(FBIOyF) Posgrado - Tesis
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Ítem Embargo Estructura e interacciones de proteínas reguladoras del desarrollo en plantas: estudio de HYL1 y la familia GRF(2025) Biglione, Franco Agustín; Rasia, Rodolfo Maximiliano; González Schain, Nahuel DamiánEl crecimiento y desarrollo de las plantas depende de complejos mecanismos regulatorios que controlan de forma precisa y concertada eventos moleculares que ocurren en momentos y tipos celulares determinados. La expresión génica desempeña un papel esencial en la coordinación espaciotemporal de estos procesos, garantizando su correcta ejecución y adaptabilidad a señales internas y externas. Su regulación puede llevarse a cabo mediante diversos mecanismos, incluidos la regulación transcripcional y el silenciamiento génico postranscripcional mediado por microARNs (miARNs). Los factores reguladores del crecimiento (GRFs) y la proteína HYPONASTIC LEAVES 1 (HYL1) desempeñan funciones regulatorias fundamentales durante el desarrollo de las plantas. Mientras que los GRFs son factores de transcripción que participan en procesos que abarcan desde el desarrollo foliar a la tolerancia a la sequía, la proteína HYL1 es un componente del complejo microprocesador que participa en la biogénesis de los miARN. Ambos tipos de proteína comparten la particularidad de poseer una arquitectura estructural en donde su rol biológico se encuentra determinado por las características individuales de dominios funcionalmente divergentes que se encuentran espaciados por regiones conectoras. En ambos casos, su función regulatoria depende de la acción sinérgica de sus dominios modulares, cuya capacidad para reconocer componentes celulares específicos depende de su estructura o motivos a nivel de su secuencia primaria. Sin embargo, los determinantes estructurales que definen la función de ambas proteínas no han sido descriptos en detalle. En esta tesis doctoral se caracterizaron las propiedades estructurales que definen a la familia GRF y a la proteína HYL1. A través de análisis bioinformáticos se encontraron motivos conservados en el dominio de transactivación de los GRFs que sugieren la existencia de cuatro subfamilias funcionalmente divergentes y, además, se identificaron determinantes intrínsecos en su dominio de unión a ADN (WRC) que los distinguen de otras proteínas. Utilizando técnicas biofísicas de alta y baja resolución se logró caracterizar la estructura del dominio WRC, un dedo de zinc no canónico, y se identificaron los residuos responsables de reconocer secuencias cis-regulatorias de los GRFs. A su vez, se caracterizó el carácter modular e independente de los dominios que conforman la arquitectura de HYL1, describiendo su naturaleza monomérica in vitro, y la plasticidad conformacional de su dominio C-terminal desestructurado. En este sentido, el estudio detallado de su dominio de dimerización putativo, un dsRBD no canónico, permitió identificar un puente disulfuro que impone restricciones estructurales esenciales para la función in vivo de HYL1. Los conocimientos generados en este trabajo no solo aportan nueva información sobre la relación estructura-función de proteínas que gobiernan la regulación del desarrollo vegetal sino también contribuyen al desarrollo de las herramientas biotecnológicas emergentes basadas en el módulo regulatorio GRF:GIF.Ítem Embargo Modificación de la dinámica estomática y descarga de fotoasimilados al floema en Nicotiana tabacum: impacto en la eficiencia fotosintética y uso del agua en diferentes condiciones de crecimiento(2025) Oitavén, Pablo Agustín; Drincovich, María Fabiana; Müller, Gabriela LeticiaDesde la Revolución Industrial las concentraciones atmosféricas de CO2 y de otros gases de efecto invernadero se han incrementado considerablemente, llevando a un aumento en la temperatura media anual mundial (Dusenge et al., 2018; Hansen et al., 2010). Se estima que, hacia fin de siglo, este incremento en los gases de efecto invernadero producirá un aumento de temperatura promedio de