(FBIOyF) Posgrado - Tesis
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Ítem Embargo Eventos moleculares que modulan la adquisición de capacidad fecundante del espermatozoide de mamíferos(Universidad Nacional de Rosario. Facultad de Ciencias Bioquímicas y Farmacéuticas, 2025) Gentile, Iñaki; Krapf, Darío; Stival, Cintia EstefaníaEn mamíferos, los espermatozoides recién eyaculados no pueden fecundar al ovocito; deben experimentar un proceso denominado capacitación, que ocurre en el tracto reproductor femenino. Este proceso involucra modificaciones postraduccionales (MPT) de proteínas, ya que los espermatozoides son transcripcional y traduccionalmente inactivos. La capacitación puede inducirse in vitro en medios con HCO₃ ⁻ y Ca²⁺ , que activan la adenilato ciclasa soluble (sAC) y aumentan el AMPc, activando la proteína quinasa A (PKA). La PKA regula múltiples eventos asociados a la capacitación, incluidos cambios en la motilidad y la respuesta acrosómica. La subunidad catalítica de PKA (PKAc) presenta una estructura bilobular: un lóbulo N-terminal (implicado en la unión de ATP) y un lóbulo C-terminal (que contiene el sitio catalítico y de unión al sustrato). En el lóbulo N-terminal destaca el “bucle de glicinas” (G-loop), esencial para coordinar el ATP y su correcta orientación para la transferencia del grupo fosfato. En este trabajo se estudió cómo la acetilación de lisinas en PKAc modula su actividad. La acetilación de lisinas, catalizada por acetiltransferasas y revertida por deacetilasas, es una MPT con un rol regulador en diversas funciones celulares. Recientemente se ha evidenciado que proteínas espermáticas, incluidas subunidades de PKA, presentan acetilaciones que varían con la capacitación. Resultados previos mostraron que la hiperacetilación farmacológica aumenta la fosforilación de sustratos de PKA en espermatozoides de ratón, incluso en ausencia de AMPc. El objetivo principal de la tesis fue dilucidar los mecanismos por los cuales la acetilación de lisinas modula la actividad de PKAc. Para ello, se purificó PKAc recombinante (recPKAc) y se sometió a acetilación in vitro usando extractos de espermatozoides de ratón con acetiltransferasas endógenas. Se utilizaron inhibidores de deacetilasas (TSA y NAM) y Acetil-CoA como donador de grupo acetilo. La acetilación se verificó mediante Western blot y se identificaron tres lisinas acetiladas (Lys168, Lys279 y Lys309) usando espectrometría de masas. La Lys168, ubicada en el bucle catalítico, interacciona con los grupos fosfato β y γ del ATP y es clave para la unión de ATP y la catálisis. Mediante Resonancia Magnética Nuclear (RMN) de recPKAc marcada con 15N se detectaron cambios estructurales tras la acetilación, especialmente en el bucle de glicinas y en el sitio de activación. Esto sugiere que la acetilación induce modificaciones que podrían impactar en la unión de ATP y la catálisis Finalmente, se evaluó la actividad enzimática de recPKAc acetilada y no acetilada usando un ensayo electroforético (KiMSA). La acetilación aumentó significativamente la actividad catalítica de PKAc. Se descartó que este efecto se debiera a variaciones en la fosforilación de la Thr197 (pivotal para la activación en células somáticas). Mediante cinética enzimática se observó que la acetilación disminuye la Km de PKAc para ATP en un orden de magnitud, lo que indicaría mayor afinidad por ATP y, en consecuencia, mayor actividad catalítica. En conjunto, estos resultados sugieren que la acetilación de lisinas modula la actividad de PKAc al alterar su estructura y aumentar su afinidad por ATP, desempeñando un papel clave en la regulación de la capacitación espermática.Ítem Embargo Rol del eje AMPc/PKA en los eventos asociados a la capacitación de espermatozoides de mamíferos(Universidad Nacional de Rosario. Facultad de Ciencias Bioquímicas y Farmacéuticas, 2025) Novero, Analia G.; Krapf, Darío; Buffone, Mariano Gabriel; https://orcid.org/0009-0004-7481-2121La capacitación espermática es un proceso fundamental que deben atravesar los espermatozoides para adquirir capacidad fecundante. Se caracteriza por: 1) un cambio en el patrón de motilidad flagelar (hiperactivación); y 2) la adquisición de la capacidad para sufrir la reacción acrosómica (RA) al exponerse a progesterona. Al incubar espermatozoides en un medio capacitante se estimula la activación temprana de la Proteína Quinasa A (PKA), una Ser/Thr quinasa de amplio espectro involucrada en la regulación de distintos procesos celulares. El adenosín monofosfato cíclico (AMPc), generado al inicio de la capacitación por la adenilato ciclasa soluble (sAC), es el primer eslabón de esta cascada, y su principal blanco es la activación de PKA. PKA es un heterotetrámero compuesto por dos subunidades catalíticas (PKA-C) y dos subunidades regulatorias (PKA-RII), que permanecen unidas en su estado inactivo. La activación de esta enzima depende, en gran parte, de su adecuada localización en regiones subcelulares específicas. En este contexto, las proteínas de anclaje a PKA (AKAPs) actúan como andamiajes para la formación de microdominios de señalización, restringiendo la actividad de PKA a sitios determinados. A pesar de los avances en el estudio de PKA, aún no se comprende completamente qué ocurre con sus subunidades cuando el AMPc se une a las subunidades regulatorias. Existen dos modelos que podrían explicar su activación: el modelo de disociación y el modelo de no disociación. Dado que los procesos mediados por PKA son esenciales para la adquisición de la competencia fecundante, comprender cómo esta quinasa se regula en el espacio y el tiempo es crucial para dilucidar los pasos de la capacitación espermática. En primer lugar, nos propusimos desarrollar un método sencillo, robusto y confiable para medir la actividad de PKA. Por otro lado, aunque numerosos estudios han abordado el rol de esta quinasa en la capacitación, aún no se conoce con exactitud la totalidad de eventos moleculares que regula ni su localización precisa en el espermatozoide tras este proceso. Por ello, resulta fundamental determinar la ubicación de sus subunidades y su interacción con proteínas de anclaje, lo que permitirá identificar los diferentes signalosomas en los que PKA actúa y los eventos que regula, ya sea directa o indirectamente. Dentro de los cambios moleculares claves que suceden tras la capacitación se encuentra también la hiperpolarización del potencial de membrana plasmática (Em), un evento asociado a la RA. SLO3 es el canal de potasio responsable de este evento, es un canal sensible a pH y experimentos utilizando como farmacología inhibitoria H89, han vinculado a PKA con este proceso. Además, se ha observado que ratones knockout (KO) para el canal de potasio específico de espermatozoides SLO3 no hiperpolarizan su Em y son infértiles. En esta tesis, investigamos el mecanismo molecular que dispara la hiperpolarización de la membrana plasmática en los espermatozoides, ya sea antes o después de la activación de PKA. Para ello, utilizamos espermatozoides murinos wildtype (WT) y transgénicos (KO) como modelos experimentales. Aplicamos inhibidores farmacológicos específicos para sAC y PKA, así como análogos permeables de AMPc. Para determinar las concentraciones óptimas de estos compuestos, realizamos ensayos de Western Blot (WB) y actividad de PKA mediante el método “KiMSA” (versatile kinase mobility shift assay), desarrollado en nuestro laboratorio y explicado en el primer capítulo de esta tesis. Luego, de los distintos tratamientos, evaluamos el potencial de membrana mediante fluorimetría poblacional utilizando el fluoróforo DISC 3,5 para tal fin. Sorprendentemente, encontramos que la inhibición de PKA con sPKI no impide la hiperpolarización del potencial de membrana (Em). En contraste, la inhibición con H89 bloquea este proceso, pero dicho efecto es reversible mediante el análogo de AMPC, 8Br-AMPc, lo que confirma la inespecificidad de H89, cuyo mecanismo de acción es la competencia con ATP. Estos resultados nos permitieron descartar que la actividad catalítica de PKA sea un requisito para la hiperpolarización. Sin embargo, nuestros hallazgos sugieren que el AMPc está directamente involucrado en la activación de SLO3, ya que análogos permeables de este nucleótido promueven la hiperpolarización, mientras que inhibidores de su producción, como TDI10220, bloquean este efecto. En conjunto, estos resultados respaldan la hipótesis de que el AMPc regula el potencial de membrana a través de un blanco distinto a la PKA. Exploramos distintos análogos de AMPc para identificar el target responsable de la hiperpolarización. Se encontró que el intercambiador Na+/H+(sNHE), especifico de espermatozoides, cuya función principal es alcalinizar el interior celular y que, además, posee un sitio de unión a AMPc es un eslabón crucial en este proceso. Ratones KO para sNHE no logran hiperpolarizar, y esta deficiencia no se revierte con análogos de AMPc como 8Br AMPc o db-AMPc, pero sí con alcalinización farmacológica, lo que sugiere que SLO3 se activa mediante la alcalinización inducida por sNHE. Además, descubrimos que la acción de sNHE no es independiente, ya que otro intercambiador, NHE1, también participa en este proceso. Este segundo intercambiador, cuya función se desconoce bastante, podría ser activado por calcio ya que posee un sitio de unión a calcio/calmodulina. Analizamos el papel del calcio en la hiperpolarización y observamos que los espermatozoides de ratones KO para CatSper I no logran hiperpolarizar su membrana, pero recuperan el fenotipo tras la inducción de alcalinización farmacológica. Estos hallazgos demuestran un rol dual de ambos intercambiadore, activados por AMPc o por calcio, necesarios para el umbral de alcalinización requerida para la activación de SLO3. Aunque descartamos el rol catalítico de PKA en la hiperpolarización, estudios publicados anteriormente, resaltan la importancia de su localización subcelular específica para que ocurran eventos asociados a la capacitación. En consecuencia, nuestro siguiente objetivo fue detallar la localización de las subunidades catalíticas y regulatorias de PKA durante la capacitación espermática y su asociación con AKAPs, con énfasis en AKAP4, el AKAP predominante en espermatozoides. Mediante microscopía confocal con detector Airyscan y superresolución (DNAPAINT), analizamos la ubicación de PKA-RII, PKA-C y AKAP4 en espermatozoides capacitados y no capacitados. Encontramos que las subunidades regulatorias y catalíticas se separan drásticamente durante la capacitación: PKA-C se localiza en el centro del flagelo, mientras que PKA-RII migra hacia la periferia, donde se encuentra AKAP4. No se detectó asociación entre PKA y AKAP4 en espermatozoides no capacitados, lo que sugiere la posible existencia de otros AKAPs o proteínas de anclaje en el estado inactivo de PKA. Además, PKA-RII se redistribuyó en la vaina fibrosa (FS) en una conformación de cuatro columnas, coincidente con la ubicación del canal CatSper. En espermatozoides KO para CatSper, esta estructura se perdió, lo que sugiere que CatSper es crucial para la relocalización de PKA-RII y que esta subunidad podría desempeñar un papel en la señalización dentro de esta región clave para la capacitación espermática. En base a los resultados obtenidos, concluimos que: 1) El AMPc es esencial para la activación del canal de potasio SLO3, pero su acción no está mediada por la actividad catalítica de PKA. 2) La hiperpolarización de la membrana espermática requiere la acción coordinada de dos intercambiadores de Na⁺/H⁺, sNHE y NHE1. 