(FBIOyF) Posgrado - Tesis

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Embargo
Rol del sistema de reparación de apareamientos incorrectos en el ADN en respuesta al estrés genotóxico en Arabidopsis thaliana
(2023) Ramos, Rocío Soledad; Spampinato, Claudia P.
Como organismos sésiles, las plantas están continuamente expuestas a una variedad de factores ambientales adversos, tanto bióticos como abióticos, que pueden provocar daños en varias biomoléculas, entre ellas el ADN. Afortunadamente, todos los organismos vivos, incluidas las plantas, poseen una variedad de mecanismos para detectar y reparar los daños en el ADN con el fin de mantener la integridad del genoma. Uno de ellos es el sistema de reparación de apareamientos incorrectos en el ADN o MMR (por sus siglas en inglés, Mismatch Repair). Aunque las respuestas de las plantas al estrés, biótico o abiótico, y al daño en el ADN se han estudiado extensamente por separado, su posible interconexión sigue siendo relativamente inexplorada. Por ello, este trabajo de Tesis tuvo como objetivo investigar la función del sistema MMR, específicamente de las proteínas MSH6 (por sus siglas en inglés, MutS Homolog 6) y MSH7 (por sus siglas en inglés, MutS Homolog 7), en la respuesta de las plantas de Arabidopsis thaliana al estrés biótico y al estrés hídrico, ya que ciertos fitopatógenos, así como ciertos estreses abióticos, producen daños en el ADN. Los resultados obtenidos demostraron que MSH6 y MSH7 de A. thaliana tienen roles en la respuesta inmune a Pseudomonas syringae pv. tomato DC3000 (Pst DC3000). Más aún, estos roles serían diferenciales. Además, en este trabajo de Tesis, se demostró que la ausencia de MSH6 produce un fenotipo de menor susceptibilidad a Pst DC3000 en A. thaliana, presentando una menor apertura estomática y, en consecuencia, un menor ingreso bacteriano a la planta. Por otra parte, se demostró que la supresión de MSH6 produce una mayor acumulación del daño en el ADN y compromete la eliminación del peróxido de hidrógeno con respecto a las plantas salvajes (WT). Adicionalmente, se estudió la respuesta de las plantas mutantes msh6 frente al estrés hídrico, y se observó una menor inhibición de algunos parámetros fenotípicos frente al déficit hídrico y una menor tolerancia a la inundación en comparación con las plantas WT. Finalmente, se logró la mutagénesis sitio-dirigida del dominio Tudor del gen MSH6 de A. thaliana. En resumen, este Trabajo de Tesis, pudo demostrar la existencia de una interacción entre el sistema MMR y los mecanismos de la señalización del estrés en los organismos vegetales.
Embargo
Caracterización estructural y funcional de las proteínas sensoras de los sistemas de resistencia a β-lactámicos de Staphylococcus aureus
(2023) Mihovilcevic, Damila; Llarrull, Leticia Irene
Staphylococcus aureus resistente a meticilina (MRSA) es una de las amenazas clínicas multirresistentes más importantes a nivel mundial. MRSA posee dos mecanismos primarios de resistencia a antibióticos β-lactámicos: la producción de una serin-β-lactamasa, PC1, y la adquisición de una transpeptidasa accesoria, PBP2a, con baja afinidad por los antibióticos. Los genes que codifican para estas dos proteínas junto con los que codifican para los reguladores BlaI/MecI y BlaR1/MecR1, forman parte de los operones bla y mec, respectivamente. Las proteínas BlaR1 y MecR1 son proteínas integrales de membrana denominadas sensoras/transductoras, que presentan un dominio sensor extracelular capaz de detectar el antibiótico en el medio y disparar una señal al interior celular, que deriva en la transcripción de los genes involucrados en la resistencia. Sin embargo, hasta el momento el mecanismo de transducción de la señal es desconocido. Una de las dificultades más grandes radica en la expresión, purificación y caracterización de estas proteínas en sus versiones completas. La comprensión del mecanismo de transducción de señal es de sumo interés dado que ambas proteínas son posibles blancos para el diseño de nuevos inhibidores que puedan emplearse junto con los antibióticos actualmente disponibles. A fin de esclarecer el funcionamiento de ambos sistemas, nos propusimos comenzar con una primera caracterización estructural de la proteína MecR1. Luego de sobre-expresar, solubilizar y purificar la proteína de interés, determinamos que la misma se encuentra como dos especies en micelas de detergente. A partir de ensayos de SEC-MALS confirmamos las especies como dímero y monómero. Ensayos de dicroísmo circular nos permitieron determinar que ambas especies se encuentran plegadas en detergente y empleando diferentes antibióticos β-lactámicos probamos que el dominio sensor de ambas se encuentra correctamente plegado y es funcional. Además, realizamos dos screenings iniciales de condiciones para la preparación de grillas que permitan determinar la estructura de MecR1 empleando Cryo-EM. Si bien, hasta el momento no se han encontrado las condiciones de vitrificación óptimas, los resultados fueron alentadores para continuar trabajando en ello. Por otro lado, buscamos condiciones alternativas para la solubilización y purificación de la proteína de membrana. Se ensayaron dos polímeros para la preparación de nanodiscos, logrando la solubilización y purificación con el polímero SMALP 300 (3:1). Sin embargo, los rendimientos han sido menores que empleando detergentes, por lo que se debe continuar trabajando en la puesta a punto de las condiciones de solubilización. Al momento de comenzar este trabajo, sólo se conocían las estructuras cristalográficas de los dominios sensores de las proteínas BlaR1 y MecR1, en ausencia y en presencia de antibiótico. Sin embargo, las estructuras no mostraban diferencias que pudieran aportar información acerca del mecanismo de transducción de la señal hacia el dominio metaloproteasa, luego de la unión del antibiótico. Con el objetivo de dilucidar este mecanismo, propusimos desarrollar una metodología empleando el uso de lantánidos que permita evaluar los cambios conformacionales que ocurren en la proteína MecR1 al producirse la unión del antibiótico. Para ello, se introdujeron sondas espectroscópicas en bucles citoplasmáticos de MecR1 a partir de las cuales se pudieron obtener medidas de distancia, empleando Espectroscopia de Resonancia Paramagnética Electrónica (EPR) de alto campo y Transferencia de Energía de Luminiscencia por Resonancia (LRET). Esta metodología nos permitirá a futuro continuar con el estudio de los cambios conformacionales que ocurren en MecR1 al estar unida a antibióticos βlactámicos o en presencia del represor MecI. La cepa de referencia empleada para el estudio del mecanismo de resistencia de Staphylococcus aureus mediado por el operón bla es S. aureus NRS128. La cepa S. aureus MN8, presenta la misma secuencia que NRS128 para los genes blaI, blaZ y la región operadora, pero presenta una mutación puntual en el gen blaR1 que genera un cambio en el marco de lectura y un codón de STOP prematuro. Sin embargo, MN8 fue reportada como resistente a antibióticos βlactámicos. A lo largo de este trabajo se intentó esclarecer si alguna de las versiones truncas generadas en MN8, que poseen tanto el dominio metaloproteasa como el dominio sensor se estaría expresando y presentaría actividad metaloproteasa, dando lugar a la manifestación de resistencia. Confirmamos la presencia de la mutación puntual en MN8 y la resistencia frente a los antibiótico ampicilina y penicilina G. Además, empleando ensayos con el antibiótico cromogénico nitrocefina y utilizando cepas de S. aureus reporteras, confirmamos la expresión inducible de los genes que componen el operón bla en la cepa NRS128, en contraste con una expresión constitutiva en la cepa MN8. Esta tesis aporta nuevos avances en el estudio de la proteína integral de membrana MecR1. Además, se ha innovado en el uso de nanodiscos para la purificación de proteínas de membrana y la determinación de la estructura empleando la técnica de vanguardia Cryo-EM. Por otro lado, se dejan sentadas las bases del desarrollo de una nueva metodología empleando EPR y LRET para la determinación de medidas de distancias en diferentes condiciones, que permitirán continuar con el estudio del mecanismo de transducción de la señal empleado tanto por MecR1 como por BlaR1.
