004, pudimos observar que el mismo estaba siendo transferido a las subunidades E2 de los complejos deshidrogenasa. Como consecuencia se generó un impacto negativo en su funcionalidad, que pudo restaurarse agregando los productos de los complejos enzimáticos dependientes de lipoato. No se observó efecto de este compuesto sobre el crecimiento de una cepa de S. aureus doble mutante en las lipoato ligasas, lo que nos permitió concluir que la inhibición de Lpl-004 es dependiente de la actividad ligasa. Cuando Caenorhabditis elegans fue infectado con la cepa salvaje de S. aureus, la presencia de Lpl-004 causó una esperanza de vida significativamente mayor en comparación con la condición sin el compuesto. Asimismo, pudimos observar que la presencia del compuesto no produjo cambios en la vida media del gusano al ser infectado con la bacteria deficiente en ambas lipoato ligasas. Como sucede en humanos, C. elegans no posee vía de salvataje de AL por lo que este compuesto no puede afectar la viabilidad del hospedador. Nuestros resultados proporcionan evidencia de que las moléculas pequeñas que pueden ser tomadas por la vía de recuperación de AL representan una estrategia innovadora para el desarrollo de nuevas sustancias antimicrobianas. El conocimiento sobre el mecanismo involucrado en la lipoilación de proteínas en protozoarios parásitos, como los causantes de la enfermedad del sueño, de la enfermedad de Chagas y la malaria, es crucial para la generación de nuevos fármacos que apunten a esta vía. Estos parásitos, que causan enfermedades infecciosas en los seres humanos, constituyen una importante amenaza para la salud y son responsables de más de un millón de muertes al año. Hay evidencia en la bibliografía de que el ácido 8-bromo-octanoico (BrO), un análogo del AL, afecta la sobrevida de diferentes parásitos. Utilizando colecciones de mutantes de B. subtilis defectuosas en el metabolismo de AL, reunimos evidencia que nos permitió proponer por primera vez que la vía de tipo lipoyl-relay también está presente en protozoos parasitarios. Mediante un enfoque genético inverso asignamos actividad amidotransferasa a los productos de los genes Tb927.8.630 (TblipL) de Trypanosoma brucei y PF3D7_0923600 (LipL2) de Plasmodium falciparum. El modelo de B. subtilis nos permitió, además, identificar las amidotransferasas de estos parásitos como blanco del BrO, explicando la pérdida completa de la lipoilación de proteínas y el deterioro del crecimiento causado por este compuesto en T. cruzi. Un análisis exhaustivo de las secuencias aminoacídicas y de los modelados estructurales de diferentes amidotransferasas procariotas y eucariotas nos permitió identificar residuos que se encuentran conservados e involucrados en el mecanismo de acción de estas proteínas. Como se había reportado anteriormente, las amidotransferasas procariotas realizan la transferencia del lipoilo a través de un residuo de cisteína, que está ausente en las de origen eucariota. Propusimos que TbLipL utilizaría una lisina altamente conservada, tanto en enzimas procariotas como eucariotas, para transferir el residuo lipoilo. Mediante mutagénesis sitio dirigida cambiamos ese residuo de lisina por una alanina. La expresión de la proteína mutante no revirtió el defecto de crecimiento de la mutante ΔlipL de B. subtilis, indicando la pérdida de la actividad amidotransferasa de la enzima del parásito. Esta lisina conservada no resultó ser esencial para la actividad de la amidotransferasa de B. subtilis. Este resultado indica que, si bien las amidotransferasas eucariotas y procariotas catalizan la misma reacción, los mecanismos de reacción serían diferentes. Otra característica destacable es que las amidotransferasas eucariotas están conformadas por dos dominios, mientras que las bacterianas están compuestas por un único dominio. El dominio N-terminal de TbLipL presenta homología estructural con la totalidad de LipL de B. subtilis. La eliminación del dominio adicional de TbLipL, que denominamos TbLipLC, generó una pérdida en la actividad proteica. Estos resultados indican que este segundo dominio sería importante para la catálisis o para la correcta estructuración de la proteína de los parásitos. Las amidotransferasas tienen un rol esencial en organismos que emplean un lipoyl-relay para modificar sus apoproteínas, siendo fundamentales tanto en las vías de síntesis como en las de utilización del AL. Por consiguiente, planteamos que estas enzimas poseen un gran potencial