3) La localización subcelular de las subunidades de PKA cambia drásticamente durante la capacitación espermática. 4) La presencia del canal CatSper es fundamental para la correcta relocalización de PKA-RII.Ítem Embargo Rol de la presentación cruzada de antígenos en la generación de la respuesta inmunitaria contra el parásito Trypanosoma cruzi(Universidad Nacional de Rosario. Facultad de Ciencias Bioquímicas y Farmacéuticas, 2025) Biscari, Lucía; Alloatti, Andrés; Pérez, Ana R.La enfermedad de Chagas, causada por el protozoo intracelular Trypanosoma cruzi, constituye un importante problema de salud pública en América Latina y, debido a los movimientos migratorios, también en regiones no endémicas. A más de un siglo de su descubrimiento, no existe una vacuna aprobada para su prevención o tratamiento, y las terapias actuales presentan limitaciones en eficacia y toxicidad, especialmente en la fase crónica. La activación de linfocitos T CD8⁺ es clave para el control del parásito, por lo que comprender los mecanismos que inducen esta respuesta, en particular la presentación cruzada de antígenos por moléculas del complejo principal de histocompatibilidad clase I, reviste importancia tanto básica como aplicada. El objetivo general de esta tesis fue profundizar en los mecanismos que subyacen a la activación de linfocitos T CD8⁺ específicos frente a T. cruzi, con énfasis en la presentación cruzada por células dendríticas, y evaluar plataformas vacunales experimentales capaces de inducir respuestas inmunitarias protectoras mediadas por estos linfocitos. En el Capítulo 1 se analizó la relevancia funcional de la presentación cruzada dependiente de Sec22b en la respuesta frente a T. cruzi. Empleando un modelo murino con deleción específica de Sec22b en células dendríticas, se observó una menor activación de linfocitos T CD8⁺, asociada a mayor parasitemia y susceptibilidad a la infección. Además, se evidenció el reclutamiento de proteínas clave de la maquinaria de presentación cruzada (LAMP-1, calreticulina y tapasina) a la vacuola parasitófora, lo que apoya su posible participación en esta vía. El Capítulo 2 exploró una estrategia profiláctica basada en la transferencia adoptiva de células dendríticas derivadas de médula ósea activadas con LPS y cargadas ex vivo con el epítope inmunodominante TsKb20, derivado de transialidasas de T. cruzi. Esta inmunización generó una respuesta robusta de linfocitos T CD8⁺ específicos, productores de IFN-γ y con desarrollo de memoria efectora. Aunque la protección fue parcial y restringida a hembras, el modelo demostró ser útil para evaluar epítopes candidatos. En el Capítulo 3, se diseñó una estrategia vacunal con mayor potencial traslacional, basada en el direccionamiento antigénico in vivo mediante conjugados péptido-anticuerpo específicos para Clec9A, receptor expresado en células dendríticas convencionales de tipo 1, subpoblación clave para el inicio de respuestas inmunitarias frente a patógenos intracelulares. Esta formulación, combinada con el adyuvante Poly I:C, generó una población de linfocitos T CD8+ específicos con fenotipo efector, evidenciado por el aumento en la expresión de marcadores de activación y la producción de citoquinas tipo Th1, así como memoria efectora, y mostró una tendencia a la protección parcial frente a la infección aguda. En conjunto, los resultados destacan el rol de la presentación cruzada en la activación de linfocitos T CD8⁺ frente a T. cruzi y apoyan el desarrollo de vacunas racionales basadas en epítopes seleccionados mediante enfoques in silico o inmunopeptidómicos, con potencial aplicación terapéutica y/o preventiva frente a la enfermedad de Chagas.Ítem Embargo Reguladores transcripcionales tipo MlrA de Salmonella implicados en la formación de biopelículas y en virulencia(Universidad Nacional de Rosario. Facultad de Ciencias Bioquímicas y Farmacéuticas, 2025) Tulin, Gonzalo; Soncini, Fernando C.Salmonella Typhimurium es un patógeno relevante para la salud pública debido a su capacidad de causar infecciones intestinales y sistémicas, así como a su habilidad para persistir en el ambiente mediante la formación de biopelículas (Hall-Stoodley et al., 2004; Scherer & Miller, 2001; Waldner et al., 2012) . Estas estructuras multicelulares están compuestas principalmente de curli y celulosa, componentes clave de la matriz extracelular cuya síntesis está regulada por CsgD, un activador transcripcional maestro (Gerstel & Römling, 2003; Römling et al., 2000). Aunque el principal regulador de CsgD es MlrA (P. K. Brown et al., 2001), en este trabajo se investigó a STM1266, un miembro de la familia MerR específico de Salmonella (McClelland et al., 2001), para dilucidar su rol en la formación de biopelículas y la respuesta adaptativa a diferentes condiciones ambientales. En el primer capítulo, se caracterizó estructural y funcionalmente a STM1266, demostrando que este regulador es inducido en condiciones de bajas temperaturas y limitación de nutrientes. Mediante análisis estructurales, se identificaron similitudes con MlrA en su dominio N-terminal, mientras que la región C-terminal presenta divergencias que podrían explicar su especialización funcional. Ensayos fenotípicos revelaron que STM1266 modula la formación de biopelículas promoviendo la producción de curli y celulosa en condiciones óptimas, favoreciendo además la transición hacia un estilo de vida sésil mediante la supresión de la motilidad tipo swimming. Adicionalmente, los resultados destacaron la dependencia parcial de STM1266 de MlrA y CsgD, aunque también se observaron efectos independientes, lo que sugiere la existencia de rutas reguladoras alternativas. En paralelo se logró la expresión y purificación de la región Cterminal de STM1266 para la generación de anticuerpos específicos, los cuales permitieron evaluar su expresión y función en distintas condiciones. En el segundo capítulo, se exploraron los genes regulados por STM1266 mediante mutagénesis al azar y análisis transcriptómicos. Utilizando una mutagénesis con el transposón MudJ observamos que STM1266 regula la expresión de bapA (Latasa et al., 2005b), y lo hace de manera independiente de CsgD, lo que resalta su versatilidad como regulador. Mediante RNA-Seq se identificaron 151 genes activados y 46 reprimidos, incluyendo aquellos relacionados con la producción de matriz extracelular (csgA, csgB), metabolismo de purinas y pirimidinas, y respuesta al estrés. Además, se identificó que STM1266 puede modular la producción de curli tanto de forma dependiente como independiente de CsgD, expandiendo su impacto en la formación de biopelículas bajo diferentes condiciones ambientales. Estos resultados posicionan a STM1266 como un regulador clave en la reprogramación del estilo de vida de Salmonella Typhimurium, integrando señales ambientales para conectar la formación de biopelículas con procesos adaptativos y metabólicos esenciales, proporcionando nuevos conocimientos sobre la regulación transcripcional en Salmonella, destacando el papel de STM1266 en la adhesión bacteriana, la adaptación metabólica y la persistencia en entornos desafiantes, sentando las bases para futuras investigaciones y estrategias de control antimicrobiano.Ítem Embargo Impacto de la síntesis de ácidos grasos insaturados y de la movilización de colesterol en la biología de Caenorhabditis elegans(Universidad Nacional de Rosario. Facultad de Ciencias Bioquímicas y Farmacéuticas, 2025) Battista, Bernabé; De Mendoza, Diego; Binolfi, AndrésEl interés en el metabolismo lipídico ha aumentado significativamente en los últimos años, especialmente desde que desregulaciones en el mismo se han asociado con patologías como obesidad, ateroesclerosis, diabetes, enfermedades neurodegenerativas y cardiovasculares. Según la Organización Mundial de la Salud, estás ultimas son la principal causa de muerte en el mundo, siendo uno de sus factores de riesgo principales la alimentación poco saludable. Por este motivo, comprender el papel activo que desempeñan los lípidos en la fisiología celular y su influencia en la regulación de la homeostasis energética se ha vuelto particularmente relevante. Un modelo animal atractivo para estudiar metabolismo lipídico es el gusano redondo Caenorhabditis elegans. Mejor conocido por su utilidad para análisis genéticos, este organismo modelo es de fácil mantenimiento en el laboratorio, su genoma está completamente secuenciado y tiene un ciclo de vida corto que, entre otras características, lo convierten en un organismo ideal para comprender procesos biológicos como aquellos relacionados con la salud humana. Si bien los nemátodos son capaces de sintetizar diferentes tipos de lípidos, muchos de ellos aún son desconocidos. Hasta la fecha, la investigación en el campo de los lípidos en C. elegans se ha enfocado principalmente en la caracterización de los genes involucrados en la biosíntesis, almacenamiento y degradación, así como aquellos que cumplen funciones regulatorias. Además, se han estudiado las consecuencias neurológicas que surgen cuando algunos de estos compuestos no se sintetizan correctamente. Por este motivo, en este trabajo nos propusimos entender el rol que desempeñan los ácidos grasos y el colesterol sobre la biología de C. elegans. Los ácidos grasos insaturados (UFAs) pueden ser monoinsaturados (MUFAs) conteniendo un doble enlace C-C, o poliinsaturados (PUFAs) conteniendo dos o más dobles enlaces C-C. El nemátodo C. elegans se diferencia de la mayoría de los animales por tener la capacidad de producir una gran variedad de UFAs empleando acetil-CoA como precursor. La biosíntesis de UFAs depende de la conversión de ácidos grasos saturados a insaturados mediada por la actividad de las enzimas desaturasas ∆9. Los nemátodos cuentan con 3 genes que codifican para estas enzimas, fat-5 (palmitoil-CoA ∆9 desaturasa), fat-6 y fat-7 (estearoil-CoA ∆9 desaturasas). La vía de síntesis de UFAs en C. elegans comienza con el ácido palmítico (16:0), obtenido de la dieta de E. coli o sintetizado de novo, el cual es convertido en ácido palmitoleico (16:1 ∆9) por FAT-5. El ácido palmítico (16:0) también puede ser elongado a ácido esteárico (SA, 18:0), el sustrato para la desaturación por FAT-6 y FAT-7 hacia ácido oleico (OA, 18:1 ∆9), siendo este último el precursor de todos los PUFAs que produce C. elegans. Debido a que la actividad desaturasa ∆9 es esencial, un nemátodo mutante