Embargo
Estudio de péptidos natriuréticos tipo planta en la interacción planta-patógeno
(2024) Di Paolo, Valeria; Ottado, Jorgelina
Las plantas superiores están de forma continua expuestas a condiciones adversas en su entorno. Por esto, cuando se enfrentan a un estrés biótico hacen frente al mismo a través de una inmunidad innata presente en sus células, o mediante una inmunidad sistémica, la cual se transduce al resto del organismo por medio de moléculas señal. En el presente trabajo de tesis se analizaron los roles desempeñados bajo dicho estrés por parte del receptor AtPNP-R1, el péptido natriurético vegetal AtPNP-A, ambos de A. thaliana y el péptido natriurético bacteriano XacPNP, sintetizado por X. citri subsp. citri. Por medio de la utilización de herramientas bioinformáticas se determinó la presencia de cis-elementos reguladores en la secuencia promotora putativa del gen codificante de AtPNP-R1. Además, se realizó una búsqueda de dominios conservados en la secuencia aminoacídica de las proteínas bajo estudio, pudiéndose establecer los péptidos señal para las mismas, y secuencias LRR para el receptor. También, se realizaron modelados de las secuencias terciarias, observándose una forma curvada general para el receptor vegetal y estructuras similares entre sí para los péptidos natriuréticos, con disposiciones en el espacio de las estructuras secundarias conservadas en este último caso. Por otro lado, se determinaron probables interacciones entre AtPNP-R1 con AtPNP-A y XacPNP, las cuales fueron una base para posteriores estudios in planta. Para ampliar los resultados anteriormente obtenidos se realizaron observaciones por medio de microscopía confocal, utilizando diferentes fusiones a fluoróforos de las proteínas bajo estudio. Se determinaron las localizaciones celulares de las mismas, siendo en el plano de la membrana plasmática asociado a ella para AtPNP-R1, y en el espacio extracelular para los péptidos vegetal y bacteriano. También se realizó una caracterización del movimiento del receptor a lo largo de la membrana plasmática a partir del cual se obtuvieron diferentes parámetros cinéticos. Además, se determinaron las interacciones AtPNP-R1/AtPNP-A y AtPNP-R1/XacPNP in planta. Con el objetivo de analizar el rol de las proteínas bajo estudio en las respuestas activadas frente a condiciones de estrés biótico se realizaron diferentes ensayos. Se observó un fenotipo de menor daño en el tejido infectado, causado por el péptido bacteriano en un contexto génico de presencia del receptor AtPNP-R1. Sumado a esto, se observaron expresiones significativamente aumentadas en los transcriptores correspondientes a AtPNP-A y AtPNP-R1 luego de una infección patogénica. Se amplió dicho resultado por medio de un análisis proteómico en vías de caracterizar las respuestas inducidas por las proteínas bajo estudio. Se determinó que las mismas actúan de forma similar en las modificaciones generadas en el metabolismo de la planta post-infección. Esto último, refuerza la idea de un accionar en conjunto en la activación de respuestas celulares frente a una situación de estrés biótico. Se observó que metabolismos anabólicos fueron reprimidos, mientras que vías de generación de intermediarios moleculares o poder reductor se vieron sobreexpresadas. Probablemente, esto se da con el objetivo de abastecer de componentes necesarios en las respuestas de defensa. Además, los mecanismos de regulación de los niveles de ROS se vieron aumentados, posiblemente con el objetivo de reducir el daño celular e intentar sobrevivir al ataque patogénico. Los resultados obtenidos en este trabajo de tesis ampliaron el conocimiento sobre el accionar de AtPNP-R1 y AtPNP-A de A. thaliana, y XacPNP de X. citri subsp. citri en la activación de respuestas frente a condiciones de estrés biótico. Además, permitieron determinar sus localizaciones celulares y la interacción entre los mismos in vivo. Dichos resultados sientan bases para profundizar en el mecanismo activado como respuesta a estrés biótico, corriente abajo del receptor AtPNP-R1 luego de la interacción con su ligando AtPNP-A, contribuyendo al avance en la investigación básica sobre la interacción planta-patógeno
Embargo
Estudio de los sistemas de transporte de potasio y su contribución en la respuesta a diferentes condiciones de estrés en Enterococcus faecalis
(2024) Acciarri, Giuliana; Magni, Christian; Espariz, Martín
Entre los miembros del género Enterococcus se encuentran los microorganismos más controversiales de las bacterias ácido lácticas (BAL), y comprenden tanto bacterias de interés industrial, como comensales y patógenos. Un rasgo distintivo de los enterococos es la capacidad de persistir y prosperar en ambientes hostiles, lo que les permite una amplia dispersión en el ambiente. Dentro del género, Enterococcus faecalis, un habitante natural del tracto gastrointestinal, apareció en las últimas décadas como un patógeno intrahospitalario multirresistente. A pesar de su perfil controversial, E. faecalis forma parte de productos alimenticios. La capacidad de las bacterias de adaptarse a los ambientes fluctuantes, requiere del movimiento rápido de tres iones: protones, sodio y potasio. En los últimos años, se han caracterizado varios sistemas de transporte de potasio (K+) en microorganismos patógenos y no patógenos. Sin embargo, el conocimiento de la homeostasis de este catión es limitado en BAL y, particularmente, en Enterococcus. El desarrollo del presente trabajo de tesis permitió profundizar en el conocimiento de la función biológica del transporte de potasio en E. faecalis. Los estudios bioinformáticos realizados permitieron identificar cinco sistemas de captación de K+ en E. faecalis: Kdp, Kup, KimA y dos miembros del sistema Ktr. Además, los estudios de distribución de estos sistemas en E. faecalis mostraron que, mientras Ktr, Kup y KimA están presentes en la mayoría de las cepas analizadas, Kdp está presente en 21% de estas cepas, asociado con aislamientos clínicos. Estudios de expresión heteróloga y análisis del fenotipo de mutantes deficientes en el transporte de K+, indicaron que los sistemas Kup, KimA y Ktr de la cepa E. faecalis JH2-2 son funcionales y mostraron que, el sistema Ktr desempeña un papel importante en la adaptación al estrés hiperosmótico y al pH alcalino, y que Kup funciona de forma secundaria a Ktr. Además, estos estudios permitieron evidenciar que el transportador KimA es operativo a altas concentraciones de potasio. Los estudios transcripcionales de los genes que codifican para Kup y KimA de E. faecalis, reconocidos recientemente como miembros de la misma familia de transportadores de potasio KUP, mostraron, mediante fusiones a genes reporteros y cuantificación de transcriptos, una inducción de ambos genes a pH ácido. Sin embargo, se comprobó que la presencia de la secuencia de inserción IS6770 en la región promotora del gen kup en la cepa JH2-2, alteró su expresión a bajo pH. Asimismo, se observó una inducción de los genes kimA y kup frente a condiciones de estrés por bajo potasio y alta concentración de sales, cuando se evaluó su expresión en condiciones alcalinas. Por otro lado, en el ámbito de la señalización celular, se observó una regulación negativa de la actividad de Kup de E. faecalis por parte del segundo mensajero c-di-AMP, mientras que no se observó efecto sobre KimA. En cuanto a la distribución de los genes codificantes para Kup y KimA, estudios iniciales mostraron que la presencia de ambos transportadores no es exclusiva de E. faecalis, sino que se encuentran en otras bacterias de interés industrial y clínico
Embargo
Búsqueda de compuestos bioactivos que interfieran con la lipoilación de proteínas en microorganismos patógenos
(2024) Scattolini, Albertina; Mansilla, María Cecilia; https://orcid.org/0000-0001-7421-2039
El ácido lipoico (AL) es un compuesto organosulfurado distribuido ampliamente en la Naturaleza. Es un cofactor esencial requerido para el funcionamiento de seis complejos multienzimáticos involucrados en el metabolismo oxidativo (piruvato deshidrogenasa, PDH; 2-oxoglutarato deshidrogenasa; deshidrogenasa de cetoácidos ramificados; oxoadipato deshidrogenasa y acetoína deshidrogenasa) y de un carbono (sistema de clivaje de la glicina, GCS). El AL se encuentra unido covalentemente mediante un enlace amida a residuos de lisina presentes en dominios de lipoilación (DL) que se encuentran altamente conservados dentro de las subunidades E2 de las deshidrogenasas o la subunidad H del GCS (GcvH). Gran parte del conocimiento sobre el metabolismo del AL proviene de investigaciones realizadas en bacterias modelo como Escherichia coli y Bacillus subtilis. Mientras que la bacteria modelo Gram-negativa emplea la vía clásica para el metabolismo del AL, la Gram-positiva utiliza el mecanismo del "lipoyl-relay". En esta última, la octanoiltransferasa (LipM) modifica exclusivamente GcvH. La octanoil-GcvH generada se convierte en sustrato para la lipoato sintasa (LipA), que inserta dos átomos de azufre en los carbonos 6 y 8 del octanoato, culminando en la lipoilación de GcvH. Posteriormente, la amidotransferasa LipL, una enzima presente únicamente en la vía de tipo lipoyl-relay, transfiere la porción lipoílo a los restantes complejos enzimáticos dependientes de AL. Además, se identificó que esta bacteria utiliza la acción combinada de una lipoato ligasa (LplJ) y de LipL para modificar sus apoproteínas con AL proveniente del medio extracelular. Las vías de lipoilación, inicialmente descubiertas en bacterias, ofrecen información crucial sobre el metabolismo del AL en organismos eucariotas. En el caso de las plantas, emplean vías similares a las observadas en E. coli, mientras que los hongos y mamíferos utilizan rutas metabólicas más parecidas a las encontradas en B. subtilis. La investigación de las rutas de biosíntesis y utilización de AL en microorganismos ha ganado gran relevancia, especialmente en relación con la patogénesis, por lo que se constituye en un prometedor blanco para nuevas terapias antimicrobianas. En este trabajo nos propusimos identificar compuestos que afecten la actividad de enzimas requeridas para la lipoilación proteica en bacterias Gram-positivas patógenas y parásitos responsables de diversas enfermedades desatendidas a nivel mundial. Staphylococcus aureus es una bacteria Gram-positiva que puede causar enfermedades en prácticamente cualquier tejido y se manifiesta más comúnmente como bacteriemia, osteomielitis, neumonía e infecciones de la piel. Esta bacteria puede evadir los leucocitos fagocíticos produciendo factores de virulencia que inhiben su actividad antimicrobiana. Se demostró que S. aureus secreta la subunidad E2 de la PDH lipoilada al medio extracelular, que actúa como un inmunosupresor, promoviendo la virulencia de la bacteria. Por el contrario, la presencia de la E2-PDH no modificada, induce una mayor producción de citoquinas proinflamatorias por parte del huésped, permitiendo el control de la infección. La vía de rescate de AL en S. aureus incluye dos lipoato ligasas, LplA1 y LplA2, dos proteínas H y la amidotransferasa LipL, que da como resultado la lipoilación de los complejos deshidrogenasa, incluida la PDH. Para intervenir la lipoilación proteica, planteamos una estrategia que consiste en utilizar análogos de sustrato que puedan ser ligados a las E2s y afectar su funcionalidad. Se diseñaron compuestos dirigidos al sitio activo de LplA2 y se analizó su efecto en el crecimiento de dos bacterias Grampositivas, S. aureus y B. subtilis. Tres análogos afectaron el crecimiento en medio mínimo de una cepa salvaje de S. aureus, en concentraciones que oscilaron entre 6,6 y 24 µM, mientras que no produjeron ningún efecto en B. subtilis. Realizando un análisis más detallado con el compuesto más potente, Lpl-004, pudimos observar que el mismo estaba siendo transferido a las subunidades E2 de los complejos deshidrogenasa. Como consecuencia se generó un impacto negativo en su funcionalidad, que pudo restaurarse agregando los productos de los complejos enzimáticos dependientes de lipoato. No se observó efecto de este compuesto sobre el crecimiento de una cepa de S. aureus doble mutante en las lipoato ligasas, lo que nos permitió concluir que la inhibición de Lpl-004 es dependiente de la actividad ligasa. Cuando Caenorhabditis elegans fue infectado con la cepa salvaje de S. aureus, la presencia de Lpl-004 causó una esperanza de vida significativamente mayor en comparación con la condición sin el compuesto. Asimismo, pudimos observar que la presencia del compuesto no produjo cambios en la vida media del gusano al ser infectado con la bacteria deficiente en ambas lipoato ligasas. Como sucede en humanos, C. elegans no posee vía de salvataje de AL por lo que este compuesto no puede afectar la viabilidad del hospedador. Nuestros resultados proporcionan evidencia de que las moléculas pequeñas que pueden ser tomadas por la vía de recuperación de AL representan una estrategia innovadora para el desarrollo de nuevas sustancias antimicrobianas. El conocimiento sobre el mecanismo involucrado en la lipoilación de proteínas en protozoarios parásitos, como los causantes de la enfermedad del sueño, de la enfermedad de Chagas y la malaria, es crucial para la generación de nuevos fármacos que apunten a esta vía. Estos parásitos, que causan enfermedades infecciosas en los seres humanos, constituyen una importante amenaza para la salud y son responsables de más de un millón de muertes al año. Hay evidencia en la bibliografía de que el ácido 8-bromo-octanoico (BrO), un análogo del AL, afecta la sobrevida de diferentes parásitos. Utilizando colecciones de mutantes de B. subtilis defectuosas en el metabolismo de AL, reunimos evidencia que nos permitió proponer por primera vez que la vía de tipo lipoyl-relay también está presente en protozoos parasitarios. Mediante un enfoque genético inverso asignamos actividad amidotransferasa a los productos de los genes Tb927.8.630 (TblipL) de Trypanosoma brucei y PF3D7_0923600 (LipL2) de Plasmodium falciparum. El modelo de B. subtilis nos permitió, además, identificar las amidotransferasas de estos parásitos como blanco del BrO, explicando la pérdida completa de la lipoilación de proteínas y el deterioro del crecimiento causado por este compuesto en T. cruzi. Un análisis exhaustivo de las secuencias aminoacídicas y de los modelados estructurales de diferentes amidotransferasas procariotas y eucariotas nos permitió identificar residuos que se encuentran conservados e involucrados en el mecanismo de acción de estas proteínas. Como se había reportado anteriormente, las amidotransferasas procariotas realizan la transferencia del lipoilo a través de un residuo de cisteína, que está ausente en las de origen eucariota. Propusimos que TbLipL utilizaría una lisina altamente conservada, tanto en enzimas procariotas como eucariotas, para transferir el residuo lipoilo. Mediante mutagénesis sitio dirigida cambiamos ese residuo de lisina por una alanina. La expresión de la proteína mutante no revirtió el defecto de crecimiento de la mutante ΔlipL de B. subtilis, indicando la pérdida de la actividad amidotransferasa de la enzima del parásito. Esta lisina conservada no resultó ser esencial para la actividad de la amidotransferasa de B. subtilis. Este resultado indica que, si bien las amidotransferasas eucariotas y procariotas catalizan la misma reacción, los mecanismos de reacción serían diferentes. Otra característica destacable es que las amidotransferasas eucariotas están conformadas por dos dominios, mientras que las bacterianas están compuestas por un único dominio. El dominio N-terminal de TbLipL presenta homología estructural con la totalidad de LipL de B. subtilis. La eliminación del dominio adicional de TbLipL, que denominamos TbLipLC, generó una pérdida en la actividad proteica. Estos resultados indican que este segundo dominio sería importante para la catálisis o para la correcta estructuración de la proteína de los parásitos. Las amidotransferasas tienen un rol esencial en organismos que emplean un lipoyl-relay para modificar sus apoproteínas, siendo fundamentales tanto en las vías de síntesis como en las de utilización del AL. Por consiguiente, planteamos que estas enzimas poseen un gran potencial como blancos para el desarrollo de nuevos compuestos antimicrobianos y antiparasitarios. Para detectar posibles inhibidores de amidotransferasas bacterianas y de protozoos a través de un screening de alto rendimiento, diseñamos una cepa reportera de B. subtilis. Esta cepa carece de amidotransferasa y expresa la octanoiltransferasa LipB de E. coli. La falta de LipL nos permitió estudiar el comportamiento de las amidotransferasas PfLipL2 o TbLipL cuando eran expresadas bajo el control de un promotor inducible por xilosa. La capacidad del BrO para inhibir las amidotransferasas parasitarias nos sirvió para evaluar la factibilidad de nuestra estrategia reportera. Este modelo podría ser fundamental para la detección de quimioterapéuticos selectivos y más eficientes contra enfermedades producidas por bacterias patógenas o parásitos. Además, los genes que codifican para las amidotransferasas de diferentes organismos también podrían introducirse en la cepa reportera, lo que demuestra una gran versatilidad en la metodología. Hasta donde sabemos, este es el primer método de screening utilizado con éxito para identificar inhibidores de amidotransferasas.