entre 1 a 3,7 °C (Cook et al., 2014). Sumado a esto, las predicciones indican que se producirá un aumento de las zonas áridas de la tierra, debido a que la atmosfera se volverá más seca en el futuro (Dai, 2013), disminuyendo la posibilidad de incrementar las áreas para producción vegetal. Estos cambios climáticos, sumados al aumento exponencial de la población humana (Gerland et al., 2014), ponen serias dudas en cuanto al sostenimiento de las generaciones futuras, siendo necesario lograr aumentos considerables en el rendimiento agrícola actual (Frommer y Sonnewald, 2000; Edgerton, 2009). Por este motivo, en este trabajo de tesis nos propusimos avanzar en la caracterización fenotípica, bioquímica y molecular de líneas transgénicas de Nicotiana tabacum (KAT1::ZmnonC4-NADP-ME) y estudiar el efecto de posibles condiciones ambientales futuras como alta concentración de CO2, alta temperatura y sequía. Estas líneas transgénicas (ME) fueron generadas durante la tesis doctoral de la Dra. Gabriela L. Müller en el Centro de Estudios Fotosintéticos y Bioquímicos (CEFOBI – CONICET) y presentan características de gran interés como floración temprana, mayor exporte de azucares al floema, menor consumo de agua y mayor biomasa por cantidad de agua consumida, entre otras (Müller et al.; 2018). La relevancia de este análisis reside en el estudio de una estrategia tecnológica que podría permitir la generación de cultivos de interés agronómico aptos para las posibles condiciones ambientales futuras. De este modo, comparamos los perfiles metabolómicos y proteómicos de las hojas de las distintas líneas y observamos diferencias, con respecto a las plantas wild type (WT), en los niveles de diversos aminoácidos, intermediarios del ciclo de Krebs y azúcares; además de variaciones en los niveles de proteínas relacionadas con el ciclo celular, la floración, la señalización hormonal y el metabolismo del carbono. También analizamos la tasa de fijación de CO2, la transpiración a través de los estomas, y diversos parámetros fotosintéticos como la tasa máxima de carboxilación de la Rubisco, la tasa de transporte de electrones y la velocidad de uso de las triosas fosfato. Los resultados indicaron que las líneas transgénicas poseen una mayor eficiencia en el uso del agua acompañado de un aumento en los parámetros fotosintéticos con respecto a las plantas WT. Respecto al efecto de las posibles condiciones climáticas futuras, cuando se crecieron las distintas líneas de Nicotiana tabacum a 38/30 °C día/noche se observó una disminución en la biomasa y el área de las hojas respecto a la condición control (24/18 °C), pero esta disminución fue menor en las plantas ME en comparación con las plantas WT. También se analizó el crecimiento en un ambiente con alta concentración de CO2 (aproximadamente 800 ppm) y en este caso en todas las líneas aumentó tanto el área foliar como la biomasa total respecto a la condición control (aproximadamente 400 ppm). Sin embargo, en las líneas ME crecidas a 800 ppm el peso específico foliar aumentó entre un 15 y un 24%, mientras que en la línea WT este aumento no se observó. Finalmente analizamos el efecto de la sequía en las distintas líneas. Para ello, se suspendió el riego durante 30 y 45 días a plantas de 8 semanas y luego se analizó la capacidad de recuperación, supervivencia y producción de semillas. Si bien todas las plantas sobrevivieron a los 30 días sin riego, las plantas ME tuvieron una mayor recuperación y un mayor número de semillas por planta al finalizar su ciclo de vida. En el caso de la sequía por 45 días las plantas WT no sobrevivieron luego de la rehidratación, mientras que la mayoría de las ME si lo hizo, completando su ciclo de vida con una producción de semillas similar o mayor al de las plantas que no sufrieron el estrés. En su conjunto, este trabajo representa un importante avance en el estudio de una posible estrategia para el mejoramiento de los cultivos a futuro, considerando que mediante la misma se generaron líneas que tienen un mayor aprovechamiento de un recurso tan importante como el agua y que presentan ventajas productivas frente a posibles condiciones ambientales futuras.