fat-6-(-); fat-5-(-);fat-7-(-) es inviable, por lo que en nuestro laboratorio desarrollamos una mutante condicional que puede ser depletada de UFAs en el estadio larval deseado. Para la construcción de esta mutante empleamos el sistema degron inducible por auxina (AID), originario de Arabidopsis thaliana, que recientemente fue adaptado para su uso en C. elegans. Para esto, sobre un trasfondo genético fat-6-(-);fat-5-(-) editamos el gen fat-7, mediante CRISPR-Cas9, adicionándole una secuencia de reconocimiento para su degradación en el proteasoma que es inducible por auxina. De esta manera, suplementando el medio de crecimiento con esta hormona vegetal podemos interrumpir la síntesis de UFAs en el soma de esta cepa, que llamamos DDM6. Para poder entender las consecuencias fisiológicas de la falta de UFAs realizamos una caracterización funcional de DDM6. Descubrimos que la depleción de estos lípidos produce arresto larval en los estadios L1 y L2, pero no en L3 o L4 que logran alcanzar la adultez, sugiriendo un rol esencial de la síntesis de OA para la transición a la adultez desde los primeros estadios larvales. Mediante GC-MS y RMN de extractos de lípidos demostramos que la reducción observada en los UFAs que exhiben los gusanos tratados con auxina se debe a una disminución acentuada de los PUFAs más que de los MUFAs. Además, esta depleción de FAT-7 interfiere con los depósitos de grasas al disminuir el tamaño y la cantidad de triacilgliceroles almacenados en las gotas lipídicas, lo cual evidenciamos mediante microscopía de fluorescencia y RMN de gusanos vivos enriquecidos isotópicamente con 13C. Finalmente, mostramos que la exposición a auxina de los gusanos DDM6 induce esterilidad de manera reversible, lo cual se demuestra por la marcada reducción en la progenie producida autónomamente por los gusanos hermafroditas. Con el fin de entender las causas biológicas responsables de la reducción en la fertilidad observada en gusanos DDM6 expuestos a auxina, realizamos una serie de ensayos bioquímicos que nos facilitaron evaluar ciertos marcadores de desarrollo germinal. Encontramos que la deficiencia de UFAs induce alteraciones mitóticas y meióticas en la línea germinal. Por otro lado, mediante ensayos de inmunohistoquímica descubrimos que un contexto de baja desaturación ∆9 conduce a la formación de estructuras de membrana aberrantes y altera la correcta formación del complejo de poro nuclear en la línea germinal. Sin embargo, no encontramos evidencia de que la falta de UFAs induzca apoptosis o alterare la correcta segregación de los cromosomas homólogos en la línea germinal. Por último, en este proyecto de tesis nos propusimos entender como el transporte de colesterol influye sobre la fisiología de C. elegans. El colesterol, además de ser un componente estructural de las membranas celulares, es el precursor de hormonas esteroideas y ácidos biliares, volviéndolo esencial para el desarrollo y la salud. Debido a que tanto el exceso como la falta de colesterol son perjudiciales para la salud, gran cantidad de procesos regulatorios han evolucionado para controlar vías metabólicas de involucran esteroles. A diferencia de lo que ocurre con mamíferos, C. elegans es auxótrofo para colesterol por lo que requiere un suplemento dietario constante para sobrevivir. En los nemátodos este esterol es requerido para el crecimiento y la progresión por los diferentes estadios larvales. Además, el colesterol regula el ingreso a un estadio de diapausa especializado que permite la supervivencia bajo condiciones desfavorables llamado larva dauer. Los esteroles que regulan la formación de la larva dauer son moléculas similares a los ácidos biliares denominados ácidos dafacrónicos (ADs). Estos inhiben el estado dauer al unirse a un receptor hormonal nuclear llamado DAF-12, que en ausencia de ADs activa el programa dauer. Tras la ingesta de colesterol, la distribución vesicular de este lípido en C. elegans es mediada por varios sistemas de transporte, incluyendo las vitelogeninas. Después de la endocitosis mediada por receptores de los transportadores de colesterol, este es transportado a través del sistema endolisosomal y dirigido a otros compartimentos celulares con la ayuda de los homólogos del transportador tipo Niemann-Pick C1 (NPC1), NCR-1;NCR-2. A pesar del conocimiento actual sobre estos circuitos, varios aspectos de las vías involucradas en el transporte y la distribución del colesterol en C. elegans aún no se han elucidado. Durante la última década, estudios en líneas celulares o fibroblastos, han mostrado que transportadores como las proteínas esteroidogénicas reguladoras agudas (StAR) y los dominios de transferencia de lípidos relacionados con StAR (START) en los sitios de contacto de membrana proporcionan una vía importante para la transferencia de colesterol del sistema endosomal-lisosomal a otras organelas celulares. Para mejorar nuestra comprensión del transporte de esteroles en C. elegans, realizamos investigaciones estructurales y funcionales de TAG-340, un ortólogo de la proteína humana STARD3, que une esteroles y genera sitios de contacto entre los endosomas/lisosomas y el retículo endoplásmico o mitocondrias. Utilizamos técnicas de dicroísmo circular y resonancia magnética nuclear para examinar la unión del colesterol, y también determinamos la estructura del dominio START de TAG-340/STARD3 mediante cristalografía de rayos X. Elucidamos las estructuras cristalinas del dominio STAR solo y en complejo con colesterol, lo que proporcionó información valiosa sobre el mecanismo de unión del lípido. También descubrimos que el silenciamiento por ARNi de TAG-340 intensifica el arresto dauer en el desarrollo de los dobles mutantes ncr-2-(-);ncr-1-(-), lo que indica que TAG-340/STARD3 está involucrada en la regulación del transporte intracelular de colesterol en C. elegans. En general, nuestros resultados demuestran la primera estructura cristalina de un dominio START en complejo con colesterol y proporcionan evidencia de que TAG-340/STARD3 funciona como una proteína de transferencia de lípidos y participa en el flujo vesicular de colesterol en C. elegans.Ítem Embargo Síntesis, modulación y conjugación de sistemas heterocíclicos dirigidos a la obtención de compuestos con diversos puntos de interacción biológica(Universidad Nacional de Rosario. Facultad de Ciencias Bioquímicas y Farmacéuticas, 2025) Permingeat Squizatto, Caterina; Delpiccolo, Carina M. L.; La Venia, AgustinaLos carbenos metálicos, obtenidos tradicionalmente a partir de la descomposición catalizada por metales de compuestos diazo, han demostrado ser herramientas fundamentales en la síntesis orgánica. Sin embargo, las limitaciones asociadas a los diazocompuestos, como su alta reactividad, inestabilidad y riesgos operativos, han impulsado la búsqueda de alternativas más seguras y versátiles. En este contexto, los N-sulfonil-1,2,3-triazoles han emergido como precursores eficaces de carbenos metálicos, gracias a su facilidad de síntesis mediante cicloadición azida-alquino catalizada por cobre(I). En nuestro estudio, sintetizamos un tosiltriazol modelo utilizando distintas metodologías. Los resultados demostraron que el catalizador CuTC ofrece altos niveles de conversión y selectividad, superando ampliamente a otros complejos de cobre(I). Con el tosiltriazol como modelo, exploramos su reactividad frente a alquenos utilizando octanoato de rodio(II) (Rh2(Oct)4) como catalizador, con el objetivo de generar selectivamente 2,3-dihidropirroles. Este tipo de heterociclos es de gran interés debido a su ubicuidad en productos bioactivos y su relevancia farmacéutica. Durante la optimización de las condiciones de reacción, identificamos factores críticos como la temperatura, el solvente y la concentración. Logramos obtener 2,3-dihidropirroles con rendimientos de moderados a muy buenos bajo condiciones optimizadas, minimizando subproductos resultantes de la hidrólisis del carbeno. Además, evaluamos la influencia de diferentes alquenos, observando que los estirenos con grupos donadores de electrones en posición para u orto presentaban mejores rendimientos en la formación de los productos deseados. Asimismo, desarrollamos metodologías complementarias para la obtención selectiva de ciclopropiliminas. Estas moléculas mostraron configuración trans, confirmada mediante RMN NOESY 1-D y cálculos computacionales (DFT). Posteriormente, se llevó a cabo su transformación en aldehídos y aminas con potencial aplicación en química medicinal y de síntesis. Estas estructuras intermedias también abren la posibilidad de explorar nuevas rutas sintéticas para la generación de bibliotecas moleculares diversificadas. Además, investigamos la síntesis de 2,3-dihidropirroles enantioméricamente enriquecidos, relevantes en farmacología y ciencia de materiales. Se exploraron dos enfoques: el uso de catalizadores quirales de dirodio(II) y el empleo de un sustrato quiral derivado de la oxazolidinona de Evans. Los resultados obtenidos evidenciaron el potencial de ambas estrategias para inducir quiralidad en la estructura del 2,3-dihidropirrol, aunque también revelaron ciertas limitaciones en el control estereoquímico bajo las condiciones estudiadas. Se reconoce que factores como el tamaño y la naturaleza del precursor de carbeno, así como la estructura del catalizador o del sustrato, influyen de forma decisiva en la eficiencia y selectividad del proceso. A lo largo del proyecto y ya contando con más experiencia en este tipo de química, implementamos estrategias one-pot que integraron múltiples etapas de reacción, mejorando los rendimientos globales y simplificando los procesos experimentales al evitar el aislamiento de intermedios. Además, realizamos reacciones libres de solventes, las cuales demostraron ser igualmente eficientes y permitieron un escalado exitoso sin pérdida de rendimiento. Luego, estudiamos la reacción de los carbenos de Rh(II) con nucleófilos alternativos. Hemos sido capaces de utilizar nuestras condiciones óptimas de reacción para la síntesis de estructuras diversas, como oxazolinas, pirroles y tiazoles. Particularmente, profundizamos el estudio de la reacción con amidas secundarias, generando estructuras indólicas altamente funcionalizadas. Este hallazgo representa un avance significativo, ya que los compuestos indólicos son esenciales en la química de productos naturales y el diseño de fármacos. También se identificó la influencia crítica del solvente en la selectividad de estas reacciones, lo que aporta información valiosa para futuros estudios. Por otro lado, evaluamos la aplicabilidad de las metodologías desarrolladas mediante la funcionalización de los productos obtenidos con moléculas bioactivas conocidas, utilizando la técnica de hibridación molecular. En este contexto, combinamos 2,3-dihidropirroles y ciclopropiliminas con productos naturales bioactivos como el L-mentol y la deshidroepiandrosterona (DHEA), obteniendo híbridos funcionalizados con rendimientos de moderados a buenos en forma de mezcla diastereoisomérica. Además, se estudió la actividad antiproliferativa de una selección representativa de los compuestos sintetizados, mediante ensayos in vitro frente a la línea celular tumoral B16-F0 (melanoma murino) y la línea no tumoral NMuMG (epitelio mamario murino), lo que permitió evaluar tanto la potencia como la selectividad de los compuestos. Algunos derivados demostraron una inhibición significativa del crecimiento celular en la línea tumoral, con baja citotoxicidad sobre células normales. Estos resultados preliminares destacan el potencial bioactivo de las estructuras obtenidas y subrayan la importancia de continuar explorando la relación estructuraactividad para optimizar el diseño de nuevas entidades con aplicaciones terapéuticas. Por último, diseñamos una ruta sintética para la obtención del tosiltriazol en fase sólida, marcando un avance hacia el desarrollo de precursores de carbenos sobre soporte polimérico. Aunque se logró sintetizar el tosiltriazol, la limitación actual radica en la comprobación directa de su formación utilizando técnicas espectroscópicas avanzadas, lo cual representa un objetivo prioritario para estudios futuros. En conclusión, este trabajo no solo expande el conocimiento sobre la química de carbenos de rodio derivados de sulfoniltriazoles, sino que también proporciona herramientas y estrategias innovadoras para la síntesis de compuestos de alto valor agregado con potencial impacto en la química medicinal y el desarrollo de nuevos fármacos.