Embargo
Caracterización del papel de α-sinucleína en melanoma: explorando la relación entre cáncer y enfermedades neurodegenerativas
(2024) Malizia, Florencia; Menacho Márquez, Mauricio; https://orcid.org/0000-0003-2386-7013
El melanoma, a pesar de ser el cáncer de piel menos frecuente, se distingue por su agresividad debido a la alta probabilidad de generar metástasis. El mismo surge por la transformación maligna y proliferación descontrolada de los melanocitos. Por otro lado, la enfermedad de Parkinson, el segundo trastorno neurológico más prevalente a nivel mundial, se caracteriza por la pérdida de neuronas dopaminérgicas y la formación de cuerpos de Lewy, inclusiones proteináceas compuestas principalmente por alfa-sinucleína (αS). Esta proteína estructuralmente desordenada en su estado nativo, tiene el potencial de formar fibras amilodes por autoasociación. Estas especies de agregación pueden transmitirse entre neuronas, propagando así la enfermedad. Durante el último tiempo se ha asociado a la enfermedad del Parkinson con el desarrollo de melanoma, planteando a αS como posible conector. Investigaciones recientes indican que, a pesar de su asociación con efectos tóxicos para las neuronas dopaminérgicas, esta proteína podría tener beneficios para las células de melanoma avanzado; sin embargo poco se ha ahondado en su estudio. En este trabajo de tesis, partiendo de la hipótesis de que αS desempeñaría un papel crucial en procesos asociados a la progresión tumoral, nos propusimos examinar la contribución potencial de αS en los procesos relacionados con el crecimiento de las células de melanoma y la generación de metástasis mediante un enfoque integral que incluye análisis bioinformáticos y estudios in vitro e in vivo. Observamos así que αS está involucrada en procesos moleculares que conducen a una alteración de la proliferación, migración y capacidad clonogénica. Demostramos además que las células de melanoma pueden captar distintas especies de agregación de αS. Estas especies no resultan tóxicas para las células de melanoma en un rango de concentración en que afectan negativamente a células de neuroblastoma; en cambio resultan beneficiosas para el desarrollo de melanoma. Por otro lado, a través de enfoques computacionales observamos una alta asociación entre la expresión de αS y melanoma, predisponiendo su alta expresión a una menor sobrevida de los pacientes. Tras la obtención de genes diferencialmente expresados entre pacientes de melanoma con alta y baja expresión de αS, identificamos vías y componentes celulares que se encuentran sobre-representados asociados a la expresión de esta proteína. Entre las vías asociadas a la expresión de αS cabe resaltar aquellas relacionadas con el metabolismo mitocondrial, la reparación de ADN, la organización de matriz extracelular, el tráfico vesicular y la señalización mediada por receptores acoplados a proteínas G. Nuestros resultados sugieren así que existe un rango de concentración en el cual αS estaría favoreciendo procesos involucrados en la progresión del melanoma y el desarrollo de metástasis a través de la alteración de diferentes funciones y componentes celulares, pudiendo tener implicancias en la transmisión de vesículas transmitiendo así su malignidad. Además, αS tendría un valor pronóstico en pacientes con melanoma.
Embargo
Desarrollo de estrategias constructivas modulares hacia Aaptaminoides e Isatinas naturales y derivados
(2024) Bolivar Ávila, Santiago J.; Larghi, Enrique Leandro; Testero, Sebastián A.
En el marco de esta Tesis Doctoral, se logró la síntesis exitosa de un intermediario avanzado hacia el producto natural marino 5-benciloxi-9-demetoxiaaptamina (III.X). La aplicación de un meticuloso análisis retrosintético reveló el camino sintético, la elección estratégica de grupos protectores y de eugenol como material de partida, una sustancia económica y asequible extraída del clavo de olor (biomasa). La aproximación establecida implicaría la construcción del triciclo ABC del aaptaminoide en cuestión. A pesar del esfuerzo sintético invertido no fue posible acceder al producto natural, razón por la cual se implementó una metodología alternativa basada en la activación C-H. Esta nueva aproximación que utilizó veratrilamina como material de partida, permitió alcanzar un intermediario tricíclico avanzado en apenas siete etapas con un rendimiento global de 41%. Este avance no solo se erige como una valiosa contribución, sino que además abre la puerta a futuras investigaciones que exploren la diversificación estructural mediante reacciones de activación C-H con otros alquenos a la hora de generar nuevos aaptaminoides. En una segunda línea de investigación, se materializó la síntesis total de la isatina natural Melosatina A. La secuencia modular utilizada compartió el mismo material de partida inicial que el derivado aaptamínico, logrando el alcanzar el objetivo sintético en apenas cinco etapas con un rendimiento global del 41%, destacando la última etapa de ciclación basada en la reacción de Martinet. La caracterización estructural de Melosatina A se completó mediante técnicas espectroscópicas y difracción de rayos X en monocristales. De manera innovadora, se exploró el uso de una 4-propenilisatina en una reacción de metátesis cruzada de olefinas, abriendo oportunidades para la diversificación estructural. Bajo la misma estrategia de ciclación, se logró también la síntesis de 11 isatinas con rendimientos de moderados a elevados. Aprovechando los amplios estudios reportados del valor como agentes citotóxicos de las isatinas, se realizó un estudio de modelado molecular (Docking, Dinámica molecular y ADMET) sobre la proteína MELK-1, sobre-expresada en cáncer de mama y leucemia. El análisis reveló la afinidad significativa de las isatinas sintetizadas por el receptor proteico, destacando la Melosatina A. Este estudio, combinado con investigaciones in vitro (actualmente en desarrollo) proporcionará información esencial para diseñar la síntesis de nuevos derivados de Melosatina A y otros análogos sintéticos.
Acceso Abierto
Esterilglucósidos, subproductos de la producción de biodiesel, como una nueva materia prima industrial
(2024) Carlucci, Renzo; Labadie, Guillermo Roberto
Las problemáticas globales derivadas de la alta dependencia de los productos petroquímicos han impulsado la búsqueda de alternativas sostenibles, destacándose la producción a partir de materias primas renovables. En Argentina, las biorrefinerías de soja han crecido significativamente en las últimas dos décadas, utilizando el aceite de soja para la producción de biodiesel. Este biocombustible, por su carácter de renovable, representa una opción viable para la transición hacia energías más limpias. Sin embargo, durante el almacenamiento a gran escala del biodiesel, se forman depósitos insolubles, principalmente debido a la presencia de esterilglucósidos, entre otros componentes minoritarios. Para abordar este desafío, recuperamos esterilglucósidos de alta pureza (960 g) a partir de 9 kg de depósitos insolubles mediante un proceso de purificación que incluye lavados con solventes apolares y polares, seguidos de filtración por gravedad. La pureza de los esterilglucósidos, determinada por resonancia magnética nuclear cuantitativa (RMNc), fue superior al 98%. Además, recuperamos los solventes utilizados y el biodiesel ocluido en los depósitos. Ensayamos la viabilidad celular con células de hepatoma humano (Huh7) usando pruebas de MTT, y realizamos estudios in vivo para evaluar el impacto de la administración de SGs. Los resultados mostraron que las células mantenían su viabilidad y los estudios in vivo confirmaron la inocuidad del producto en las concentraciones ensayadas durante un mes de tratamiento. En el desarrollo de métodos para obtener productos de alto valor agregado, diseñamos un proceso de hidrólisis para la obtención de fitosteroles a partir de SGs, usando inicialmente HCl(ac) como agente catalítico. Tras explorar distintas concentraciones de ácido y tiempos de reacción, determinamos que 18 horas eran necesarias para completar la reacción, logrando fitosteroles con un rendimiento del 95% y una pureza superior al 99%, confirmada por CG/MS y RMNc. Para mejorar la eficiencia y reducir el impacto ambiental, optimizamos la hidrólisis usando ácido metansulfónico (MSA). Empleamos un Diseño de Experimentos para identificar los factores significativos y obtuvimos una superficie de respuesta, escalando el proceso hasta 100 g de SGs y obteniendo fitosteroles con rendimientos superiores al 95% y pureza superior al 99%. Comparando los E-factors de métodos tradicionales con nuestro método, demostramos que el nuestro es más amigable con el ambiente. Además, sintetizamos derivados 22-oxo-23,24-bisnor-esteroles debido a su importancia en el desarrollo de moléculas bioactivas. Protegimos el doble enlace interno de los esteroles mediante la formación de ésteres metílicos internos, obteniendo los productos deseados con rendimientos superiores al 75%. Realizamos la ozonólisis para escindir el doble enlace exocíclico del estigmasterol, recuperando derivados de β-sitosterol y campesterol. Posteriormente, obtuvimos los derivados 22-aldehido y 22-OH con rendimientos superiores al 70%, demostrando la viabilidad de utilizar el estigmasterol para obtener derivados sintéticos de interés y recuperando β-sitosterol y campesterol. También exploramos la síntesis de análogos de Olestra®, un sustituto de grasas no calórico, utilizando SGs aislados como sustrato. Sintetizamos tetra-acetil-, tetralauril-, tetrapalmitoil- y tetraoleil-SGs mediante calentamiento asistido por microondas, logrando buenos rendimientos. Evaluamos la síntesis de derivados de acetilo y oleilo mediante síntesis mecanoquímica, obteniendo buenos rendimientos y reduciendo significativamente el uso de solvente y temperatura. Los productos fueron evaluados frente a células Huh7, demostrando que el derivado de oleilo no es tóxico en las concentraciones evaluadas. Queda pendiente la evaluación in vivo para determinar su viabilidad como sustituto de grasas no calórico. En conclusión, los depósitos de biodiesel representan una nueva fuente de SGs explotable industrialmente. Desarrollamos un método de purificación a escala de kilogramos para obtener productos de alto valor agregado. Obtuvimos fitosteroles de alta pureza mediante distintos ácidos a escala de gramos y demostramos su uso en la obtención de derivados sintéticos. Además, sintetizamos derivados de SGs con ácidos grasos como posibles sustitutos de grasas. Los SGs se constituyen así como una nueva plataforma derivada de soja para el desarrollo de productos de alto valor agregado, especialmente nutracéuticos y sustitutos de grasas no calóricos.