como blancos para el desarrollo de nuevos compuestos antimicrobianos y antiparasitarios. Para detectar posibles inhibidores de amidotransferasas bacterianas y de protozoos a través de un screening de alto rendimiento, diseñamos una cepa reportera de B. subtilis. Esta cepa carece de amidotransferasa y expresa la octanoiltransferasa LipB de E. coli. La falta de LipL nos permitió estudiar el comportamiento de las amidotransferasas PfLipL2 o TbLipL cuando eran expresadas bajo el control de un promotor inducible por xilosa. La capacidad del BrO para inhibir las amidotransferasas parasitarias nos sirvió para evaluar la factibilidad de nuestra estrategia reportera. Este modelo podría ser fundamental para la detección de quimioterapéuticos selectivos y más eficientes contra enfermedades producidas por bacterias patógenas o parásitos. Además, los genes que codifican para las amidotransferasas de diferentes organismos también podrían introducirse en la cepa reportera, lo que demuestra una gran versatilidad en la metodología. Hasta donde sabemos, este es el primer método de screening utilizado con éxito para identificar inhibidores de amidotransferasas.
Embargo
Caracterización del papel de α-sinucleína en melanoma: explorando la relación entre cáncer y enfermedades neurodegenerativas
(2024) Malizia, Florencia; Menacho Márquez, Mauricio; https://orcid.org/0000-0003-2386-7013
El melanoma, a pesar de ser el cáncer de piel menos frecuente, se distingue por su agresividad debido a la alta probabilidad de generar metástasis. El mismo surge por la transformación maligna y proliferación descontrolada de los melanocitos. Por otro lado, la enfermedad de Parkinson, el segundo trastorno neurológico más prevalente a nivel mundial, se caracteriza por la pérdida de neuronas dopaminérgicas y la formación de cuerpos de Lewy, inclusiones proteináceas compuestas principalmente por alfa-sinucleína (αS). Esta proteína estructuralmente desordenada en su estado nativo, tiene el potencial de formar fibras amilodes por autoasociación. Estas especies de agregación pueden transmitirse entre neuronas, propagando así la enfermedad. Durante el último tiempo se ha asociado a la enfermedad del Parkinson con el desarrollo de melanoma, planteando a αS como posible conector. Investigaciones recientes indican que, a pesar de su asociación con efectos tóxicos para las neuronas dopaminérgicas, esta proteína podría tener beneficios para las células de melanoma avanzado; sin embargo poco se ha ahondado en su estudio. En este trabajo de tesis, partiendo de la hipótesis de que αS desempeñaría un papel crucial en procesos asociados a la progresión tumoral, nos propusimos examinar la contribución potencial de αS en los procesos relacionados con el crecimiento de las células de melanoma y la generación de metástasis mediante un enfoque integral que incluye análisis bioinformáticos y estudios in vitro e in vivo. Observamos así que αS está involucrada en procesos moleculares que conducen a una alteración de la proliferación, migración y capacidad clonogénica. Demostramos además que las células de melanoma pueden captar distintas especies de agregación de αS. Estas especies no resultan tóxicas para las células de melanoma en un rango de concentración en que afectan negativamente a células de neuroblastoma; en cambio resultan beneficiosas para el desarrollo de melanoma. Por otro lado, a través de enfoques computacionales observamos una alta asociación entre la expresión de αS y melanoma, predisponiendo su alta expresión a una menor sobrevida de los pacientes. Tras la obtención de genes diferencialmente expresados entre pacientes de melanoma con alta y baja expresión de αS, identificamos vías y componentes celulares que se encuentran sobre-representados asociados a la expresión de esta proteína. Entre las vías asociadas a la expresión de αS cabe resaltar aquellas relacionadas con el metabolismo mitocondrial, la reparación de ADN, la organización de matriz extracelular, el tráfico vesicular y la señalización mediada por receptores acoplados a proteínas G. Nuestros resultados sugieren así que existe un rango de concentración en el cual αS estaría favoreciendo procesos involucrados en la progresión del melanoma y el desarrollo de metástasis a través de la alteración de diferentes funciones y componentes celulares, pudiendo tener implicancias en la transmisión de vesículas transmitiendo así su malignidad. Además, αS tendría un valor pronóstico en pacientes con melanoma.