Ítem Embargo Hepatitis E, un virus emergente: desarrollo de herramientas diagnósticas, análisis del escenario epidemiológico en la zona núcleo maicera de Argentina y su impacto en pacientes inmunosuprimidos(Universidad Nacional de Rosario. Facultad de Ciencias Bioquímicas y Farmacéuticas, 2025) Acosta, Julián; Cavatorta, Ana Laura; Marziali, Federico EmanuelEl Virus de la Hepatitis E (HEV), de transmisión entérica, es uno de los principales agentes causantes de hepatitis aguda en todo el mundo, con cuatro genotipos principales (HEV-1 a 4) que afectan a los humanos. Es considerada una zoonosis emergente, que se disemina principalmente a través de los alimentos en los países en desarrollo y/o con pobres condiciones sanitarias. La Organización Mundial de la Salud (OMS) estima que anualmente se registran más de 20 millones de infecciones y 40.000 fallecimientos, lo que la posiciona como una de las principales causas de mortalidad por hepatitis aguda de origen viral en el mundo, constituyendo un desafío significativo para la Salud Pública. En este contexto, la complejidad del problema demanda una gestión integrada que contemple la salud humana, animal y ambiental, bajo el concepto de Una Salud. El desconocimiento de la verdadera magnitud de la infección y la ausencia de herramientas diagnósticas confiables representan un problema concreto para grupos de riesgo como los pacientes inmunosuprimidos o con hepatopatías crónicas. Con un mejor conocimiento del peso de la infección y las vías de transmisión en nuestra población, y disponiendo de metodologías diagnósticas eficaces, dicho riesgo podría reducirse. Por lo tanto, el objetivo general de esta tesis consistió en optimizar técnicas sensibles y específicas que aporten a mejorar el diagnóstico y monitoreo del virus en poblaciones humanas, animales y en el medioambiente, promoviendo el desarrollo y aplicación de tecnología regional. En primer lugar, optimizamos una reacción en cadena de la polimerasa con transcripción inversa en tiempo real (RT-qPCR) con control interno, para aumentar la performance de las metodologías utilizadas actualmente en nuestro medio. Los resultados obtenidos subrayan la relevancia de haber logrado desarrollar una metodología superadora a la utilizada en la mayoría de los laboratorios bioquímicos y reportes académicos de Argentina, a la cual denominamos HEV/MS2 dúplex RT-qPCR, aportando ventajas en relación al diagnóstico de la infección. Posteriormente, al disponer de esta herramienta demostramos la circulación del HEV en cerdos de establecimientos comerciales localizados en distintos lugares de la zona núcleo maicera de nuestro país, lo que resulta clave considerando que estos animales representan uno de los principales reservorios del virus y el crecimiento de la producción porcina en nuestra región. Por otro lado, considerando la relevancia clínica de la infección por HEV, realizamos un estudio en individuos inmunocomprometidos por diversas etiologías. Asimismo, efectuamos el seguimiento de una cohorte de pacientes con enfermedad hepática crónica durante dos años. Los resultados obtenidos confirmaron el mayor impacto de la infección en estos grupos vulnerables, en comparación con las poblaciones control y general. Al mismo tiempo, resaltaron la importancia de considerar el contexto epidemiológico como un factor clave en la infección por HEV en nuestra región. Otro aspecto para destacar de este trabajo de tesis es que, por primera vez en Argentina, logramos demostrar un vínculo epidemiológico en un productor porcino que desarrolló hepatitis aguda debido a una infección por HEV. Este hallazgo confirma la transmisión zoonótica viral y respalda la asociación entre exposiciones ocupacionales y el mayor riesgo de contraer hepatitis E. Finalmente, y una vez demostrada la circulación de HEV en la región, tanto en animales como en humanos, decidimos profundizar el estudio de esta zoonosis bajo el enfoque de Una Salud. Por ello, planteamos como último objetivo sentar las bases para evaluar el escenario epidemiológico del HEV en el medioambiente, específicamente en matrices acuosas, con la hipótesis de que el agua puede actuar como una fuente de diseminación viral. En este sentido, desarrollamos una técnica de concentración de partículas virales con la incorporación de un control interno, la cual fue validada en aguas de distintos orígenes, obteniendo resultados reproducibles y dentro del rango de sensibilidad del ensayo. En conclusión, esta metodología representa una alternativa sensible, reproducible y de bajo requerimiento instrumental para la detección del HEV en el ambiente. En función de lo expuesto, este trabajo de tesis resalta la importancia de haber conformado un equipo multidisciplinario integrado por profesionales de las áreas de salud humana, animal y ambiental. Este enfoque colaborativo permitió la generación de nuevos conocimientos, aportando de manera significativa a la comprensión del escenario epidemiológico del HEV en nuestra región.Ítem Embargo Estudio de las propiedades fisicoquímicas, estructurales y funcionales de sistemas compuestos por proteínas de quinua y sus hidrolizados, alginato y ácidos grasos monoinsaturados para el diseño de alimentos funcionales(Universidad Nacional de Rosario. Facultad de Ciencias Bioquímicas y Farmacéuticas, 2025) Lingiardi, Nadia; Spelzini, Darío; Galante, MicaelaEl objetivo del presente trabajo fue desarrollar y caracterizar emulsiones gelificadas a partir de concentrados de proteína de quinua (CPQ) y sus hidrolizados (HPQ), alginato de sodio y ácidos grasos monoinsaturados. Se obtuvieron CPQ por el método de precipitación isoeléctrica. Se formularon emulsiones gelificadas (EG) con 0,5; 1 y 2% p/v de CPQ, 0,5% p/v de alginato de sodio y 10, 30 y 50% v/v de fracción de volumen de aceite de girasol alto oleico. La gelificación se realizó mediante el empleo de membranas de diálisis con CaCl2 (5% p/v) como agente gelificante. Se estudió el efecto de la concentración de CPQ y de la fracción de volumen de aceite sobre las propiedades fisicoquímicas y mecánicas de las EG formuladas. Se evaluó, además, la microestructura, color y capacidad de retención de agua, así como la estabilidad térmica y física de estos sistemas. Por otro lado, el CPQ fue hidrolizado con alcalasa. Los HPQ resultantes fueron evaluados por sus propiedades funcionales y biológicas. Se determinó la hidrofobicidad superficial, la capacidad emulsionante, la actividad quelante de hierro y su poder reductor, así como la actividad antibacteriana. Finalmente se formularon y caracterizaron emulsiones gelificadas a base de HPQ (0,5; 1 y 2% p/v), 1% p/v de alginato de sodio y 30% v/v de fracción de volumen de aceite de girasol alto oleico (EGH). Se evaluaron sus propiedades fisicoquímicas, mecánicas, reológicas y antioxidantes mediante los métodos de ABTS y DPPH. El análisis mostró que la concentración de CPQ y la fracción de volumen de aceite impactaron sobre las propiedades de las EG. Un aumento en la concentración de CPQ redujo el tamaño de las gotas de aceite, mientras que la dureza del gel aumentó con mayores concentraciones de proteína y aceite. El tratamiento térmico disminuyó la capacidad de retención de agua de las EG, a bajas fracciones de volumen de aceite. Además, las EG mostraron estabilidad frente al cremado. Por otro lado, la hidrólisis de los CPQ con alcalasa mejoró la hidrofobicidad superficial y las propiedades emulsionantes de las proteínas de quinua; los HPQ (grado de hidrólisis 30±4%) mostraron mayores índices de actividad emulsionante y de estabilidad de la emulsión en comparación con la proteína sin hidrolizar. Asimismo, este estudio demostró que los HPQ tienen potencial para ser utilizados en la formulación de EGH. Aunque la hidrólisis produjo una reducción significativa en la capacidad de retención de agua de los sistemas, en todas las muestras evaluadas este parámetro fue de alrededor del 70%. Los parámetros de textura también indicaron que las EGH resultaron autosustentables y podrían aplicarse en la formulación de alimentos semisólidos. Las proteínas de quinua afectaron las propiedades texturales de las EGH; la hidrólisis proteica disminuyó la dureza de los sistemas sin afectar su capacidad de recuperación y adhesividad. Las EGH demostraron actividad antioxidante significativa, lo que las posiciona como ingredientes funcionales para fortificación de alimentos y protección contra la oxidación. Tanto las EG como las EGH mostraron un comportamiento reológico típico de sólido viscoelástico en un amplio rango de frecuencias y temperaturas ensayado, lo que las hace adecuadas para aplicaciones industriales en alimentos semisólidos de origen vegetal En conclusión, este trabajo revela el gran potencial de las proteínas de quinua y sus hidrolizados para la formulación de emulsiones gelificadas, destacando sus propiedades funcionales y biológicas prometedoras para el desarrollo de productos alimentarios innovadores y saludables. La combinación de proteínas de quinua, alginato y aceite de girasol alto oleico resulta en sistemas altamente estables que podrían ser aplicados en productos alimentarios que requieran atributos texturales y reológicos específicos. Además, exhiben propiedades antioxidantes y emulsionantes mejoradas, especialmente cuando se emplean proteínas hidrolizadas, lo que las hace atractivas para la formulación de productos semisólidos de origen vegetal con valor agregado.