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Mecanismos moleculares en la interacción Prunus persica–Taphrina deformans
(2024) Novello, María Angelina; Lara, María Valeria
Las plantaciones de duraznos (Prunus persica) son amenazadas por distintos patógenos como lo es el hongo fitoparásito biotrófico Taphrina deformans. Éste es el agente causal del Torque de la hoja del duraznero. Esta enfermedad no solo tiene efectos directos en el rendimiento y en la calidad de la fruta, sino que compromete la salud general y el vigor de los árboles, haciéndolos más vulnerables a otros estreses bióticos y abióticos, generando pérdidas económicas indirectas pero devastadoras. El Torque se caracteriza por el engrosamiento y enrulamiento de las hojas, acompañado de un cambio en su coloración hacia los rojos y los violetas. Este trabajo de Tesis se centra en el estudio de la interacción entre P. persica y T. deformans, con énfasis en las respuestas del hospedador, con el fin generar conocimiento científico sobre este patosistema para que en el futuro pueda contribuir a la prevención, diagnóstico y control del Torque. El tema de investigación se abordó mediante dos enfoques y se trabajó con tres genotipos con susceptibilidad contrastante: Flavorcrest (FL, susceptible), y las líneas hermanas DOFI84.364.089 (DS, susceptible) y DOFI-84.364.060 (DR, resistente). En el primero se caracterizaron las respuestas tempranas, tanto en el genotipo resistente como en los susceptibles, cuando el hospedador se encuentra con el patógeno con el fin de descifrar las bases moleculares que le confieren la resistencia al genotipo DR. En el segundo enfoque se trabajó con hojas del genotipo DS naturalmente infectadas a campo y que presentan la sintomatología característica del Torque, a fin de obtener un panorama de la reprogramación celular y de los cambios metabólicos que ocurren en las hojas del duraznero una vez que la enfermedad se ha establecido en el hospedador. Así, en la primera de la Tesis se abordó con una perspectiva integral donde se aplicaron técnicas como la transcriptómica, la hormonómica y la proteómica, las cuales fueron complementadas con otros análisis bioquímicos a fin de evidenciar los cambios que el hongo desencadena en el huésped al principio de la infección. Con este fin, se inocularon hojas de las variedades DS, DR y FL en condiciones controladas y se tomaron muestras a las 0, 12 y 96 horas post inoculación (hpi) y se comparó el comportamiento de las muestras inoculadas con respecto a las de 0 hpi. Los cambios más prominentes ocurrieron a las 96 hpi, cuando T. deformans ya había completado el dimorfismo hacia la fase filamentosa. Se encontraron respuestas comunes y específicas de cada variedad. La transcriptómica diferencial llevada a cabo en muestras de DS y DR mostró una mayor cantidad de genes diferencialmente expresado (DEGs) reprimidos que inducidos al comparar las muestras inoculadas con las muestras correspondientes al tiempo cero. El estudio permitió identificar un conjunto de genes codificantes de proteínas relacionadas a la patogénesis (PRs) que estarían involucradas en el mecanismo de defensa. Los resultados señalan la síntesis de compuestos cianogénicos y la producción de HCN en ambos genotipos. Además, los datos sugieren que en las hojas inoculadas se produce el reciclado, reordenamiento y reorganización de la pared celular, la principal barrera de defensa con la que cuentan las células. A su vez, el análisis in silico de los genes diferencialmente expresados con un mismo perfil de expresión permitió identificar a los factores de transcripción (FTs) WRKY72 y WRKY75, y a ABI5 y MYB101 como responsables putativos de la co-regulación de un grupo de genes en DR y en DS, respectivamente. Mediante el perfilado hormonal se cuantificaron exitosamente 41 hormonas, precursores y productos de su degradación que incluyen brasinoesteroides, auxinas, ácido salicílico, etileno, jasmonatos, ácido abscísico y citoquininas; representando el primer estudio hormonómico en hojas de duraznero. Las auxinas, el etileno y los abscisatos fueron modulados únicamente en DS. Los resultados indican que la defensa podría estar principalmente mediada por el etileno mientras que el ác. abscísico estaría involucrado en la regulación de ciertos grupos de genes. Por otro lado, el aumento en el contenido de ácido salicílico, exclusivo de DR, junto con la presencia de cajas de respuesta a esta hormona en los promotores de genes regulados exclusivamente en DR y con función putativa en la defensa, señalan que esta hormona podría mediar, al menos en parte, los eventos bioquímicos que se relacionan con la resistencia característica de DR. Debido a que T. deformans no penetra en la célula, sino que invade y se desarrolla en el espacio apoplástico, se caracterizó el proteoma del apoplasto en hojas de los genotipos FL y DR. La mayor parte de las proteínas fueron misceláneas y no caracterizadas indicando el basto conocimiento que aún queda pendiente por desentrañar en cuanto a las proteínas apoplásticas. El análisis del proteoma diferencial de muestras colectadas a las 12 y 96 vs. las colectadas a las 0 hpi nuevamente mostró la acumulación diferencial de proteínas relacionadas con la reorganización de la pared celular y señaló al apoplasto como un compartimento clave como fuente de proteínas que participan en la percepción y respuesta a patógenos. En la segunda etapa de la Tesis, se diseccionaron y analizaron áreas sintomáticas y asintomáticas de hojas DS con un grado avanzado de la enfermedad (G7) y se compararon con hojas sanas (G0). Se llevó a cabo un enfoque integrado que incluyó metabolómica, lipidómica, proteómica y técnicas bioquímicas complementarias para comprender los desequilibrios bioquímicos que la enfermedad genera en las hojas. Se identificó un comportamiento metabólico diferencial en las áreas sintomáticas en comparación con las áreas asintomáticas o G0. Las regiones sintomáticas se caracterizaron por un funcionamiento y composición cloroplásticos alterados, que incluyen una disminución en la maquinaria fotosintética, alteración en la composición de lípidos plastídicos, disminución de los polímeros y azúcares de reserva y un detrimento de pigmentos fotosintéticos. Los cambios fueron acompañaron de disminuciones en las proteínas relacionadas con la homeostasis redox del cloroplasto y en el índice de doble enlace de los triacilgliceroles. Los metabolismos secundario y de aminoácidos fueron alterados en áreas sintomáticas. La proteómica diferencial reveló la inducción de las vías de los fenilpropanoides y del ácido mevalónico; y la represión de la ruta del fosfato de metileritritol que tiene lugar en los cloroplastos. Además, la composición de aminoácidos fue afectada, con una inducción de proteínas involucradas en la síntesis de la asparagina, que acompañaron el incremento de este aminoácido. En conjunto, los datos obtenidos en la metabolómica y en la proteómica indican un cambio metabólico en las áreas sintomáticas que pasan de ser tejidos fuente, es decir, tejidos fotosintéticos productores de fotoasimilados, a ser tejidos sumidero, que importan azúcares y producen energía a través de la fermentación y la respiración; y obtienen el poder reductor de la ruta de las pentosas fosfato. De esta manera, a medida que progresa la enfermedad, las áreas asintomáticas y las hojas sanas producen menos fotosintatos, limitando la producción de frutas y, en última instancia, la supervivencia de las hojas y de los árboles. Por último, los resultados obtenidos en este trabajo de Tesis permitieron la identificación de genes y proteínas que podrían contribuir con un sistema general de defensa, común a todos los genotipos estudiados. Ciertos grupos de PRs que incluyen a las PR5, PR14 y a las relacionadas a la quitina (PR3, PR4, PR8 y PR11) y a la pared celular fúngica (PR2) fueron inducidas tanto a nivel de transcripto como de proteína en etapas tempranas de la infección y cuando la enfermedad ya ha establecido. Por otro lado, también se detectó otro grupo de proteínas candidatas que podrían formar parte de la estrategia de defensa específica de DR tales como la PR10, la PR12 y la PR17. A su vez, las proteínas puente de Berberina podrían participar del estallido temprano de especies reactivas del oxígeno que se registra en DR y también podrían estar colaborando en la defensa. En síntesis, el desarrollo de este trabajo de Tesis aportó al entendimiento de los mecanismos moleculares y procesos fisiológicos asociados a la estrategia de defensa de P. persica inducida por el ataque de T. deformans, además de contribuir a elucidar y descifrar las bases moleculares de la resistencia del genotipo DOFI-84.364.060 al Torque de la hoja de duraznero. Por otra parte, se avanzó en el entendimiento de los cambios a nivel fisiológico y bioquímico que tienen lugar en la hojas con Torque.
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Nuevos enfoques en el estudio de las infecciones causadas por especies del género Aeromonas: relevancia clínica de la identificación y de la resistencia antimicrobiana
(2021) Rebagliati, Juan Daniel; Colombo, Laura G.R.; Rinaudo, Mariangel
La identificación de especies del género Aeromonas ha sido y continúa siendo compleja debido a la aparición de nuevas especies y a la reclasificación de especies existentes. Si bien la identificación a nivel de género por los distintos métodos resultó ser confiable según nuestro estudio, muchos de ellos tienen sus limitaciones en relación a la identificación a nivel de especie. Es importante considerar que A. dhakensis fue la especie que aislamos con mayor frecuencia, fundamentalmente en pacientes con infecciones de piel y partes blandas, asociadas principalmente a traumatismos ocurridos con exposición al medio ambiente, sobre todo accidentes en la vía pública. Esta especie no se encuentra incluida actualmente en la base de datos de los métodos automatizados de nuestro país (MALDI-TOF, VITEK® 2), por lo que puede identificarse erróneamente, siendo necesaria la genotipificación, técnica poco accesible a laboratorios de baja y mediana complejidad. La identificación por pruebas bioquímicas convencionales siguiendo el esquema Aerokey II modificado mostró buena concordancia con el método de referencia. Los aislamientos identificados por secuenciación del gen gyrB, fundamentalmente de A. dhakensis, podrían ser utilizados en la actualización de la base de datos de MALDI Biotyper ya que la ampliación en el análisis de espectros es una de las mejoras que se implementan desde el Laboratorio Nacional de Referencia. El presente estudio generó un esquema que contribuye a la identificación por distintos métodos estableciendo aquel más conveniente según la complejidad del laboratorio, permitió conocer la prevalencia de las especies en los diferentes procesos infecciosos y el comportamiento de aislamientos locales frente a diferentes agentes antimicrobianos. Verificamos que la resistencia antimicrobiana en el género es especie y método dependiente, particularmente frente a agentes betalactámicos
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Disruptores Endocrinos. Mecanismos de acción consecuencias para la salud humana
(2019) González, María Virginia; Ghersevich, Sergio Albino
Los disruptores endocrinos (EDC) son sustancias exógenas o mezclas que alteran la función del sistema endocrino, ya sea porque interfieren con la síntesis, secreción, transporte, metabolismo, acción de unión o eliminación de hormonas naturales que están presentes en el cuerpo, causando efectos adversos en la salud de un organismo, de su progenie, o de su población. El grupo de moléculas identificadas como EDC es altamente heterogéneo y la exposición se produce al beber agua contaminada, respirar aire contaminado, ingerir alimentos o entrar en contacto con el suelo o productos contaminados. En los últimos años, el aumento de la frecuencia de muchas enfermedades, incluyendo obesidad, diabetes, infertilidad, asma, autismo, trastorno por déficit de atención con hiperactividad, ciertos defectos de nacimiento, cánceres infantiles y cánceres de mama y del tracto reproductivo, llevó a investigar y a concluir que los EDC son responsables en gran medida del desarrollo de las mismas. Este trabajo presenta una revisión de los EDC más relevantes a los que se encuentra expuesta nuestra sociedad. Además, se analizarán fuentes de exposición, mecanismos de acción y las consecuentes alteraciones endócrinas y estudios que se utilizan para la evaluación de los distintos EDC.