Ítem Embargo Caracterización de la respuesta metabólica y fisiológica en plantas y cianobacterias frente al estrés toxicológico provocado por la exposición a metales pesados y contaminantes emergentes(2025) Carralero Bon, Iván; Pérez, Leonardo Martín; Salvatierra, Lucas MatíasLos metales pesados representan una de las principales fuentes de contaminación ambiental debido a su persistencia en los ecosistemas y su toxicidad para los organismos vivos. Diversas técnicas de biorremediación han sido desarrolladas como alternativas sostenibles para mitigar su impacto. En este contexto, las cianobacterias se han propuesto como agentes biológicos eficaces, dada su notable capacidad para adsorber y acumular metales en su biomasa, lo que las convierte en una herramienta prometedora para la captación y eliminación de estos contaminantes en sistemas acuáticos. Por tanto, el primer capítulo de esta tesis se centra en el estudio de la cianobacteria de vida libre Oscillatoria sp. expuesta a Cd, Pb, Cu y Zn, con el objetivo de evaluar y comparar la eficiencia de remoción de cada metal, los mecanismos involucrados en la captación de iones divalentes y los efectos fisiológicos asociados a estos bioprocesos. Para tal fin, se obtuvieron cultivos puros de Oscillatoria sp. cedidos por productores locales, y se los subcultivó en condiciones controladas de laboratorio con el agregado de diferentes concentraciones (45 μM, 225 μM y 450 μM) de Cd, Pb, Cu y Zn, tanto en forma independiente como conjunta. Los efectos a nivel celular se evaluaron mediante la determinación de la tasa de crecimiento, la viabilidad, el daño oxidativo, y la concentración de pigmentos fotosintéticos, carbohidratos y proteínas solubles, utilizando métodos espectrofotométricos. Los resultados indicaron una reducción significativa en la biomasa acumulada de Oscillatoria sp. conforme aumentó la concentración de metales en el medio, siendo el Cd y el Cu los elementos más tóxicos. La viabilidad celular disminuyó progresivamente, especialmente frente a la exposición a concentraciones elevadas de los metales. Se detectó una reducción en la producción de clorofila y carotenoides, indicativo de un deterioro en la capacidad fotosintética de estos organismos autótrofos. Asimismo, se observó un incremento en la producción de malondialdehído, evidenciando un elevado grado de daño oxidativo a causa del estrés metálico. En cuanto a la capacidad de remoción de contaminantes del agua, en los cultivos de Oscillatoria sp. tratados con metales se evidenció una reducción de entre un 40% a un 95% en la concentración de iones metálicos, siendo la eficiencia dependiente del tipo de metal, su concentración y el tiempo de exposición. Se determinó que la biosorción superficial fue el mecanismo predominante, con una menor contribución de la bioacumulación intracelular. Estos hallazgos confirman que Oscillatoria sp. es un organismo altamente eficiente para la remoción de metales pesados en sistemas acuáticos. No obstante, esta capacidad puede verse limitada por la toxicidad inherente de cada metal y sus efectos a nivel celular, los cuales se intensifican conforme se acumulan, lo que podría restringir su aplicabilidad en escenarios de contaminación crónica o en sistemas de tratamiento operando a largo plazo. Sumado a la persistencia ambiental de los metales pesados, los derrames de hidrocarburos también representan otra grave amenaza ecológica, afectando tanto a la calidad del suelo, del agua, como a la biodiversidad presente en cada uno de estos ecosistemas. La fitorremediación con gramíneas se ha planteado como una estrategia biotecnológica viable para facilitar la eliminación de hidrocarburos de petróleo, gracias a la acción de los microrganismos que viven asociado al rizoma en distintas especies vegetales. Por ello, en el segundo capítulo de esta tesis se evaluó la capacidad del pasto Vetiver (Chrysopogon zizanioides) para la remoción