Ítem Embargo Síntesis, caracterización y evaluación de la actividad de catalizadores biomiméticos de peroxidasas con potencial aplicación en la despolimerización oxidativa de lignina(Universidad Nacional de Rosario. Facultad de Ciencias Bioquímicas y Farmacéuticas, 2025) Ferreyra, Joaquín; Signorella, Sandra R.La lignina es el biopolímero más abundante en la naturaleza después de la celulosa. Por su estructura química, constituye la principal fuente renovable de unidades aromáticas presente en la naturaleza, lo que la posiciona como una alternativa sustentable para la producción de compuestos químicos y combustibles actualmente derivados de recursos fósiles. Sin embargo, su valorización industrial sigue siendo un desafío, y en la mayoría de los procesos continúa siendo tratada como subproducto de bajo valor principalmente destinado a la generación de energía. La existencia de metaloenzimas ligninolíticas en la naturaleza ha motivado el desarrollo de sistemas catalíticos basados en complejos de coordinación. Frente a la escasez de estudios sistemáticos que exploren en profundidad los factores electrónicos y estructurales responsables de la actividad catalítica observada en estos sistemas, en esta Tesis Doctoral se propuso reproducir la función catalítica de las peroxidasas –uno de los principales grupos de enzimas ligninolíticas– mediante complejos metálicos biomiméticos, tanto en fase homogénea como inmovilizados sobre un soporte mesoporoso, y evaluarlos como catalizadores en la oxidación por H2O2 de diferentes modelos estructurales de lignina. Se sintetizaron y caracterizaron una serie de complejos de Cu, Mn y Co con sitios donores de tipo N2O2 y N4, cuyas estructuras se muestran en la Figura 1. Se evaluó la actividad catalítica de los complejos en la oxidación por H2O2 de los siguientes modelos de unidades estructurales de lignina: fenol, 2-metoxifenol, 2,6-dimetoxifenol y alcohol veratrílico. Dentro de la serie de compuestos de coordinación estudiados, los complejos de Cu(II) formados por ligandos nitrogenados son los más eficientes para catalizar la oxidación tanto de los fenoles como del alcohol bencílico. La evidencia reunida a lo largo de esta Tesis permitió establecer que tanto el potencial redox de la cupla Cu(II)/Cu(I) como la geometría molecular en solución constituyen factores importantes para explicar las diferencias observadas en la actividad catalítica de estos complejos. Entre ellos, este último resulta especialmente relevante en la oxidación de modelos con sustituyentes –OCH3 en las posiciones orto al grupo hidroxilo. Para los catalizadores más activos, se realizaron estudios cinéticos que permitieron proponer mecanismos de reacción para la oxidación de los modelos fenólicos. Estos mecanismos parten de la formación inicial de un intermediario de tipo hidroperoxo-Cu(II), que actúa como especie oxidante. Un proceso competitivo no menor es la actividad catalasa que presentan varios de estos complejos en paralelo. En el caso del complejo [Cu(Py2pn (ClO4)2], se observó que este proceso también se inicia con la formación del mismo intermediario hidroperoxoCu(II), aunque la reacción progresa mediante la interacción con una segunda molécula de complejo, lo que conduce a la formación de un dímero trans-µ-1,2-peroxodiCu(II) en la etapa determinante de la velocidad. Por otra parte, los estudios preliminares realizados en medio básico con los catalizadores inmovilizados mostraron que la encapsulación de [Cu(Py2pn)(ClO4)2] y [Cu(phen)2](ClO4)2 en la sílica mesoporosa SBA-15 resulta en un incremento de su eficiencia catalítica en la oxidación de fenol por H2O2. Asimismo, se evaluó el uso del complejo [Cu(phen)2](ClO4)2 en el blanqueo de pulpa marrón con H2O2 en medio básico, logrando una disminución del 29% del número Kappa inicial del material empleando condiciones suaves.Ítem Embargo Valorización de bioaceites y biocarbones obtenidos por pirólisis de material celulósico residual(2025) Pava Gómez, Beatriz Elena; Spanevello, Rolando Ángel; Sarotti, Ariel MarceloLa soja es el principal grano de producción nacional en Argentina. Esta es comúnmente sometida a un proceso de extracción para la producción de harina y aceite, generándose como subproducto cáscara de soja (más de 400 mil toneladas anuales). Este trabajo se centró en el aprovechamiento de este residuo de lignocelulósico, mediante el uso de procesos de pirólisis como una de las tecnologías de transformación química de biomasa en materiales de valor agregado. Para poder ofrecer alternativas bioeconómicas de reciclaje de la cáscara de soja, se identificaron las condiciones óptimas de generación de los productos de gran valor agregado. En el capítulo II, se determinaron las condiciones óptimas de pirólisis para la obtención de un carbón activado (CA) con gran capacidad de adsorción mediante diseños estadísticos de experimentos. La capacidad de adsorción de los distintos carbones preparados fue evaluada a través de la adsorción de azul de metileno, un colorante difícil de remover por las técnicas convencionales de tratamiento de agua y que sirve como indicador en la capacidad de adsorción del mismo. En este capítulo se muestra la caracterización del CA optimizado. Con el fin de poner a prueba la versatilidad de la adsorción del CA optimizado, en el capítulo III se estudió la adsorción de diferentes moléculas orgánicas, como ciprofloxacina, metil éster de ciprofloxacina, tiabendazol y amarillo ácido 17. Se realizó un estudio fisicoquímico, cinético y termodinámico para entender el comportamiento, los tipos de fuerzas intermoleculares que participan y posibles mecanismos del proceso de adsorción. Por otra parte, en el capítulo IV, fueron cuantificados los componentes mayoritarios de la cáscara de soja. Así mismo, se optimizó el proceso de obtención de levoglucosenona (LGO) 1.1 del bioaceite obtenido de la pirólisis convencional de la cáscara de soja con ayuda de estadística. LGO obtenida fue aislada con un grado de pureza adecuada para poder utilizarla en otras aplicaciones. Con el fin de evaluar la viabilidad de generar productos de alto valor agregado como CA y LGO a escala industrial, se realizó un aumento del escalado del proceso de laboratorio a piloto. Se pasó de procesar gramos (ensayos realizados en los capítulos II y IV), a procesar kilogramos en un reactor pirolítico piloto (capítulo V). En este capítulo se muestra un diseño general del reactor, los cambios sobre el equipo necesarios para alcanzar las condiciones de procesamiento óptimas, entre otros. LGO obtenida en capítulo IV fue empleada como material de partida para la generación de compuestos bioactivos. En el capítulo VI, se sintetizaron nuevos selenoderivados de LGO mediante reacciones de adición de tipo Michael sobre la cetona α,β-insaturada de LGO. Con estos compuestos se realizaron estudios de actividad biológica frente a Candida y Criptococcus. De igual manera, se sintetizaron compuestos que habían sido previamente reportados, los derivados halogenados de LGO (capítulo VII), con los cuales también se realizaron ensayos de actividad biológica frente a Candida y Criptococcus.Ítem Embargo Estudio de la función de TcBDF4 y TcBDF5, dos factores de remodelación de la cromatina de Trypanosoma cruzi(2025) Rodríguez Araya, Elvio; Serra, Esteban CarlosLa enfermedad de Chagas, causada por Trypanosoma cruzi, sigue siendo un problema relevante de salud en América Latina. La regulación de la expresión génica en este parásito ocurre a nivel postranscripcional y está influenciada por mecanismos epigenéticos, incluyendo la acetilación de histonas. En este contexto, las proteínas con bromodominio (BDF) son fundamentales en la regulación epigenética, ya que reconocen residuos de lisina acetilados en histonas y otros sustratos. En T. cruzi, se han identificado ocho BDF con estructuras diversas, cuya función aún no está completamente caracterizada. Esta tesis se centra en el estudio de TcBDF4 y TcBDF5, dos miembros de esta familia, y su integración en complejos asociados a la acetilación de histonas (HARC, por sus siglas en inglés). Se implementó una estrategia experimental multidisciplinaria dividida en cuatro capítulos, combinando enfoques proteómicos, bioinformáticos y funcionales. Mediante el uso de TurboID, se identificaron los interactomas de TcBDF4 y TcBDF5, revelando su participación en los complejos TcCRKT y TcNuA4, este último homólogo al complejo NuA4 de eucariotas superiores. Se determinó que TcBDF5 es un regulador central del grado de compactación de la cromatina, actuando a través de su integración en TcCRKT y su asociación con otros factores de remodelación epigenética. Su función es clave para modular los estados de condensación de la cromatina, equilibrando entre conformaciones más abiertas, que favorecerían la transcripción, y estados más compactos, que restringirían el acceso a la maquinaria transcripcional. El análisis estructural mediante AlphaFold2-multimer y dinámica molecular permitió predecir interacciones directas dentro de estos complejos, las cuales fueron validadas experimentalmente mediante ensayos de doble y triple híbrido en levaduras (Y2H/Y3H). A nivel bioinformático, se empleó una estrategia de ensamblado combinatorio para predecir la organización y estequiometría de los complejos identificados, integrando predicciones de dímeros y oligómeros con herramientas como FoldSeek, CombFold y teoría de grafos. Finalmente, se evaluó el impacto funcional de TcBDF5 en el ciclo de vida del parásito mediante la generación de líneas knockout y sobreexpresantes. Se observaron alteraciones significativas en el crecimiento y la morfología nuclear de los mutantes, lo que sugiere un rol esencial de TcBDF5 en la regulación epigenética de T. cruzi. Además, se identificó el dominio MRG de TcBDF5 como un blanco terapéutico clave, dado su papel en la regulación de la compactación de la cromatina. Este dominio participa en interacciones esenciales dentro del complejo TcCRKT, modulando directamente la transición entre estados más abiertos o compactos. Su inhibición podría representar una estrategia innovadora para alterar la estructura de la cromatina en el parásito y afectar su viabilidad. Los hallazgos de esta tesis aportan información clave sobre la función de TcBDF4 y TcBDF5 y sus interacciones dentro de los complejos HARC. Además, identifican potenciales blancos terapéuticos para el desarrollo de nuevas estrategias contra la enfermedad de Chagas.