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Anticoagulantes orales directos
(2022) Núñez, María Candela; Pratti, Arianna Flavia
La hemostasia es un conjunto de mecanismos fisiológicos que mantienen la fluidez de la sangre y la integridad de la pared vascular. La coagulación sanguínea es un sistema delicadamente equilibrado: la sangre se mantiene en un estado fluido en la vasculatura, pero coagula rápidamente para sellar una lesión. Cuando fallan las funciones hemostáticas, se producen hemorragias o fenómenos trombóticos. La trombosis es responsable de distintas afecciones que pueden llevar a la muerte. Una de cada 4 personas en el mundo muere por patologías causadas por trombosis. Los pacientes que han tenido un primer evento trombótico, necesitan tratamiento médico para reducir el riesgo de recurrencia. La terapia de anticoagulación es una piedra angular para la prevención y tratamiento de estas afecciones. Los nuevos anticoagulantes orales directos reflejan un cambio de paradigma en la prevención del accidente cerebrovascular. Numerosos estudios de investigaciones clínicas han demostrado la eficacia del Dabigatrán Etexilato, Rivaroxabán y Apixabán, y avalan su uso para la profilaxis y tratamiento de la mayoría de los pacientes con tromboembolismo venoso (TEV). Estos DOACS no requieren monitoreo mediante determinaciones de laboratorio, pero en determinadas circunstancias es necesaria la medición de los niveles de fármaco en sangre. Se encuentran disponibles ensayos, de rutina y especializados, para su evaluación y cuantificación.
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Desentrañando los enigmas genéticos: obstáculos epistemológicos en la enseñanza del flujo de información genética en la educación secundaria
(2023) Raffo, María del Luján; Reinoso, Amelia
Tema: Los obstáculos que se presentan al docente en momentos de enseñar los contenidos del eje “el flujo de la información genética”, dentro del espacio curricular de Biología y propuestos en el diseño curricular para el bachiller de Ciencias Naturales en las escuelas secundarias. Problema: ¿Cuáles son las estrategias didácticas de enseñanza que pone en juego el docente para el aprendizaje de los contenidos propuestos en el eje “el flujo de la información genética” establecidos en el diseño curricular para la educación secundaria, de la provincia de Santa Fe, en el Bachiller en Ciencias Naturales? Justificación: Cada año, al inicio del ciclo lectivo, los docentes debemos tener presente el diseño curricular propuesto por el Ministerio de Educación en el cual, se indican los contenidos a enseñar para cada año escolar y cada una de las modalidades ofrecidas desde los diferentes bachilleres que conforman la Escuela Secundaria. Si uno analiza, el caudal del mismo es abrumador, se encuentran distribuidos en dos partes, uno compuesto por un ciclo básico el cual lo integran los cursos de primero y segundo año, planteando la igualdad de contenidos para escuelas de educación secundaria orientadas y escuelas técnicas, y luego un ciclo orientado, vislumbrándose los contenidos desglosados en diferentes bachilleratos, conformando así el ciclo orientado. Las propuestas de enseñanza se establecen mediante tres ejes de contenidos: el organismo humano, el flujo de la información genética, los procesos evolutivos. El siguiente trabajo de investigación, se va a centrar específicamente en los obstáculos epistemológicos que se les presenta al docente, al momento de seleccionar y enseñar los contenidos presentados en el eje “el flujo de la información genética”, dentro del espacio curricular de biología, para la terminalidad Bachiller en Ciencias Naturales. [...]
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Klebsiella pneumoniae hipermucoviscosa: caracterización fenotípica y estudio de marcadores genéticos de hipervirulencia
(2023-12-14) Martínez, Cecilia Anahí; Rinaudo, Mariangel; Marchiaro, Patricia
Klebsiella es un género que incluye bacterias Gram negativas, anaerobias facultativas, que se aisló por primera vez a finales del siglo XIX y su nombre es en honor al microbiólogo alemán Edwin Klebs. Klebsiella se clasifica dentro de la familia Enterobacteriaceae la cual contiene una gran variedad de géneros considerados patógenos humanos, entre ellos, Salmonella, Yersinia, Serratia, Enterobacter, Citrobacter, Kluyvera, Leclercia, Raoultella, Cronobacter, entre otros. Al presente, el género Klebsiella comprende al menos 27 especies incluidas las pertenecientes al complejo de especies de K. pneumoniae (KpSC) y otras especies de Klebsiella (e.g. K. indica, K. terrigena, K. spallanzanii, K. huaxiensis, K. oxytoca, K. grimontii, K. pasteurii y K. michiganensis). La secuenciación del genoma completo, metodología de elección para definir una especie bacteriana, permitió identificar siete filogrupos que pertenecen a KpSC, incluidos K. pneumoniae, K. quasipneumoniae subesp. quasipneumoniae, K. quasipneumoniae subsp. similipneumoniae, K. variicola subsp. variicola, K. variicola subsp. tropica, K. quasivariicola y K. africana. Entre las especies del complejo, K. pneumoniae sensu stricto es la especie prevalente en muestras clínicas y normalmente comprende ~85% de los aislamientos identificados como K. pneumoniae (Kp). Todas las especies del complejo suelen ser erróneamente identificados como K. pneumoniae al utilizar métodos fenotípicos (pruebas bioquímicas) o proteómicos, debido a que poseen características similares. Alternativamente, la secuenciación de determinados genes housekeeping (e.g. gyrA) permiten también identificar las especies del complejo, no obstante, la secuenciación no es una metodología de rutina en el laboratorio clínico. Los métodos modernos de identificación bacteriana de especies incluyendo los secuenciadores y los espectrómetros de masa (MALDI-TOF) realizan análisis comparativos con genomas o cepas de referencia, y requieren bases de datos actualizadas para reflejar una taxonomía precisa. En Argentina, numerosas instituciones de salud han incorporado la técnica de MALDI-TOF al laboratorio clínico. Es así, que en el 2015 se creó la Red Nacional de Identificación Microbiológica por Espectrometría de Masas (RENAEM), la cual aporta actualizaciones para la identificación entre los que encuentra el género Klebsiella. Los estudios epidemiológicos en una población de aislamientos del complejo K. pneumoniae pueden realizarse por la metodología de secuenciación de múltiples alelos incluyendo el análisis filogenético de numerosos genes cromosomales (cgMLST, por core-genome multilocus sequence typing), o alternativamente de 7 genes housekeeping según el esquema propuesto por Pasteur. Estos análisis permiten definir sequenciotipos (ST) o clones, así como grupos clonales (CG) con ST estrechamente relacionados en estudios poblacionales. [...]
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Plásmidos de tipo Rep_3 en la diseminación de genes de beta-lactamasas tipo OXA y la resistencia a carbapenemes en Acinetobacter baumannii
(2023) Sánchez, Rocio Inés; Viale, Alejandro M.; Morán Barrio, Jorgelina
La combinación entre el uso poco racional de antimicrobianos y la capacidad de diferentes bacterias patógenas de adquirir y acumular genes de resistencia a los mismos ha conducido a la selección de poblaciones bacterianas con fenotipos de multirresistencia (MR) en el ambiente nosocomial, y por lo tanto a una disminución acentuada de las opciones terapéuticas para el tratamiento de infecciones. Entre estos, Acinetobacter baumannii es uno de los patógenos de relevancia en infecciones asociadas con altas tasas de morbi-mortalidad. Este microorganismo Gram-negativo, aeróbico no fermentativo, causa complicaciones clínicas tales como neumonía, bacteriemia, infecciones del tracto urinario, infecciones en piel y tejidos blandos, meningitis secundaria, infecciones en heridas y quemaduras, especialmente en pacientes inmunocomprometidos. Ha demostrado una sorprendente capacidad de evolucionar MR ante el tratamiento con diversos antimicrobianos, y la rápida adquisición y diseminación de resistencia adicional a los -lactámicos carbapenemes, uno de los últimos recursos terapéuticos disponibles, constituye así un serio problema para el tratamiento de infecciones. Recientemente la Organización Mundial de la Salud (OMS) estableció una lista de patógenos MR de prioridad para el desarrollo de nuevas herramientas terapéuticas, siendo A. baumannii categorizado de prioridad crítica por su rápida capacidad de adquirir nuevas resistencias incluyendo a los carbapenemes (https://www.who.int/mediacentre/news/releases/2017/Antimicrobial_resistance_VPC_27FEB2017.pdf?ua=1). Abordar este problema en forma racional requiere un conocimiento avanzado de la fisiopatología de este organismo, incluyendo los mecanismos implicados en la adquisición y diseminación de resistencia antibiótica. Los objetivos del presente trabajo de Tesis Doctoral abarcaron el estudio de los principales mecanismos de resistencia a carbapenemes desarrollados por A. baumannii, incluyendo la contribución de reducciones en la permeabilidad de ME y la caracterización detallada de plásmidos de resistencia involucrados en la diseminación del gen de la carbapenemasa blaOXA-58 entre la población nosocomial de este patógeno, con énfasis en cepas del complejo clonal CC15 (esquema Pasteur) prevalente en nuestra región. Los resultados del primer objetivo sobre la contribución de la proteína de membrana externa (PME) CarO de A. baumannii a la resistencia a carbapenemes utilizando estudios genéticos en la cepa modelo de A. baylii ADP1 expresando las distintas variables de CarO de A. baumannii avalan la existencia de diferentes canales con selectividad diferencial hacia sustratos como aminoácidos básicos e imipenem en la ME. También nos indican que reducciones en la permeabilidad a carbapenemes por pérdidas de PME en A. baumannii pueden contribuir a, pero no son determinantes principales de, dichas resistencias. Estudios utilizando geles de poliacrilamida bidimensionales (2D) indicaron que CarO se encuentra en la ME de cepas de A. baumannii así como de recambiantes de ADP1 formando tanto complejos homo-oligoméricos como hetero-oligoméricos con OmpA, la proteína mayoritaria de la ME. Ello apoya la hipótesis de que estos oligómeros podrían generar canales acuosos de mayor diámetro que facilitarían el ingreso de aminoácidos básicos o de carbapenemes a través de esta barrera de permeabilidad. Los resultados del segundo objetivo sobre la caracterización de plásmidos de resistencia a carbapenemes presentes en cepas clínicas locales de A. baumannii perteneciente al CC15 contribuyen a comprender la capacidad de las mismas de diseminar el gen de la carbapenemasa OXA-58 (blaOXA-58) en el ambiente nosocomial. Dichos plásmidos se encuentran en un estado dinámico de formación y resolución de co-integrados mediado por eventos de recombinación sitio-específica empleando sitios reconocidos por recombinasas XerC/D. Ello conduce a la generación de diferentes multi-replicones portando módulos de adaptabilidad conteniendo al gen blaOXA-58, lo cual contribuye a su movilización y diseminación en la población bacteriana mediante transferencia horizontal de genes. La presencia de diferentes módulos de replicación en una misma molécula de plásmido confiere evidentes ventajas para la diseminación y persistencia del co-integrado durante el tránsito por múltiples hospedadores, pero genera interrogantes sobre si todos estos replicones son efectivamente activos o sobre posibles conflictos que conduzcan a la pérdida del mismo o del módulo de adaptabilidad que esta porta. Encontramos que los 4 diferentes módulos replicativos que componen estos multi-replicones se mostraron activos al ser clonados en forma individual en diversos hospedadores del género Acinetobacter, incluyendo cepas nosocomiales y ambientales. Ello indica para los mismos un amplio rango de hospedador frente a eventos de transferencia horizontal, permitiendo así la rápida diseminación de la resistencia dentro de especies del género coexistiendo en el ambiente nosocomial. La caracterización detallada de la secuencia de los distintos módulos replicativos, sumada a ensayos funcionales, indicaron que todos ellos responden al modelo de iterones con regulación negativa del número de copias y donde cada uno posee un gen distintivo para una proteína de inicio de la replicación RepAci de la superfamilia Rep_3. El número de copias por célula de los módulos de replicación clonados en forma individual, medido en hospedadores modelo del género Acinetobacter, varió entre 5 a 8 ubicándolos en el espectro moderado. En uno de ellos identificamos regiones repetitivas independientes de los iterones las cuales se mostraron como reguladores negativos de su replicación, con potencial impacto en la resistencia antibiótica. Demostramos, asimismo, y por vez primera, que replicones Rep_3 de plásmidos de A. baumannii presentan incompatibilidad funcional, desarrollando una metodología a tal efecto. Nuestros resultados indicaron además que las clasificaciones basadas en identidades de secuencia de proteínas RepAci no son buenas predictoras de incompatibilidad funcional, y por ende de la posible coexistencia de diferentes replicones en una misma célula. En síntesis, esta tesis contribuye a definir algunos de los factores involucrados en la evolución y diseminación de resistencia a carbapenemes mediada por plásmidos en la población nosocomial de especies del género Acinetobacter, y pueden contribuir al diseño racional de medidas y herramientas farmacológicas para el control de infecciones debidas a patógenos oportunistas multirresistentes en el ámbito hospitalario.