de combustible diésel en muestras de suelo contaminadas artificialmente con esta mezcla de hidrocarburos, así como el impacto de la presencia de estos compuestos sobre la fisiología de la planta. Para ello, se establecieron ensayos con suelos contaminados con diferentes concentraciones de diésel (2,5%, 5% y 10% p/p). Se cultivaron plantas de Vetiver y se monitoreó su crecimiento mediante la determinación de la biomasa aérea, así como el efecto de la planta en la degradación de los hidrocarburos presentes en el suelo, evaluada mediante cromatografía gaseosa. Adicionalmente, se analizaron indicadores fisiológicos, tales como el contenido de clorofila, proteínas y carbohidratos solubles, para valorar el grado de afectación celular. Finalmente, se evaluó la actividad microbiana en la rizosfera mediante métodos enzimáticos. Los resultados mostraron que Vetiver es capaz de tolerar concentraciones moderadas de diésel sin provocar efectos adversos severos en su crecimiento. En suelos contaminados con 2,5% p/p de diésel, las plantas mostraron un desarrollo comparable al de los cultivos controles, mientras que a concentraciones más altas (5% y 10% p/p) se registró una reducción de 30% y 50%, respectivamente, en la biomasa aérea. Asimismo, se observó una disminución en el contenido de clorofila, sugiriendo un fuerte impacto en la actividad fotosintética. Además, se detectó un aumento en la producción de compuestos antioxidantes como respuesta al estrés oxidativo inducido por la presencia de hidrocarburos. En términos de remoción de diésel, Vetiver logró reducir hasta un 47% la concentración de hidrocarburos en suelos contaminados con 2,5% p/p de diésel en un período de 15 días. Esta degradación se vio favorecida por la actividad microbiana en la rizosfera demostrando que la interacción planta-microorganismo desempeña un papel clave en el proceso de fitorremediación. Por tanto, Vetiver demostró ser una especie con gran potencial para la remediación de suelos impactados con diésel. Su capacidad para estimular la actividad microbiana rizosférica y su tolerancia a la presencia de contaminantes recalcitrantes la convierten en una opción prometedora para la restauración de suelos degradados. Sin embargo, su eficiencia disminuye en suelos con altas concentraciones de hidrocarburos, por lo que se recomienda su aplicación en escenarios de contaminación moderada. En conclusión, los resultados de esta tesis demuestran que tanto Oscillatoria sp. como Vetiver poseen un alto potencial para la biorremediación de metales pesados e hidrocarburos, respectivamente. No obstante, los efectos fisiológicos adversos que experimentan estos organismos fotosintéticos pueden influir negativamente en su eficiencia de remoción. En este sentido, se recomienda continuar explorando estrategias de biorremediación que integren el uso de Oscillatoria sp. y Chrysopogon zizanioides en escenarios de contaminación real, donde las condiciones ambientales y la concentración de compuestos tóxicos suelen ser más variables y complejas que en el laboratorio.Ítem Embargo Bioprospección de recursos biológicos autóctonos para la búsqueda de potenciales productos tripanocidas(2025) Ferretti, Matías Damián; Martínez, María Laura; Larghi, Enrique LeandroEs ampliamente conocido que diversas especies vegetales producen una gran variedad de sustancias químicas, lo que las ubica en la posibilidad de exhibir diferentes propiedades biológicas. Ha sido descripto en bibliografía, que ciertas especies de la familia Simaroubaceae, son utilizadas en la medicina tradicional para el tratamiento de la malaria, la cual es causada por el protozoo parásito Plasmodium falciparum. Si bien esta enfermedad posee baja incidencia en nuestro país, esta zona es endémica para el Mal de Chagas, otra enfermedad de origen parasitario causada por el protozoo Trypanosoma cruzi. Esta enfermedad representa un importante problema de salud pública en los países de Latinoamérica y su tratamiento se basa en el uso de nifurtimox y benznidazol, drogas desarrolladas hace más