Ítem Embargo Estudio del papel de proteínas Vav en procesos celulares asociados al cáncer(2025-02) Cesatti Laluce, N.; Menacho Márquez, Mauricio; Girardini, JavierEl aumento de la expectativa de vida de las últimas décadas a nivel global ha contribuido a que el cáncer adquiera una mayor relevancia como una de las principales causas de muerte. Entre los distintos tipos de cáncer, aquellos que afectan a la piel han cobrado particular importancia, debido al deterioro progresivo de la capa de ozono y el consecuente aumento de exposición a radiación ultravioleta; principal factor ambiental implicado en el desarrollo de estas patologías. Por su parte, el melanoma es la forma más mortal de cáncer de piel y, tanto su incidencia como su mortalidad han aumentado en las últimas décadas. Las proteínas VAV son factores de intercambio de nucleótidos de guanina (GEF) que catalizan la activación de GTPasas, principalmente de la familia Rho/Rac. Por su actividad catalítica, se ha documentado ampliamente el rol protumoral de esta familia de GEF en diversos tipos de cánceres, entre ellos: de colon, mama, próstata e, incluso, de piel no melanoma, entre otros. En el presente trabajo, se llevó adelante un estudio del rol de VAV3 en el melanoma cutáneo. El papel de VAV3 en este tipo de cáncer no ha sido estudiado hasta el momento de publicación de este trabajo. La caracterización del rol de este GEF en melanoma se llevó adelante mediante abordajes in silico, in vitro e in vivo empleando modelos celulares, murinos y de bases de datos de pacientes. Los resultados obtenidos evidencian que VAV3 es el miembro de esta familia de GEF cuya expresión es más alta tanto en la piel como en el melanocito cutáneo en condiciones fisiológicas. Además, la expresión de este GEF se asocia directamente a la probabilidad de supervivencia de los pacientes, sugiriendo roles específicos de este miembro de la familia VAV. Por otra parte, se observó que la expresión de VAV3 está directamente implicada en procesos biológicos clave de la célula del melanoma, específicamente en la proliferación, la organización del citoesqueleto de actina, la migración y la apoptosis. Al mismo tiempo, en modelos animales de melanoma, la expresión de VAV3 se asoció inversamente a la agresividad de los tumores desarrollados. Finalmente, mediante abordajes bioinformáticos se identificó un amplio transcriptoma cuya expresión está asociada a la expresión de VAV3. Mediante análisis comparativo de modelos celulares y de bases de datos de pacientes, se identificó un reducido subgrupo de genes dependientes de la expresión de VAV3 y cuyas implicancias biológicas estarían relacionadas con la migración celular. El conjunto de resultados in silico, in vitro e in vivo aquí presentados dan evidencias de que la expresión de VAV3 guarda una relación inversa con la agresividad del melanoma cutáneo, sugiriendo que este GEF actúa como un gen supresor de tumores en el contexto de esta enfermedad.Ítem Embargo Relevancia del estado redox cloroplástico en el desarrollo foliar(2025) Demarchi, Mariana; Lodeyro, Anabella F.El objetivo del presente trabajo de Tesis es analizar el impacto del estado redox de los cloroplastos en procesos clave como el desarrollo foliar, la respuesta al estrés oxidativo, y la señalización retrógrada. Con este propósito, se adoptó como estrategia general la introducción de un gen proveniente de cianobacterias, ausente en plantas superiores, en diferentes especies vegetales. En este contexto, se emplearon las especies Arabidopsis (Arabidopsis thaliana), maíz (Zea mays) y tabaco (Nicotiana tabacum) que expresaban una flavodoxina (Fld) de Anabaena en cloroplastos. Estudios previos han demostrado que Fld actúa como un antioxidante general en los cloroplastos de líneas transgénicas, detoxificando las especies reactivas del oxígeno (EROs) generadas a nivel de la cadena fotosintética de transporte de electrones (CFTE), al aceptar electrones a nivel del fotosistema I de modo análogo a ferredoxina. En Arabidopsis, se investigó el efecto de esta flavoproteína en el desarrollo foliar y la respuesta al estrés. Estudios previos evidenciaron que la expresión de Fld confiere una mayor tolerancia a condiciones adversas, aunque este fenotipo conlleva una reducción en el tamaño foliar cuando la flavoproteína es expresada de manera constitutiva. Utilizando promotores inducibles para la expresión de Fld, pudimos demostrar en el presente trabajo de Tesis que Fld induce este fenotipo cuando su expresión ocurre durante la fase de expansión tardía del desarrollo foliar. Adicionalmente, se observó que la mayor tolerancia al estrés podría estar relacionada con la expresión de Fld en la etapa de proliferación celular. Adicionalmente, se investigó la importancia del estado redox de los cloroplastos dimórficos del maíz, una especie C4, en la tolerancia al estrés abiótico. Los resultados indicaron que la introducción de Fld en los cloroplastos de las células del mesófilo confiere una ventaja adaptativa bajo condiciones de sequía y estrés oxidativo. Sin embargo, la expresión de la flavoproteína en los cloroplastos de la vaina vascular no sólo no produjo beneficio alguno, sino que además aumentó la sensibilidad al estrés en estas líneas transgénicas. Por último, se analizó el impacto de los cambios en el estado redox de los cloroplastos sobre la señalización retrógrada durante episodios de estrés biótico en plantas de tabaco. Los resultados mostraron que la luz desempeña un papel fundamental durante la progresión de la infección, y que, bajo estas condiciones la expresión de Fld atenúa las lesiones provocadas por los patógenos. Además, las plantas transgénicas mostraron una reducción en la señalización retrógrada cloroplasto-núcleo, posiblemente debido a la menor presión de estrés percibida por las mismas. En resumen, el uso de flavodoxina como herramienta permitió establecer que el estado redox cloroplástico tiene la capacidad de influir en diversos procesos celulares clave en las plantas. Estos hallazgos no solo aportan valiosa información para la investigación científica, sino que también podrían aplicarse en estrategias de mejoramiento de cultivos con una respuesta optimizada frente a condiciones ambientales adversas.Ítem Embargo Alteración del transporte hepatocanalicular en la colestasis por estrógenos: papel de las especies reactivas del oxígeno(2024) Salas, Gimena; Crocenzi, Fernando A.; Basiglio, Cecilia LorenaEl metabolito endógeno del estradiol, el estradiol 17β-D-glucurónido (E17G), es considerado el principal responsable de la colestasis intrahepática del embarazo. El E17G altera la actividad de transportadores canaliculares, como la proteína asociada a resistencia a multidrogas 2 (Mrp2), a través de una internalización celular dependiente de la activación de distintas vías de señalización. Este fenómeno también se ha atribuido al estrés oxidativo en diferentes condiciones colestásicas experimentales. Sin embargo, aunque se ha avanzado considerablemente en el entendimiento de los mecanismos que participan en la colestasis por estrógenos, aún no existen reportes que involucren al estrés oxidativo en esta patología. Por lo tanto, el objetivo de este trabajo de tesis consiste en analizar la implicancia de las especies reactivas del oxígeno (ROS) en la colestasis por E17G, su origen, y las vías de señalización involucradas en el proceso de endocitosis del transportador Mrp2. Utilizando el modelo in vitro de duplas aisladas de hepatocitos de rata y el cultivo primario de hepatocitos de rata en configuración sándwich demostramos que compuestos antioxidantes previnieron la alteración de la actividad de Mrp2 inducida por E17G, siendo esta alteración igualmente prevenida por el inhibidor de la NADPH oxidasa (NOX) apocinina. En el modelo de hígado aislado y perfundido, el compuesto antioxidante N-acetilcisteína (NAC) previno el deterioro del flujo biliar y de la actividad de Mrp2 inducidos por E17G, confirmando así la participación de ROS en esta colestasis. En conclusión, la colestasis inducida por E17G está parcialmente mediada por ROS generados por NOX a través de la internalización de transportadores canaliculares como Mrp2, siendo ERK1/2 y p38MAPK necesarias para la activación de NOX. Asimismo, se utilizó el cultivo primario de hepatocitos para evidenciar que el pretratamiento con inhibidores específicos de la proteína kinasa regulada por señal extracelular 1/2 (ERK1/2) y de la proteína kinasa activada por mitógenos p38 (p38MAPK) inhibió la producción de ROS inducida por E17G. Mediante western blot, se demostró que la inhibición de NOX no afectó la fosforilación de ERK1/2 y p38MAPK. Ambos hallazgos sugieren que sería necesaria la activación de estas dos quinasas para que ocurra la activación de NOX. Además, tanto el silenciamiento de p47phox (subunidad reguladora citosólica de NOX) mediante ARNi, como la preincubación con apocinina en el cultivo de hepatocitos en configuración sándwich previnieron significativamente la internalización de Mrp2 inducida por E17G, lo que sugiere un papel crucial de NOX en este fenómeno.Ítem Embargo Orf319: un factor anti-virulencia específico de Salmonella que controla la formación de biopelículas(2024) Vitor Horen, Luisina; Soncini, Fernando C.Salmonella enterica es una bacteria patógena responsable de enfermedades como la gastroenteritis y la fiebre entérica, representando un grave desafío para la salud pública global. Un aspecto fundamental de su ciclo de vida es la capacidad de formar biopelículas, comunidades bacterianas adheridas a superficies y rodeadas por una matriz extracelular autoproducida. En Salmonella, la matriz extracelular está compuesta principalmente de la fimbria agregativa curli y el exopolisacárido celulosa. La transición al estilo de vida comunitario y la formación de biopelículas están controladas por el regulador maestro CsgD, cuya expresión es modulada por factores de transcripción que integran diversas señales ambientales. Entre estos reguladores, MlrA y MlrB, dos factores de transcripción de la familia MerR, juegan un papel crucial en la activación de la expresión de CsgD, y también, reprimen el gen orf319, cuya función es desconocida. El objetivo principal de esta tesis fue caracterizar funcionalmente a Orf319, una proteína codificada en la isla de patogenicidad 2 (SPI-2) de Salmonella, para entender su rol en la formación de biopelículas y en la adaptación intracelular. Se evaluó su interacción con otros reguladores y su impacto en la virulencia del patógeno. En el primer capítulo, se analizó la influencia de Orf319 en la formación de biopelículas. Los resultados mostraron que la expresión ectópica de Orf319 activa la producción de componentes de la matriz extracelular al aumentar los niveles de expresión de CsgD. A pesar de que Orf319 estimula la síntesis de biopelículas de manera similar a MlrA, no requiere la presencia de MlrA, MlrB ni otros reguladores ya caracterizados en Salmonella para la activación transcripcional de csgD. Los estudios también revelaron que Orf319 ejerce un efecto negativo sobre su propia transcripción, sugiriendo un mecanismo de retroalimentación controlado, en parte, por MlrB. Orf319 contiene dos dominios conservados, DUF523 y DUF1722. Mutaciones en cisteínas asociadas a la formación de un clúster Fe-S predicho en el dominio DUF523 afectaron la formación de biopelículas y la transcripción de csgD. El segundo capítulo se centró en el papel de Orf319 en la virulencia de Salmonella. La deleción de orf319 no afectó la capacidad de la bacteria para replicarse dentro de macrófagos, pero la sobreexpresión de Orf319 redujo significativamente la replicación intracelular. Esto se debe a su capacidad para promover la formación de biopelículas a través de la regulación de CsgD, ya que el aumento de la producción de celulosa actúa como factor de anti-virulencia en este entorno. Orf319 también se identificó como un regulador negativo de SsrB, el activador de los genes de la SPI-2, aunque su efecto en condiciones intracelulares parece estar contrarrestado por otros mecanismos. Estos hallazgos sugieren que Orf319 podría actuar como un nexo entre la formación de biopelículas y la virulencia en Salmonella.