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Estudio del rol de la Aquaporina-1 en la progresión del colangiocarcinoma
(2023) Gaspari, César Ismael; Gradilone, Sergio Alejandro; Marinelli, Raúl A.
El colangiocarcinoma (CCA) constituye un grupo heterogéneo de tumores de hígado que se originan en las células epiteliales del árbol biliar o colangiocitos. El CCA es asintomático en estadios iniciales, por lo que usualmente se diagnostica en etapas avanzadas, siendo las opciones terapéuticas escasas y el pronóstico de la enfermedad ominoso. Su incidencia y mortalidad se han incrementado en las últimas décadas mundialmente, constituyendo un problema de salud global. A pesar de los avances en la biología del tumor, en su diagnóstico y tratamiento, el pronóstico de los pacientes no ha mejorado sustancialmente en la última década. Por esta razón, existe una necesidad imperiosa de identificar los mecanismos que regulan la progresión del tumor para poder transformarlos en dianas terapéuticas, desarrollar herramientas dirigidas a estos blancos, utilizarlas en pacientes y mejorar el pronóstico de la enfermedad. Las aquaporinas (AQPs) conforman una familia de canales de membrana que facilitan el transporte osmótico de agua como así también la difusión de algunas moléculas pequeñas. La AQP1 fue identificada en 1992 por el Dr. Peter Agre, premio Nobel en Química 2003. Diversas AQPs se expresan en el hígado, específicamente, en colangiocitos se expresan las AQPs 1, 4 y 11. Se ha involucrado a las AQPs en diferentes procesos de las células tumorales, tales como, proliferación, migración, invasión y angiogénesis. No obstante, su rol en el CCA ha sido muy poco estudiado y además, los resultados son controvertidos. Sobre esta base, el Objetivo General de este Trabajo de Tesis fue estudiar el rol de la AQP1 en la progresión del CCA y si su modulación modifica el comportamiento tumoral. Inicialmente se correlacionaron los niveles de expresión de AQP1 con la sobrevida global de un grupo de pacientes con CCA. Los pacientes con menores niveles de expresión de AQP1, presentaron una sobrevida global significativamente inferior. Para los estudios in vitro, utilizamos una línea de CCA intrahepático humana (HuCCT1) en la que se confirmó la expresión intracelular de AQP1 mediante fraccionamiento subcelular e inmunobloting. Luego, desarrollamos un modelo de esta línea celular AQP1 knock-out (KO) mediante la técnica CRISPR/Cas9 y evaluamos posibles efectos en el fenotipo tumoral, mediante ensayos de proliferación y migración en tiempo real. Encontramos que las células AQP1 KO presentaron un aumento significativo tanto en la proliferación como en la migración, sugiriendo una función crucial de la AQP1 en la progresión del tumor. Posteriormente, para dilucidar los mecanismos mediante los cuales la ausencia de AQP1 modifica la agresividad de las células neoplásicas, decidimos hacer un estudio de “Next-Generation Sequencing”. Encontramos 500 genes regulados negativamente y 1083 genes regulados positivamente en las células AQP1 KO. A continuación, estudiamos algunas de las biofunciones identificadas. Basándonos en estudios de otros grupos en los que se asocian las AQPs con la transición epiteliomesénquima (EMT), decidimos focalizarnos en este programa celular. Mediante PCR de tiempo real e inmunobloting, detectamos pérdida de expresión de marcadores epiteliales y sobreexpresión de marcadores mesenquimales en las células AQP1 KO, confirmando una activación de la EMT. Seguidamente, decidimos explorar las vías de señalización involucradas en estos cambios del fenotipo tumoral. Basándonos en nuestros resultados de “Nextgeneration Sequencing” y en publicaciones, estudiamos el eje ‘insulin-like growth factor 2/insulin receptor pathway/insulin-like growth factor receptor 1” (IGF2/IR/IGFR1) como ruta de señalización potencialmente involucrada en proliferación y migración. Mediante la evaluación de la expresión por PCR en tiempo real de la expresión de ciertos genes relacionados con la ruta de señalización y utilizando la técnica de inmunobloting para analizar los niveles de fosforilación de los receptores, observamos un aumento significativo en la activación de la vía en las células AQP1 KO. El tratamiento con Linsitinib redujo la proliferación en estas células, lo que respalda la importancia de esta vía. Finalmente, se realizó un modelo de xenotransplante en ratones utilizando células AQP1 KO, que mostraron un crecimiento tumoral más rápido y una menor expresión del marcador epitelial CDH1, confirmando la agresividad de estas células. En resumen, las células de CCA deficientes en AQP1 presentan un fenotipo más agresivo in vitro; se confirmó una disminución de los marcadores epiteliales y un aumento de los marcadores mesenquimales, lo cual indica que la falta de AQP1 activa el programa de EMT, y por lo tanto aumentado su capacidad metastásica. Estos hallazgos fueron reproducidos en un modelo de xenotransplante in vivo. Cuando se analizó una cohorte de pacientes con CCA se comprobó una correlación entre expresión de AQP1 y sobrevida global. En conclusión, este estudio sugiere que AQP1 desempeña un papel crucial en la supresión de la tumorigenicidad en células de CCA intrahepático. Los resultados respaldan la importancia de investigar y comprender los mecanismos subyacentes en el CCA para mejorar las opciones de tratamiento y el pronóstico de los pacientes.
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Mejoramiento biotecnológico de la calidad del durazno, mapeo por asociación de caracteres de interés agronómico
(2023) Aballay, Maximiliano Martín; Sánchez, Gerardo; Cervigni, Gerardo Domingo Lucio
El duraznero es una especie que pertenece a la familia Rosaceae, el cual presenta un periodo juvenil que requiere entre 3 a 4 años para desarrollarse completamente. Debido al carácter auto-compatible y los extensos periodos de generación, esta especie posee una reducida variabilidad genética en comparación con otras. Estas características dificultan el mejoramiento del duraznero, por lo cual es de vital importancia implementar herramientas que modernicen los programas de mejora con el fin de escalar el desarrollo de nuevas variedades. Durante los últimos años se han producido grandes avances en las tecnologías de secuenciación, que han impulsado los estudios genómicos de duraznero. Esto permitió la implementación de la metodología GenomeWide Association Study (GWAS), para identificar variantes genéticas vinculadas a caracteres fenotípicos. Sin embargo, la complejidad de los caracteres poligénicos y la dificultad para diferenciar las variantes causales de otras altamente correlacionadas son las principales limitaciones de GWAS. Una alternativa de interés para este tipo de análisis, es el algoritmo de aprendizaje automático Random Forest (RF), el cual puede analizar grandes conjuntos de datos genómicos, y definir la influencia que tienen las variantes genéticas sobre los caracteres fenotípicos, siendo capaz de generar predicciones para dichos caracteres. Estas propiedades hacen de RF un método prometedor para ser aplicado en duraznero, ya que el entrenamiento de este tipo de modelos podría ayudar a identificar variantes genéticas asociadas a caracteres fenotípicos complejos, y predecir su comportamiento según la presencia/ausencia de estas variantes. En este trabajo se realizó la puesta a punto de la plataforma de genotipado de alto rendimiento conocida como double digest Restriction-site Associated DNA sequencing (ddRAD-seq) en duraznero, la cual no había sido aplicada en esta especie hasta el momento. Esta plataforma fue utilizada para caracterizar en profundidad la variabilidad genética contenida en la colección de germoplasma de la Estación Experimental Agropecuaria (EEA) San Pedro. Como resultado de este proceso se genotiparon 237 accesiones de duraznero (en donde se incluyen 3 portainjertos) y 2 ciruelos japoneses. Los datos de secuenciación presentan en promedio 1 M de lecturas de extremos apareados(2 × 250 pb) por genotipo. A partir del alineamiento de las lecturas al genoma de referencia se observó que las mismas se distribuyen de manera uniforme a lo largo de los 8 cromosomas. En la búsqueda de variantes se identificaron un total de 197.906 Single Nucleotide Polymorphisms (SNP), 16.338 Insertions/Deletions (InDel) y 2.712 Simple Sequence Repeats (SSR). Estas variantes luego de ser filtradas utilizando un porcentaje de datos faltantes menor al 10 % y un valor de Minor allele Frequency (MAF) mayor al 1 % se redujeron a 11.871 SNP, 1.214 InDel y 499 SSR (sumando un total de 13.584 variantes). Mediante una combinación de análisis multivariados se describió la relación que existe entre los genotipos de duraznero. Además, con la inclusión de los datos de 48 genotipos de duraznero recientemente secuenciados fue posible describir por primera vez fuentes de variabilidad de germoplasmas naturalizado en el país. Elset de 13.584 variantes genéticas de las 237 accesiones de duraznero fue utilizado para analizar la asociación con caracteres de interés agronómico mediante las metodologías de GWAS y RF. Estos métodos tienen la capacidad de identificar variantes asociadas con un carácter en particular, pero utilizan enfoques diferentes. Al utilizar ambas metodologías se busca comprobar si RF se puede desempeñar de igual manera o mejor que GWAS en duraznero, además de validar la metodología RF como método de predicción para ser aplicado en el programa de mejoramiento de duraznero. Con estos métodos se analizaron los caracteres color de pulpa, tipo de pulpa, vellosidad del fruto, capacidad antioxidante, contenido de fenoles, firmeza, peso, contenido de sólidos solubles, fecha de floración y fecha de cosecha. Como resultado de este análisis se observó asociación con los dos métodos para los caracteres color de pulpa, tipo de pulpa, vellosidad del fruto, fecha de floración y fecha de cosecha. Los dos métodos apuntan a regiones genómicas similares en cada carácter que presentó asociación. Para cada una de estas regiones se identificaron las principales variantes asociadas con cada carácter, así como también los haplobloques que contienen a dichas variantes. Los datos de las 13.584 variantes genéticas también fueron utilizados para realizar la simulación de cruzamientos entre genotipos y analizar las características de la progenie artificial obtenida. Con el objetivo de evaluar la capacidad de estas simulaciones, primero se generaron una serie de cruzamientos de prueba para comparar con cruzamientos reales que se encuentran junto a los parentales dentro de los 237 genotipos analizados. A partir del análisis de estos datos se observó que con las simulaciones de cruzamientos es posible generar genotipos artificiales con perfiles genómicos cercanos a los originados por cruzamientos reales. Una vez realizada esta validación se procedió a simular todos los cruzamientos posibles entre los 237 genotipos, con una progenie de 100 genotipos artificiales por cruzamiento. Para estos nuevos genotipos se realizaron predicciones utilizando los modelos de RF previamente entrenados con datos de caracteres de vellosidad del fruto, color de pulpa, tipo de pulpa, fecha de floración y fecha de cosecha. Como resultado de esta serie de simulaciones se obtuvo un total de 2.820.300 genotipos artificiales, para los cuales se predijo el comportamiento de cada uno de los caracteres mencionados. Con estas predicciones es posible identificar aquellos genotipos artificiales que presentan las características de mayor interés y reconocer la combinación de parentales de la cual provienen. De esta manera se puede realizar una selección más rigurosa de parentales a cruzar, ayudando a desarrollar un programa de mejoramiento de duraznero más eficiente