de 50 años. Las mismas son efectivas en la fase aguda de la enfermedad, sin embargo, en el estado crónico su uso es materia de controversia, además de los importantes efectos secundarios. Por lo tanto, sigue siendo una necesidad imperiosa desarrollar nuevos medicamentos, seguros y eficientes, para superar los inconvenientes que generan los tratamientos utilizados en la actualidad. Por otro lado, Baccharis L. es un género de la familia Asteraceae que comprende un alto número de especies distribuidas en toda América y se caracterizan por producir aceites volátiles (AVs). Diversas especies de Baccharis L. son utilizadas en la medicina tradicional como analgésicos, antiinflamatorios, digestivos, diuréticos y espasmolíticos entre otros. Muchas de las propiedades mencionadas son atribuidas a sus AVs. Los mismos son mezclas complejas que pueden contener entre 20 y 60 compuestos en diferentes concentraciones y son caracterizados por 2 a 5 componentes principales, con concentraciones más altas, comparados con el resto. En general, estos compuestos mayoritarios son los responsables de la actividad biológica descripta para los AVs, por lo que los mismos son una fuente interesante de estos componentes, con potencial efecto tripanocida. En las últimas décadas, se ensayaron compuestos conocidos utilizados comunmente en otros tipos de tratamientos clínicos, tales como amlodipina, atenolol, bisoprolol, ivermectina, meglumina, metformina, paromomicina, pentamidina, pirimetamina y tinidazol, los cuales presentaron actividad tripanocida, pero los resultados no han sido concluyentes en la clínica. La enfermedad de Chagas, al igual que otras enfermedades, se considera una "enfermedad silenciosa y silenciada". Esto se debe a que a menudo pasa desapercibida en su fase aguda, y los pacientes solo se dan cuenta de que están enfermos cuando comienzan a experimentar síntomas cardíacos y digestivos durante la etapa crónica, que puede manifestarse años después. El término "silenciada" refleja el grave desinterés por parte de la industria farmacéutica, tanto en el desarrollo de nuevos medicamentos como en la creación de medios de diagnóstico. Además, la falta de estadísticas precisas sobre la magnitud del problema, la inacción gubernamental en la provisión de medicamentos para el tratamiento y su exclusión de las listas esenciales de medicamentos contribuyen a esta situación. Las personas afectadas por la enfermedad de Chagas se encuentran atrapadas en un círculo vicioso de negligencia y falta de voluntad política para abordar el problema: sin datos adecuados, no hay diagnóstico, sin diagnóstico no hay tratamiento, sin tratamiento no hay demanda, y sin demanda no hay investigación. Romper este ciclo es una tarea que requiere el compromiso de todos los gobiernos, laboratorios farmacéuticos, organismos internacionales y otros actores relevantes. Por todas estas razones, es esencial desarrollar o identificar nuevas moléculas y compuestos que aún no han sido evaluados, con el fin de proporcionar alternativas efectivas a los tratamientos actuales. En el presente trabajo se desarrolló un programa de prospección para investigar la actividad tripanocida de extractos y AVs obtenidos a partir de plantas nativas. Se prestó especial atención al uso de la información etnobotánica para la selección de las plantas, orientando la búsqueda hacia compuestos con actividad biológica que podrían ser relevantes para el desarrollo de nuevas fuentes de medicamentos. Se seleccionaron las especies vegetales autóctonas Castela coccinea Griseb. (Simaroubaceae), Baccharis spicata (Lam.) Baill. (Asteraceae) y Baccharis punctulata DC. (Asteraceae), que están ampliamente distribuidas en nuestra región y son accesibles para su recolección. Se obtuvieron extractos y fracciones de estas plantas, así como aceites volátiles con una destacada actividad tripanocida. A partir de estos materiales, se desarrollaron métodos de fraccionamiento bioguiado para identificar los compuestos responsables de la actividad biológica. Se llevó a cabo la purificación de los componentes activos a partir de las fracciones, logrando obtener compuestos líderes puros. Además, se optimizó el rendimiento en la obtención de aceites volátiles y sus componentes, considerando variables como el tiempo de secado del material vegetal y el proceso de hidrodestilación.