Embargo
Desarrollo de estrategias constructivas modulares hacia Aaptaminoides e Isatinas naturales y derivados
(2024) Bolivar Ávila, Santiago J.; Larghi, Enrique Leandro; Testero, Sebastián A.
En el marco de esta Tesis Doctoral, se logró la síntesis exitosa de un intermediario avanzado hacia el producto natural marino 5-benciloxi-9-demetoxiaaptamina (III.X). La aplicación de un meticuloso análisis retrosintético reveló el camino sintético, la elección estratégica de grupos protectores y de eugenol como material de partida, una sustancia económica y asequible extraída del clavo de olor (biomasa). La aproximación establecida implicaría la construcción del triciclo ABC del aaptaminoide en cuestión. A pesar del esfuerzo sintético invertido no fue posible acceder al producto natural, razón por la cual se implementó una metodología alternativa basada en la activación C-H. Esta nueva aproximación que utilizó veratrilamina como material de partida, permitió alcanzar un intermediario tricíclico avanzado en apenas siete etapas con un rendimiento global de 41%. Este avance no solo se erige como una valiosa contribución, sino que además abre la puerta a futuras investigaciones que exploren la diversificación estructural mediante reacciones de activación C-H con otros alquenos a la hora de generar nuevos aaptaminoides. En una segunda línea de investigación, se materializó la síntesis total de la isatina natural Melosatina A. La secuencia modular utilizada compartió el mismo material de partida inicial que el derivado aaptamínico, logrando el alcanzar el objetivo sintético en apenas cinco etapas con un rendimiento global del 41%, destacando la última etapa de ciclación basada en la reacción de Martinet. La caracterización estructural de Melosatina A se completó mediante técnicas espectroscópicas y difracción de rayos X en monocristales. De manera innovadora, se exploró el uso de una 4-propenilisatina en una reacción de metátesis cruzada de olefinas, abriendo oportunidades para la diversificación estructural. Bajo la misma estrategia de ciclación, se logró también la síntesis de 11 isatinas con rendimientos de moderados a elevados. Aprovechando los amplios estudios reportados del valor como agentes citotóxicos de las isatinas, se realizó un estudio de modelado molecular (Docking, Dinámica molecular y ADMET) sobre la proteína MELK-1, sobre-expresada en cáncer de mama y leucemia. El análisis reveló la afinidad significativa de las isatinas sintetizadas por el receptor proteico, destacando la Melosatina A. Este estudio, combinado con investigaciones in vitro (actualmente en desarrollo) proporcionará información esencial para diseñar la síntesis de nuevos derivados de Melosatina A y otros análogos sintéticos.