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Desarrollo de fosfolipasas y procesos sustentables para el tratamiento de aceites vegetales
(2023) Val, Diego S.; Menzella, Hugo G.; Peirú, Salvador
La creciente demanda de alimentos y biocombustibles exige a la industria de aceites vegetales tecnologías sustentables para mitigar la contaminación causada por los procesos de refinación química. En las últimas dos décadas, varios métodos enzimáticos han demostrado ser eficientes en la reducción de los residuos generados. Sin embargo, todavía es necesario mejorar la relación costo-beneficio de dichos procesos para lograr la adopción generalizada de estas tecnologías. En particular, el desgomado enzimático con fosfolipasas tipo C (PLCs) es una tecnología innovadora que provee un beneficio económico inmediato, al extraer cantidades adicionales de aceite desgomado. No obstante, las PLCs naturales no son activas en las condiciones en las que operan las plantas de refinación de aceite, por lo que estas necesitan ser modificadas insertando operaciones unitarias adicionales. A pesar de los beneficios evidentes de este proceso amigable con el medio ambiente la necesidad de invertir en equipos previo a su implementación y los gastos operativos asociados al proceso son una barrera para su adopción masiva. Una solución a este desafío podría ser el diseño de enzimas con características especialmente adaptadas a las condiciones físicas en las que operan las plantas actuales de la industria aceitera. En este trabajo de tesis se seleccionaron y analizaron secuencias homólogas a la enzima modelo fosfolipasa C de Bacillus cereus (CePLC) de diferentes fuentes y se eligióun subconjunto de ejemplos para expresar y caracterizar. A continuación, utilizando un conjunto de 13 secuencias homólogas se obtuvo una secuencia no natural (ChPLC) aplicando la estrategia de diseño de secuencia consenso. Las enzimas se expresaron en el hospedador C. glutamicum y se comparó la actividad y estabilidad de las enzimas a distintas temperaturas. La enzima sintética ChPLC exhibió los mejores resultados tanto en parámetros cinéticos como en ensayos de estabilidad térmica en medio acuoso. En ensayos de desgomado en aceite crudo de soja, ChPLC demostró ser eficiente a altas temperaturas. En base a estos resultados se elaboró un análisis de secuencias y modelado estructural que permitió identificar los sitios con mayor probabilidad de ser responsables del aumento de estabilidad. Se demostró experimentalmente que mutaciones puntuales en estos sitios alteran el proceso de desplegado de ChPLC, desestabilizando la enzima consenso. Para que ChPLC sea comercializada en el mercado local e internacional, es necesario producir la enzima a costos competitivos en comparación con las alternativas comerciales actuales. Con este objetivo, se optimizó la producción de ChPLC en cultivos de alta densidad en Corynebacterium glutamicum, el hospedador inicial que se eligió para su producción en el laboratorio, logrando un título de 1,2 g/L. Se demostró mediante un sencillo análisis de costos que los títulos obtenidos en la producción de la enzima en este trabajo doctoral deben mejorarse hasta diez veces para que la producción de la misma sea rentable. A continuación, se demostró que la enzima ChPLC posee la estabilidad térmica y la eficiencia necesarias para establecer un proceso que se ajuste al corto tiempo de residencia y a la alta temperatura que se utiliza en el proceso de desgomado con agua en las plantas de refinación tradicionales. Además, se demostró que con el 60 % de la dosis recomendada para las fosfolipasas comerciales, la enzima sintética genera un 2 % de aceite adicional. En base a estos resultados, y mediante un análisis tecno-económico, se predijo que la enzima ChPLC sería capaz de reducir los costos del desgomado enzimático en un 58 %. Esto proporciona la solución necesaria para promover la adopción global de esta tecnología por parte de refinerías de todos los tamaños sin inversiones de capital. Se espera que esta tecnología tenga especial impacto en mercados como el de nuestro país, donde el 90 % de las refinerías realizan desgomado acuoso. Su implementación en nuestro país generaría 180 mil toneladas de aceite de soja adicionales, con un valor exportable para Argentina superior a los 200 millones de dólares, al precio actual del aceite de soja. El proceso presentado en esta tesis fue concebido para que sea accesible a todos los productores de aceite vegetal, independientemente de su capacidad de procesamiento y ubicación geográfica, trayendo un potencial beneficio anual para la economía global en el rango de mil millones de dólares, considerando únicamente su aplicación en el refinado de aceite de soja.
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Caracterización del secretoma del microalga Scenedesmus sp. y su participación en la degradación de celulosa
(2023) Velázquez, María Belén; Menzella, Hugo G.; Peirú, Salvador
Las microalgas son microorganismos unicelulares o pluricelulares simples, que se extienden por todo el planeta ocupando tanto ecosistemas acuáticos como terrestres. Gracias a esta organización celular sencilla son capaces de vivir en condiciones ambientales adversas y proliferar rápidamente (do Nascimento, 2015). Junto con las cianobacterias, conforman la base de toda la cadena trófica. A pesar de su organización celular simple, tienen un metabolismo complejo, propio de los eucariotas, realizan fotosíntesis, sintetizan polímeros complejos, producen vitaminas y antioxidantes (Potvin, 2010). Las microalgas, especialmente las pertenecientes a las Chlorococales, se han utilizado tradicionalmente para la alimentación de especies acuáticas. En los últimos años, se ha renovado el interés por las mismas debido a su capacidad para producir numerosos compuestos de valor agregado, y al mejor entendimiento de su metabolismo y capacidad de generación de bioestimulantes, biofertilizantes, y biopesticidas en procesos altamente rentables, como la implementación de biorrefinerías. La generación de recursos energéticos renovables y la gestión de residuos son las principales preocupaciones del siglo XXI. Los residuos agrícolas y forestales lignocelulósicos son una materia prima prometedora para la producción de biocombustibles y productos de valor añadido debido a su alta disponibilidad y bajo costo (do Nascimento, 2015). Sin embargo, todavía no se ha publicado ningún proceso comercial para la hidrólisis enzimática de la celulosa. La razón principal es el alto costo de las enzimas necesarias, la baja actividad específica, la susceptibilidad a la inactivación y la dificultad de reciclaje (Potvin, 2010). La línea de investigación del laboratorio en la que se basa este trabajo tiene como objetivo combinar el potencial de crecimiento de las microalgas y su versatilidad, con el aprovechamiento de residuos agroindustriales. En mi trabajo de tesis comenzamos con el aislamiento e identificación de algas nativas del Rio Paraná para utilizarlas como fuente de nuevas enzimas y productos de interés industrial. Para ello, obtuvimos la autorización de la Dirección de Recursos Naturales de la provincia para la toma de muestra y la creación de un banco de microalgas regionales de la provincia de Santa Fe. En la primera recolección de muestras de agua, se aisló una cepa de microalga con actividad degradativa de celulosa, Scenedesmus sp. base de este plan de tesis. Scenedesmus es un género algal ampliamente distribuido en agua dulce, con un tamaño aproximado de 20 µm. Una característica distintiva de dicho género es el crecimiento en grupos (o coenobium) que van desde cuatro a diez o más células unidas. Sus células más externas pueden contener espinas, las cuales son un grupo de soportes largos unidos que permiten que el coenobium flote. Scenedesmus, como otros miembros de los Chlorococcales, contiene altas proporciones de proteínas y lípidos, y posee una excelente capacidad de tratamiento de aguas residuales, secuestro de CO2 y adaptación a condiciones ambientales extremas (Chng., 2016). Actualmente, el género Scenedesmus está siendo explotado eficientemente para obtener bioestimulantes a partir del tratamiento de aguas residuales o de purines de cerdo (Sánchez-Zurano, 2021). Sin embargo, la presencia de celulasas y la capacidad celulolítica de este género de algas es poco conocida. En 1970 Burczyk y colaboradores (Burczyk, 1970), informaron la presencia de celulasas extracelulares en Scenedesmus obliquus. Casi en simultáneo Dvořáková-Hladká (Dvořáková-Hladká, 1971) y colaboradores informaron actividad beta-glucosidasa en S. obliquus, que le permite crecer utilizando celobiosa como sustrato. En 2012, Blifernez-Klassen y colaboradores (Blifernez-Klassen, 2012) informaron que la microalga fotoheterótrofa Chlamydomonas reinhardtii, es capaz de degradar y asimilar celulosa exógena (Gan, 2003). Este interesante hallazgo nos llevó a buscar celulasas en nuestro organismo de estudio. Las celulasas hidrolizan los enlaces β-1,4 glucosídicos del polímero de glucosa por dos vías diferentes, las endoglucanasas cortan posiciones aleatorias a lo largo de la cadena de celulosa, y las exoglucanasas actúan progresivamente sobre los extremos terminales del polímero, liberando moléculas de glucosa, o celobiosa. Finalmente, las moléculas de celobiosa producidas son convertidas en glucosa por las betaglucosidasas intra y extracelulares (EC 3.2.1.21), las celudextrinasas (EC 3.2.1.4) y las celudextrinas fosforilasas (EC 2.4.1.49), dependiendo de las características de cada especie celulolítica (Gan, 2003). Aparte de estar presentes en heterótrofos, las celulasas pertenecientes a la familia de las glicósido hidrolasas (GH9) también se han descrito en plantas superiores. Sin embargo, se ha informado que las celulasas de las plantas participan en la biosíntesis y remodelación de la celulosa más que en su degradación (Imoto, 2005). En este trabajo de tesis se describen los pasos realizados para la identificación del género y especie del organismo en estudio. Resultando un aislamiento de una Scenedesmus que corresponde a una cepa de S. quadricauda que denominamos, S. quadricauda SFE-03. Hemos puesto a punto los parámetros óptimos de crecimiento del alga para la secreción de celulasas a escala de laboratorio. Purificamos las enzimas responsables de esta actividad hidrolítica, y caracterizaremos su eficiencia y estabilidad enzimática en condiciones estándar y ante la adición de compuestos