Ítem Embargo Estudio del papel de las proteínas Vav en procesos celulares asociados al desarrollo de melanoma(2025) Mamberto, Macarena; Menacho Márquez, Mauricio; Girardini, JavierLas proteínas de la familia Vav (Vav1, Vav2 y Vav3) son factores de intercambio de nucleótidos de guanosina (GEFs) que regulan la actividad de GTPasa Rho, desempeñando funciones clave en procesos celulares fundamentales como la reorganización del citoesqueleto, la migración celular y la supervivencia celular. Alteraciones en la regulación de estos procesos pueden contribuir a la transformación maligna de las células. Aunque se ha demostrado la implicación de las proteínas Vav en diversos tipos de cáncer, su papel específico en el melanoma sigue siendo poco conocido. A pesar de representar solo el 4-5% de los cánceres cutáneos, el melanoma es la principal causa de muertes asociadas al cáncer de piel. Esta tesis tiene como objetivo investigar el rol de Vav2 en el desarrollo y la progresión del melanoma, con el fin de arrojar nuevas perspectivas sobre su potencial como diana terapéutica en este tipo de cáncer. Mediante un enfoque integral que abarca estudios in silico, in vitro e in vivo, se evaluaron los efectos de la modulación de los niveles de expresión de Vav2 en células de melanoma. Los resultados obtenidos muestran que Vav2 regula procesos fundamentales como la proliferación, remodelación del citoesqueleto, migración, invasión y adhesión celular, todos ellos cruciales en la progresión tumoral. A nivel molecular, se demostró que la modulación de Vav2 impacta significativamente en la vía PI3K/AKT, esencial para la supervivencia y proliferación celular en el contexto del melanoma. Estos hallazgos fueron corroborados en un modelo in vivo, donde la disminución de los niveles de Vav2 redujo significativamente el crecimiento tumoral, mientras que la expresión de una forma activa de Vav2 promovió un mayor crecimiento tumoral y la aparición de metástasis pulmonares. Además, los resultados sugieren un rol de este GEF en el microambiente tumoral. El análisis in silico mostró que los cambios en la expresión de Vav2 inducen una regulación diferencial de genes clave en procesos celulares esenciales, como el control del ciclo celular, el metabolismo, la remodelación de la matriz extracelular y vías asociadas a MITF, un factor de transcripción fundamental en la progresión del melanoma. Aunque se requieren estudios adicionales para comprender completamente los mecanismos moleculares mediante los cuales Vav2 contribuye a la malignidad del melanoma, los hallazgos de esta tesis sugieren que Vav2 juega un papel central en la progresión tumoral y la formación de metástasis, estableciendo un punto de partida para el desarrollo de nuevas estrategias terapéuticas dirigidas a esta proteína.Ítem Embargo Regulación del desarrollo por el microARN miR396 en Arabidopsis thaliana(2011-08-11) Mecchia, Martín Alejandro; Palatnik, Javier F.Junto con la expansión celular, la proliferación celular es un importante determinante del tamaño y la forma final de la planta. Sin embargo, poco se sabe acerca de cómo los programas de desarrollo controlan el número final de células. El microARN miR396 está altamente conservado en plantas. Regula siete factores de transcripción de la familia de los Growth Regulating Factors (GRFs) que están implicados en el control del tamaño de las hojas. En esta Tesis se aporta evidencia de que el balance entre el microARN miR396 y los GRFS controla la proliferación celular durante el desarrollo de varios órganos en Arabidopsis thaliana. Altos niveles del miR396 reducen la expresión de genes implicados en la proliferación celular, causando una reducción del número de células en las hojas. Altos niveles de miR396 reducen la duración de la fase proliferativa de la hoja y desencadenan prematuramente el proceso de expansión y diferenciación celular. En definitiva, encontramos evidencia de que el microARN miR396 sería un modulador importante del desarrollo de la hoja, afectando desde la proliferación celular en las fases temprana de la hoja hasta los últimos estadios de la vida de la hoja y la senescencia. A su vez, elevados niveles de actividad de GRF producen un aumento en la duración de la fase de proliferación celular tanto en hojas como en tallos. En consecuencia, las plantas con altos niveles de GRF son de mayor tamaño y con una mayor acumulación de biomasa que las silvestres. Además, hemos encontrado que el sistema del miR396 es importante para el establecimiento de las caras abaxial (inferior) y adaxial (superior) de las hojas. Altos niveles del miR396 acrecientan los fenotipos de mutantes individuales determinantes de la cara adaxial de la hoja. Esto sugeriria que una temprana diferenciación de las células abaxiales y un insuficiente número de células en el dominio adaxial en líneas con altos niveles de miR396, desencadenarían un prematuro establecimiento del dominio abaxial. También aportamos evidencia de que el microARN miR396 y los GRFs podrían actuar por debajo de las cascadas regulatorias controladas por el microARN miR319 y los genes KNOX. Estos dos sistemas participan a su vez en la generación de hojas compuestas y en el diseño de la forma de estos órganos en distintas especies de plantas. Por último, en esta Tesis se evalúa la participación del miR396 durante el desarrollo reproductivo de Arabidopsis. El miR396 controla la expresión de marcadores de proliferación celular en tallos y el tamaño final del mismo. Además, se ha mostrado que durante el desarrollo de la flor, el miR396 cumple un rol importante en la determinación de los órganos florales.Ítem Embargo Caracterización de las vías de ensamblado de complejos ferrosulfurados en algas(2024) Marchetti Acosta, Noelia Soledad; Busi, María Victoria; Barchiesi, JulietaEl hierro y el azufre son esenciales para todos los organismos. Estos elementos forman los clusters Fe-S que están presentes como cofactores en numerosas proteínas y complejos proteicos relacionados con procesos clave en las células. Se ha descripto que en las mitocondrias de levaduras, humanos y plantas es la proteína frataxina (FH) quien cede los átomos de Fe en el proceso de biosíntesis de los clusters Fe-S. Esta proteína también ha sido asociada con el control celular redox, la desintoxicación de Fe y la protección contra el estrés oxidativo. Frataxina es una proteína ampliamente distribuida y conservada en la naturaleza. Aunque se han realizado muchos estudios en humanos y levaduras, hay pocos informes sobre la caracterización de frataxina en organismos fotosintéticos. El mecanismo de ensamblado de los complejos Fe-S está relacionado con el metabolismo de lípidos. Las rutas metabólicas de carbohidratos y lípidos están también relacionadas ya que existe una competencia entre la síntesis de lípidos y almidón. En condiciones de estrés, el principal precursor de la síntesis de TAGs es el glicerol-3-fosfato (G3P), que se produce por catabolismo de la glucosa en el citosol (glucólisis). La degradación del almidón provee metabolitos para la producción de acetil-CoA, el cual es el precursor para la síntesis de ácidos grasos. Así en algunos casos una disminución de la degradación de almidón, podría bloquear la síntesis de lípidos. Otros autores informan que, en la mayoría de las microalgas, el almidón se acumula como fuente primaria de energía y reserva de carbono (C), mientras los lípidos sirven como un almacenamiento secundario. Teniendo esto en consideración nos planteamos estudiar si la modificación en las vías de ensamblaje de los complejos Fe-S afecta la producción de lípidos y otros componentes de las células. El conocimiento generado podría aplicarse al diseño de biomasa con fines energéticos y/o alimenticios. El primer objetivo de esta tesis fue realizar un análisis bioinformático e identificación de proteínas implicadas en la síntesis de grupos Fe-S en clorófitas. La búsqueda reveló una alta conservación de genes y proteínas involucrados en la síntesis de complejos Fe-S en las mitocondrias de algas. Muchas especies mostraron la presencia de múltiples genes y/o proteínas homólogas que pertenecerían a la vía ISC. En cambio, se observó una sola isoforma de las proteínas de la vía CIA en la mayoría de las algas analizadas, a excepción de Chlamydomonas reinhardtii. Como segundo objetivo de este trabajo se caracterizaron cepas de C. reinhardtii sobreexpresantes en frataxina. Para ello se obtuvieron cepas transformantes mediante electroporación y las mismas fueron denominadas CrFH1 (C. reinhardtii sobreexpresante de FH en citoplasma) y CrCOXFH15 (C. reinhardtii sobreexpresante de FH en mitocondria). Se observó que las algas que sobreexpresan frataxina presentan mayor crecimiento que las algas WT en presencia de Fe3+ y H2O2 agregados al medio. Estos resultados muestran que los mayores niveles de frataxina disminuyen la sensibilidad al estrés generado por la presencia de agentes oxidantes, evidenciando que frataxina cumple un rol protector frente al estrés oxidativo en algas. Además se observó que la línea transformante CrCoxFH15 acumula mayor cantidad de clorofila a, clorofila b y proteínas durante la fase exponencial con respecto a las líneas CrWT y CrFH1. Durante la fase estacionaria, se observó también un marcado aumento en la producción de triglicéridos en la línea sobreexpresante CrCoxFH15, demostrando que la sobreexpresión de frataxina dirigida a mitocondria incrementa la acumulación de lípidos en C. reinhardtii, reforzando la evidencia de la participación de frataxina en el metabolismo lipídico. El análisis de metabolitos intracelulares realizados por CG EM mostró un aumento significativo en el contenido alanina glicina, serina, prolina y de los aminoácidos esenciales isoleucina y leucina en las lineas CrCoxFH15 y CrFH1 respecto a la línea CrWT. Los valores son mayores cuando frataxina es expresada en mitocondria. Esto convierte a la línea CrCoxFH15 en una candidata para la obtención de productos utilizados como suplementos nutricionales para alimentación tanto animal como humana y bioestimulantes. Posteriormente, se evaluó el efecto de las líneas CrWT, CrFH1 y CrCoxFH15 sobre la germinación de semillas de soja. Los resultados mostraron que las semillas preincubadas en los extractos de algas transformantes presentaron brotes de mayor grosor y