Acceso Abierto
Esterilglucósidos, subproductos de la producción de biodiesel, como una nueva materia prima industrial
(2024) Carlucci, Renzo; Labadie, Guillermo Roberto
Las problemáticas globales derivadas de la alta dependencia de los productos petroquímicos han impulsado la búsqueda de alternativas sostenibles, destacándose la producción a partir de materias primas renovables. En Argentina, las biorrefinerías de soja han crecido significativamente en las últimas dos décadas, utilizando el aceite de soja para la producción de biodiesel. Este biocombustible, por su carácter de renovable, representa una opción viable para la transición hacia energías más limpias. Sin embargo, durante el almacenamiento a gran escala del biodiesel, se forman depósitos insolubles, principalmente debido a la presencia de esterilglucósidos, entre otros componentes minoritarios. Para abordar este desafío, recuperamos esterilglucósidos de alta pureza (960 g) a partir de 9 kg de depósitos insolubles mediante un proceso de purificación que incluye lavados con solventes apolares y polares, seguidos de filtración por gravedad. La pureza de los esterilglucósidos, determinada por resonancia magnética nuclear cuantitativa (RMNc), fue superior al 98%. Además, recuperamos los solventes utilizados y el biodiesel ocluido en los depósitos. Ensayamos la viabilidad celular con células de hepatoma humano (Huh7) usando pruebas de MTT, y realizamos estudios in vivo para evaluar el impacto de la administración de SGs. Los resultados mostraron que las células mantenían su viabilidad y los estudios in vivo confirmaron la inocuidad del producto en las concentraciones ensayadas durante un mes de tratamiento. En el desarrollo de métodos para obtener productos de alto valor agregado, diseñamos un proceso de hidrólisis para la obtención de fitosteroles a partir de SGs, usando inicialmente HCl(ac) como agente catalítico. Tras explorar distintas concentraciones de ácido y tiempos de reacción, determinamos que 18 horas eran necesarias para completar la reacción, logrando fitosteroles con un rendimiento del 95% y una pureza superior al 99%, confirmada por CG/MS y RMNc. Para mejorar la eficiencia y reducir el impacto ambiental, optimizamos la hidrólisis usando ácido metansulfónico (MSA). Empleamos un Diseño de Experimentos para identificar los factores significativos y obtuvimos una superficie de respuesta, escalando el proceso hasta 100 g de SGs y obteniendo fitosteroles con rendimientos superiores al 95% y pureza superior al 99%. Comparando los E-factors de métodos tradicionales con nuestro método, demostramos que el nuestro es más amigable con el ambiente. Además, sintetizamos derivados 22-oxo-23,24-bisnor-esteroles debido a su importancia en el desarrollo de moléculas bioactivas. Protegimos el doble enlace interno de los esteroles mediante la formación de ésteres metílicos internos, obteniendo los productos deseados con rendimientos superiores al 75%. Realizamos la ozonólisis para escindir el doble enlace exocíclico del estigmasterol, recuperando derivados de β-sitosterol y campesterol. Posteriormente, obtuvimos los derivados 22-aldehido y 22-OH con rendimientos superiores al 70%, demostrando la viabilidad de utilizar el estigmasterol para obtener derivados sintéticos de interés y recuperando β-sitosterol y campesterol. También exploramos la síntesis de análogos de Olestra®, un sustituto de grasas no calórico, utilizando SGs aislados como sustrato. Sintetizamos tetra-acetil-, tetralauril-, tetrapalmitoil- y tetraoleil-SGs mediante calentamiento asistido por microondas, logrando buenos rendimientos. Evaluamos la síntesis de derivados de acetilo y oleilo mediante síntesis mecanoquímica, obteniendo buenos rendimientos y reduciendo significativamente el uso de solvente y temperatura. Los productos fueron evaluados frente a células Huh7, demostrando que el derivado de oleilo no es tóxico en las concentraciones evaluadas. Queda pendiente la evaluación in vivo para determinar su viabilidad como sustituto de grasas no calórico. En conclusión, los depósitos de biodiesel representan una nueva fuente de SGs explotable industrialmente. Desarrollamos un método de purificación a escala de kilogramos para obtener productos de alto valor agregado. Obtuvimos fitosteroles de alta pureza mediante distintos ácidos a escala de gramos y demostramos su uso en la obtención de derivados sintéticos. Además, sintetizamos derivados de SGs con ácidos grasos como posibles sustitutos de grasas. Los SGs se constituyen así como una nueva plataforma derivada de soja para el desarrollo de productos de alto valor agregado, especialmente nutracéuticos y sustitutos de grasas no calóricos.

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