Ítem Embargo Desarrollo de plantas con tolerancia aumentada a estrés ambiental por modulación del estado redox de cloroplastos mediante la expresión de proteínas flavín-dihierro cianobacterianas(2025) Vicino, Paula; Lodeyro, Anabella Fernanda; Carrillo, NéstorLa fotosíntesis oxigénica requiere condiciones definidas de luz y disponibilidad de nutrientes para operar de manera eficiente. Sin embargo, los organismos fotótrofos viven y se desarrollan en ambientes en los cuales la intensidad lumínica, la temperatura y el acceso al agua es fluctuante a lo largo del tiempo. Es por ello que, para poder sobrevivir, han desarrollado múltiples formas de adaptarse a estos cambios y de generar respuestas que contrarresten las indeseadas consecuencias que sobrevienen de una maquinaria fotosintética funcionando ineficientemente. Las proteínas flavín-dihierro (Flv) forman una familia de enzimas solubles ausentes en el genoma de las angiospermas. Se han estudiado las funciones de estas proteínas en β-cianobacterias del género Synechocystis, las cuales codifican en su genoma cuatro isoformas (Flv1-4) con diferentes potenciales redox, lo que sugiere que podrían interactuar con distintos componentes de la cadena fotosintética de transporte de electrones (CFTE) y participar en diversas vías de óxido-reducción. Se ha propuesto asimismo que las Flvs actuarían como heterodímeros, siendo las parejas Flv1-Flv3 y Flv2-Flv4 las formas activas. En este trabajo de Tesis se describe la introducción de las proteínas cianobacterianas Flv2 y Flv4 en plantas de Nicotiana tabacum, la caracterización fenotípica de las mismas y su evaluación frente a distintos tipos de estrés abiótico. Se investigan también los posibles mecanismos por los que estas proteínas confieren ventajas adaptativas a nivel de fotosíntesis, supervivencia y reproducción. Se caracterizó el fenotipo de las plantas que expresaban el heterodímero Flv2-Flv4 dirigido a cloroplastos en condiciones de crecimiento normal, no observándose penalidades en el crecimiento. En cuanto a los tratamientos de estrés, las plantas Flv2-Flv4 exhibieron tolerancia a estrés por alta luz, evidenciado por mejores performances fotosintéticas, menor degradación de la proteína D1, la cual es el principal blanco ante el foto-daño, y menor producción de especies reactivas del oxígeno. Las plantas transgénicas también exhibieron mayor tolerancia a estrés salino y oxidativo, dado que conservaron diferencialmente los pigmentos fotosintéticos y las membranas celulares. Además, estas plantas mostraron mejores rendimientos fotosintéticos y mayor acumulación de biomasa luego de ser expuestas a un régimen de sequía moderado. Posteriormente, para investigar los mecanismos a través de los cuales las plantas que expresaban Flv2-Flv4 presentaban esta ventaja adaptativa, se decidió estudiar a través de ensayos de fluorescencia de la clorofila el estado redox de la CFTE. Las líneas Flv2-Flv4 presentaron menores inducciones de extinción no fotoquímica (NPQ) pero mejores rendimientos fotosintéticos y el pool de plastoquinonas más oxidado. Estas plantas exhibieron complejos antena de mayor tamaño respecto a las parentales salvajes. Además, cuando fueron crecidas en invernadero bajo condiciones lumínicas elevadas y fluctuantes, las plantas transgénicas resultaron más altas sin acumular significativamente más biomasa en tallo. Todos estos resultados orientan la hipótesis de que las líneas Flv2-Flv4 estarían disipando electrones fuera de la CFTE y al mismo tiempo tendrían un arreglo estructural diferente en los complejos de captación de la luz. Finalmente, y con el objetivo de obtener información adicional acerca de los sitios de acción de Flv2-Flv4, se desarrolló una metodología para poder medir