longitud, lo cual nos permite suponer que el mayor contenido de aminoácidos en las líneas transformantes aportaría una cantidad extra de nitrógeno que podría ser utilizada durante el desarrollo de la planta. Por otro lado, se evaluó también la transformación de algas las algas modelo N. gaditana y Chlorella sp. mediante electroporación y transformación mediada por Agrobacterium tumefaciens, pero no se logró la obtención de algas transformantes por ninguno de los métodos aplicados. Los estudios in silico realizados para llevar a cabo el tercer objetivo de este trabajo mostraron que las frataxinas de Ectocarpus siliculosus (EctsiFH), Nannochloropsis gaditana (NangaFH) y Chlorella vulgaris (ChlspFH) contienen un dominio frataxina conservado, confirmando así la gran similitud estructural que contienen los homólogos de frataxina entre sí. En los modelados obtenidos, se pudo observar que EctsiFH, NangaFH y ChlspFH poseen el dominio característico αβ sandwich de la familia de frataxinas. El análisis de homología de residuos involucrados en la unión a hierro muestra que existe un alto porcentaje de residuos conservados (62,5% para EctsiFH, 37,5% para NangaFH y 43,75% para ChlspFH) respecto a la CyaY de E.coli. Estas observaciones permiten suponer que estas proteínas son capaces de unir Fe. Al expresar EctsiFH en células de E. coli se observó que las mismas tenían una mayor capacidad de crecimiento en presencia de H2O2 Cd, Zn y Ni que el observado para las células wt. Este mismo comportamiento fue mostrado por células de E. coli que fueron suplementadas con NangaFH en presencia de H2O2 Cu, Zn, Cr. A diferencia de las otras dos, ChlspFH expresada en E. coli no aportó ninguna ventaja en presencia de H2O2, pero sí con Cu, Zn y Ni. Además, los experimentos in vitro demostraron que ChlspFH atenúa la reacción de Fenton en un 23% respecto al control (ausencia de ChlspFH), mientras que EctsiFH y NangaFH atenúan en menor proporción la reacción oxidativa. Estos resultados permiten suponer un rol protector de frataxina contra agentes oxidantes y de esta forma, su presencia podría atenuar los efectos del daño oxidativo.Ítem Embargo Articulación entre el procesamiento y la actividad de los microARNs(2024) Rosatti, Santiago; Palatnik, Javier F.; https://orcid.org/0000-0002-2526-1990Los miARNs son ARN pequeños de 20-22 nt, de codificación endógena. Son transcriptos por la ARN Polimerasa II en forma de transcriptos largos que se pliegan sobre sí mismos formando una estructura intracatenaria de tallo-burbuja de apareamiento imperfecto. Esta estructura contiene los determinantes necesarios para su reconocimiento y procesamiento por parte de DICER-LIKE1 (DCL1). El dúplex miARN/miARN* es liberado y una de estas hebras es seleccionada y cargada en ARGONAUTA1 (AGO1). El complejo AGO1-miARN es exportado al citoplasma donde es capaz de detectar al ARN blanco, al cual reconoce por complementariedad de bases. Este complejo puede regular post-transcripcionalmente la expresión génica bloqueando la transcripción o bien empleando la actividad endonucleolítica de AGO1, que corta al transcripto blanco entre las posiciones 10 y 11 del miARN. El procesamiento de los miARNs en plantas es diverso debido a las diferencias en la estructura de sus precursores (pri-miARN). El complejo DCL1 puede procesar estos pri-miARN de dos maneras: base-to-loop, cuando un tallo de 15-17 nucleótidos está por debajo del dúplex miARN/miARN*, o loop-to-base, cuando el tallo está por encima. Tras un primer corte, DCL1 realiza un segundo a 21 nucleótidos para liberar el dúplex miARN/miARN*. Este proceso puede completarse en dos cortes (procesamiento en dos pasos) o en varios cortes sucesivos (procesamiento secuencial) generando varios dúplex hasta liberar el ARN funcional con actividad biológica. En esta Tesis, en primer lugar, nos enfocamos en las estructuras de los dúplex miARN/miARN*, haciendo un análisis exhaustivo de la posición, identidad y cantidad de mismatches, y cómo la modificación de estos impactaba sobre la acumulación del miARN maduro. Además, comparamos este efecto teniendo en cuenta el mecanismo de procesamiento, y en última instancia la función biológica y la conservación evolutiva de los MIARNs. Nuestros hallazgos indican que la estructura del dúplex miARN/miARN* tiene un rol crucial para la acumulación del miARN maduro, dependiendo del mecanismo de procesamiento del precursor. Además, encontramos que la mayoría de los precursores de miARNs sufren un procesamiento sub-óptimo in vivo, que puede ser mejorado al ajustar los niveles de energía del miARN/miARN* en los MIARNs procesados en dos pasos. Sin embargo, los MIARNs secuenciales tienen diferentes requerimientos. Encontramos que el miARN/miARN*, que se genera en los dos últimos cortes de DCL1 es el dúplex más estable de todos los que se generan cuando estos precursores son procesados. En contraste, los otros ARN pequeños tienen varias bases desapareadas en su región central, lo que origina dúplex con bajas energías de interacción y niveles finales reducidos. Además, encontramos que los distintos roles regulatorios de los dúplex de miARN/miARN* en el procesamiento de los MIARNs se correlaciona con su conservación de secuencia a lo largo de la evolución. Luego, usando la información disponible en bibliotecas de ARN pequeños publicadas, analizamos cómo diferentes mutantes de la ruta de biogénesis de siARNs heterocromáticos afectan la acumulación de miARNs. Estos siARNs están involucrados en el silenciamiento génico transcripcional, ya que regulan la metilación del ADN genómico. Observamos que la supresión de la biogénesis de siARNs en mutantes como rdr2 y dcl234 provoca un desbalance en la acumulación de ciertos miARNs. Los miARNs con un 5’A terminal se acumulaban en mutantes de la ruta de los siARN heterocromáticos. En estas mutantes además se favorecía el aumento de la relación miARN/miARN* cuando el miARN* tenía un 5’A. Esta especificidad en la acumulación sugiere una competencia entre diferentes ARN pequeños por las proteínas AGO, que en ausencia de sus sustratos naturales, cargan otros ARN pequeños, como los miARNs con 5’A Un descubrimiento clave es la acumulación diferencial del miR319.2, derivado del precursor de MIR319, en las mutantes rdr2 y dcl234. Encontramos que el locus de MIR319a experimenta un aumento en la metilación en estas mutantes, lo que sugiere que el miR319.2 podría guiar a la maquinaria de metilación del ADN, vinculando así la regulación post-transcripcional y transcripcional. Complementariamente, el enriquecimiento de la proteína AGO4 en el locus de MIR319a refuerza la hipótesis de que este miARN podría desempeñar un papel importante en el silenciamiento génico dependiente de ARN. Proponemos que el miR319 tiene una función dual, actuando tanto en la regulación post-transcripcional como en la regulación transcripcional a través de la metilación del ADN en condiciones específicas de desarrollo o estrés. Finalmente, los conocimientos obtenidos en esta tesis no solo aportan nueva información sobre los mecanismos de procesamiento de miARNs, sino que también abren la puerta a aplicaciones biotecnológicas prometedoras. La posibilidad de ajustar los niveles específicos de miARN maduro modificando su estructura secundaria, así como el uso del precursor de miR319 como una herramienta para el silenciamiento génico transcripcional y post-transcripcional, permiten su aplicación en el diseño de miARNs artificiales destinados a regular la expresión de genes específicos, tanto en contextos de desarrollo como en respuesta al estrés, con un gran potencial para la mejora de cultivos.Ítem Embargo Roles biológicos de proteínas asociadas a neurodegeneración en células tumorales(2024) Zanotti, Lucía Camila; Menacho Márquez, Mauricio; Pérez, Ana R.El cáncer y las enfermedades neurodegenerativas representan una grave problemática sanitaria a nivel mundial ya que afectan a un gran número de personas en todo el planeta. Ambos grupos de enfermedades son el resultado de la interacción entre genes y factores ambientales. Sin embargo, la diferencia clave entre ambas radica en que los procesos biológicos característicos que conducen a estas patologías ocurren en sentido opuesto: en el cáncer se produce una división celular descontrolada mientras que, en las enfermedades neurodegenerativas, la principal manifestación es la muerte celular. Numerosos estudios han demostrado una relación directa entre la Enfermedad de Parkinson (EP), el segundo trastorno neurodegenerativo más frecuente a nivel mundial, y el desarrollo de melanoma; en particular, estudios epidemiológicos han evidenciado un mayor riesgo de desarrollar melanoma en personas con EP, y sorprendentemente, esta relación también se da en sentido inverso. Una posible conexión entre estas patologías radica en la alteración de las funciones de las sinucleínas, un grupo de proteínas neuronales que incluye alfa-, beta- y gamma-sinucleína (αS, βS y ɣS, respectivamente), implicadas tanto en cáncer como en neurodegeneración. En particular, ɣS ha mostrado estar asociada con el desarrollo de varios tipos de tumores, como el de mama, pulmón y próstata promoviendo la proliferación y la resistencia a la apoptosis, además de influir en la capacidad de las células tumorales para migrar e invadir otros tejidos. Esto sugiere que ɣS podría ser relevante en la progresión del cáncer por lo que está siendo investigada como un posible biomarcador para la detección temprana de la enfermedad. Sin embargo, hasta la fecha, no se ha investigado su papel en melanoma. Por ello, la presente tesis tiene como objetivo estudiar la función de ɣS en el desarrollo del melanoma, el cáncer de piel más mortal. A través de un enfoque integral que incluye estudios in silico, in vitro e in vivo, observamos que ɣS participa en procesos de proliferación, migración y adhesión celular, fundamentales en la progresión del melanoma. Modulando sus niveles endógenos en células de melanoma observamos que las vías de MAPK y PI3K/AKT se veían afectadas al cambiar su expresión. A su vez, demostramos que ɣS es capaz de formar fibrillas in vitro y que las células son capaces de incorporar la proteína cuando se le adiciona a su medio de cultivo. Estos resultados fueron corroborados en un modelo in vivo donde vimos que la disminución de los niveles de ɣS conducen a un menor crecimiento tumoral y a un menor número de metástasis mientras que, el pretratamiento con ɣS, aumentó el tamaño tumoral sin afectar el desarrollo de metástasis. Por último, mediante un abordaje in silico confirmamos que vías de señalización y procesos relacionados con la matriz extracelular, adhesión y migración celular están sobrerrepresentadas cuando cambian los niveles de ɣS en tumores de pacientes. Aunque estudios adicionales son necesarios para entender el mecanismo de acción de ɣS en melanoma, esta tesis sugiere su implicación activa en la progresión y malignidad del melanoma, estableciendo un fundamento para futuras investigaciones.