usualmente presentes en la hidrólisis industrial de la lignocelulosa. Hemos probado sustratos naturales (cascarilla de soja, rastrojo de trigo, cascara de girasol) observando actividad sobre los mismos y hemos escalado la producción hasta reactores de 10 litros. Los cultivos líquidos de la cepa nativa de S. quadricauda SFE-03, se crecieron fototróficamente en tres medios distintos: B3N, MM con alto contenido en sal y mixotróficamente en TAP o B3N, añadiendo diferentes fuentes de carbono, en ciclos de luz/oscuridad 12:12 y en oscuridad continua sin burbujeo. Para evaluar las condiciones óptimas para la secreción de celulasa, las algas se cultivaron a diferentes temperaturas (T) y pH, en placas de agar con carboximetilcelulosa (CMC) y celobiosa (CB) al 0.1 % (p/v). El mayor crecimiento de las algas se produjo a un pH igual a 7 en el medio B3N + CB a una temperatura de 24 °C. Por otro lado, al ensayar actividades hidrolíticas frente a distintos sustratos, se obtuvo una actividad mayoritaria en zimogramas y en medio líquido in vitro sobre celobiosa, sugiriendo la presencia de actividad β-glucosidasa en el sobrenadante de nuestra cepa. Se secuenció el genoma y transcriptoma de nuestra cepa nativa mediante secuenciación Illumina Novoseq en la empresa Novogen de Estados Unidos, con una cobertura de 100x y una longitud de fragmentos igual a 350pb de extremos apareados. Luego del análisis y curado de la calidad de las lecturas, realizamos el ensamblado del genoma y el transcriptoma junto con la predicción de productos génicos. Se encontraron 45540 ORF completos en la transcriptómica. Las proteínas fueron predichas con Blast2go (Götz, 2008) y realizamos búsquedas de glucosilhidrolasas de diferentes familias presentes en otros miembros del clado Viridiplantae. Se encontraron homólogos de GH1, GH5, GH9 y GH10. Hemos identificado genes de celulasas (GH1, GH5 y GH9) en la secuencia del genoma de S. quadricauda LWG002611 que no habían sido reportados a la fecha, y de S.quadricauda SFE-03. Además, hemos realizado un análisis bioinformático comparativo en varios genomas de algas Scenedesmaceae disponibles (S. obliquus EN0004 v1.0, S. obliquus UTEX B 3031, S. obliquus var. DOE0013 v1., S. sp. NREL 46B-D3 v1.0, Tetradesmus deserticola SNI-2 v1.0). La mayoría de las secuencias estudiadas presentaban una mayor similitud de secuencia con enzimas de invertebrados, hongos, bacterias y otras microalgas que con celulasas de plantas; y los datos de modelado 3D obtenidos mostraron que tanto las principales estructuras de las proteínas modeladas como los principales residuos de aminoácidos implicados en la catálisis y la unión a sustrato están bien conservados en las enzimas de S. quadricauda SFE-03. Con el propósito de caracterizar la pared de S. quadricauda SFE-03 generamos algas transgénicas de nuestra cepa nativa. Se obtuvieron dos clones de algas transformadas con el plásmido pChlamy_3 (Invitrogen) al que se le clonó la secuencia de direccionamiento a pared de una GP2 de C. reinhardtii (Accession Number CAJ98661.1fusionada a la secuencia de uno de los dominios de unión a almidón de la SSIII del mismo alga, SBD3 (Accession Number DQ019314) y luego de su caracterización morfológica mediante tinciones, microscopía confocal y microscopía electrónica de barrido, se ensayó el contenido de pectinas solubles. Las algas transgénicas obtenidas presentan un tamaño celular mayor que las de tipo salvaje y su relación superficie-volumen se ve afectada; este mayor tamaño favorece su floculación. Además, poseen alterados los componentes de la pared celular, en concreto la capa de pectina, que aumenta la unión entre células formando un conglomerado. Observamos una mayor laxitud de la pared celular y un aumento de aproximadamente tres veces la cantidad de pectinas, hecho que concuerda con el fenotipo obtenido en las plantas transgénicas. El estudio del crecimiento en fotobiorreactores es clave para aumentar la productividad en las microalgas. A finales del año 2021, resulté beneficiada con una beca de investigación con perspectiva de género nacional e internacional de la provincia de Santa Fe, para viajar a Almería España a la mayor planta de producción de biomasa algal en Europa con proyectos financiados por la Unión Europea. La estadía, para completar mi trabajo de tesis doctoral, amplió mi conocimiento en este campo, aún no explotado en Argentina, adquirí los conocimientos necesarios para el manejo y puesta a punto de cultivos a gran escala de microalgas y el manejo de fotobiorreactores, cosechadoras y concentradores industriales. Este trabajo presenta la optimización de un medio de cultivo económico (considerando volúmenes de hasta 12 000 litros) para el crecimiento de Tetraselmis chuii (una cepa recientemente aprobada para consumo humano) considerando una intensidad de luz e inyección de CO2 específicas. Además, para esta alga y Spirulina platensis (Artrospira) y Chlorella vulgaris se estudió la eficiencia fotosintética, a irradiancia fija y variable, así como las cantidades de proteínas, carbohidratos, lípidos y clorofilas en diferentes días de cultivo a escala de laboratorio. El análisis de la eficiencia del transporte de electrones de las tres cepas nos permitió concluir que T. chuii es una buena cepa para el cultivo externo en fotobiorreactores abiertos y además, los rendimientos cuánticos fueron similares a los de C. vulgaris, cepa actualmente utilizada en los mercados actuales. Además, se espera que el rendimiento proteico de esta cepa sea similar al de S. platensis, lo que podría ser de interés, tanto para consumo humano como acuícola o para la obtención de aminoácidos para producir biofertilizantes. Además, como parte de dos experimentos que se estaban llevando a cabo en Almería, se pudo demostrar un gran porcentaje de remoción de la materia orgánica, fosfatos y nitratos presentes en los purines de cerdo, por parte de la cepa de S. almeriensis. Por otro lado, en la puesta a punto del tratamiento de aguas residuales, se demostró un buen crecimiento algal en los reactores raceway de volúmenes de hasta 12000 litros con ese medio de cultivo. En dichos procesos operé los reactores de capa fina de 500 litros de cultivo y raceway, de 12 000 litros totales, realizando las medidas de viabilidad y cantidad de nutrientes de cada uno. En nuestro instituto, se pusieron en marcha dos biorreactores de diseño propio, tipo columnas de 10 y 50 litros, con inyección de CO2, y seguimiento de temperatura, oxígeno disuelto, poder redox y pH por un sistema de arduino programado en CEFOBI.
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Biosurfactantes obtenidos a partir de especies de Pseudomonas syringae: producción, caracterización y exploración de sus propiedades fisicoquímicas
(2023) Haidar, Carla Nahir; Pellegrini Malpiedi, Luciana; Nerli, Bibiana Beatriz
Encontrar nuevos compuestos naturales biocompatibles con actividad interfacial/superficial adecuada y baja toxicidad sigue representando un gran desafío en la actualidad para la comunidad científica. En este contexto, este trabajo de tesis doctoral se focalizó en el estudio de la producción de biosurfactantes a partir de bacterias pertenecientes a la especie Pseudomonas syringae. Inicialmente, se realizó un análisis comparativo sobre la producción de biosurfactantes a partir de tres patovares de la especie mencionada: P. syringae pv tabaci, P. syringae pv tomato DC 3000 y P. syringae pv syringae. El mejor desempeño se observó para P. syringae pv tabaci, con productividad de 1,3 g/L y productividad específica de 0,8 g/g; valores significativamente superiores a los alcanzados por las otras cepas. Los análisis preliminares de caracterización química sugirieron la secreción de lipopéptidos para todas las P. syringae. Los extractos obtenidos demostraron una excelente actividad emulsionante y estabilidad frente a distintos compuestos hidrocarbonados. Además, no mostraron efecto citotóxico a dosis inferiores a 10,00 g/L contra la línea celular normal de riñón humano HEK-293, pero sí tuvieron una citotoxicidad diferencial contra líneas celulares tumorales humanas de melanoma SK MEL-28 y carcinoma de mama MDA MB231. En base a estos resultados, se seleccionó a P. syringae pv tabaci como microorganismo productor para ulteriores estudios. Posteriormente, se evaluaron diferentes fuentes de carbono hidrofílicas en el medio de cultivo de P. syringae pv tabaci. De todas ellas, el glicerol resultó ser el más adecuado para la producción de biosurfactantes, siendo seleccionado para ensayar su combinación con una fuente de carbono hidrofóbica: aceite residual de cocina, un producto de desecho altamente contaminante. Se demostró que la inclusión de este residuo indujo a una mayor síntesis de biosurfactantes, incrementando la productividad de 1,5 a 2,7 g/L. Además, el extracto de biosurfactantes a una dosis de 1,00 g/L resultó altamente compatible con las líneas celulares humanas ensayadas previamente, indicando que a las concentraciones de trabajo no es tóxico y, por ende, es adecuado para aplicaciones alimentarias y farmacéuticas. Una identificación más precisa y rigurosa de las moléculas tensoactivas presentes en los medios seleccionados (conteniendo solo glicerol o la combinación glicerol/aceite), fue realizada mediante espectrometría de masas. Se detectaron varios compuestos, entre ellos tres lipopéptidos cíclicos: siringomicina E, artrofactinas y siringopeptina 22-PhvB. Al comparar los compuestos presentes en cada medio, se observó que la inclusión del aceite residual en el medio de cultivo afectó levemente la biosíntesis de los mismos. A posteriori, se realizó una caracterización fisicoquímica de los extractos, focalizando los análisis en las propiedades de actividad superficial y emulsificante. Ambos extractos mostraron una actividad superficial similar, logrando una concentración micelar crítica cercana a los 900 mg/L. Adicionalmente, los mismos fueron capaces de emulsionar una amplia gama de compuestos hidrocarbonados a concentraciones relativamente bajas (0,10 a 1,00 mg/L). Por último, se observó que, para ambos extractos, variaciones en las condiciones experimentales de temperatura, salinidad y pH no afectaron sus propiedades fisicoquímicas. Inclusive, bajo algunas condiciones mejoraron notablemente sus desempeños, denotando un gran potencial para ser utilizados en varias aplicaciones a nivel industrial. Finalmente, se estudió el escalado de los procesos fermentativos mediante el empleo de dos reactores con geometrías diferentes, acoplados a una columna de fraccionamiento de espuma. Los resultados obtenidos demostraron la factibilidad de utilizar este método para integrar la producción y extracción de los biosurfactantes. Estos estudios permitieron concluir que P. syringae pv tabaci resultó ser un microorganismo productor de extractos de biosurfactantes con prometedoras propiedades fisicoquímicas, baja toxicidad y elevada estabilidad. Asimismo, se demostró la factibilidad de escalar el proceso productivo utilizando biorreactores acoplados a una columna de fraccionamiento de espumas.

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