fluorescencia de la clorofila y evolución de oxígeno en protoplastos, los cuales son permeables a distintos inhibidores fotosintéticos. En esta tesis se detalla la puesta punto y aplicación de esta plataforma, y se describen ensayos de prueba de concepto, comparando el comportamiento exhibido por la fotosíntesis medida en hojas y protoplastos. Los resultados indican que esta plataforma refleja de manera precisa los procesos fotosintéticos que tienen lugar en la hoja, lo cual permite estudiar sus aspectos mecanístico-moleculares en un sistema definido como son los protoplastos y accesible desde el punto de vista experimental.Ítem Acceso Abierto Estudios de localización y herencia de genes relacionados con la apomixis en razas tetraploides de Paspalum notatum(2006) Stein, Juliana; Ortiz, Juan Pablo Amelio; Pessino, Silvina ClaudiaPaspalum notatum Fligge, es una gramínea forrajera nativa de las regiones subtropicales de Argentina, Brasil y Paraguay. Los citotipos diploides son autoincompatibles y de reproducción sexual, mientras que los poliploides (la mayoría de ellos tetraploides) son autofértiles y apomícticos apospóricos. La apomixis es una forma de reproducción asexual por semillas que conduce a la generación de progenies genéticamente idénticas a la planta madre. En la apomixis apospórica se forman sacos embrionarios a partir de células de la nucela cuyos núcleos no están reducidos (2n), y los embriones se desarrollan por partenogénesis sin que ocurra fecundación de la célula huevo. En general, este tipo de reproducción está siempre asociada a la poliploidía. En P. notatum la formación de la semilla requiere además la fusión de los núcleos polares con uno de los núcleos haploides del microgametofito para la generación del endosperma (seudogamia). Trabajos recientes determinaron que el carácter aposporía en la especie es controlado por un locus simple, dominante y con segregación distorsionada. Los objetivos de este trabajo de Tesis fueron determinar el tipo de herencia presente en las razas tetraploides de Paspalum notatum, construir de un mapa de ligamiento genético completo de la especie, localizar en dicho mapa el locus responsable de la aposporía (apo-locus) así como otros genes involucrados con la expresión del carácter apomixis y realizar estudios estructurales y de mapeo comparativo del genoma de la especie. [...]Ítem Embargo Eventos moleculares que modulan la adquisición de capacidad fecundante del espermatozoide de mamíferos(Universidad Nacional de Rosario. Facultad de Ciencias Bioquímicas y Farmacéuticas, 2025) Gentile, Iñaki; Krapf, Darío; Stival, Cintia EstefaníaEn mamíferos, los espermatozoides recién eyaculados no pueden fecundar al ovocito; deben experimentar un proceso denominado capacitación, que ocurre en el tracto reproductor femenino. Este proceso involucra modificaciones postraduccionales (MPT) de proteínas, ya que los espermatozoides son transcripcional y traduccionalmente inactivos. La capacitación puede inducirse in vitro en medios con HCO₃ ⁻ y Ca²⁺ , que activan la adenilato ciclasa soluble (sAC) y aumentan el AMPc, activando la proteína quinasa A (PKA). La PKA regula múltiples eventos asociados a la capacitación, incluidos cambios en la motilidad y la respuesta acrosómica. La subunidad catalítica de PKA (PKAc) presenta una estructura bilobular: un lóbulo N-terminal (implicado en la unión de ATP) y un lóbulo C-terminal (que contiene el sitio catalítico y de unión al sustrato). En el lóbulo N-terminal destaca el “bucle de glicinas” (G-loop), esencial para coordinar el ATP y su correcta orientación para la transferencia del grupo fosfato. En este trabajo se estudió cómo la acetilación de lisinas en PKAc modula su actividad. La acetilación de lisinas, catalizada por acetiltransferasas y revertida por deacetilasas, es una MPT con un rol regulador en diversas funciones celulares. Recientemente se ha evidenciado que proteínas espermáticas, incluidas subunidades de PKA, presentan acetilaciones que varían con la capacitación. Resultados previos mostraron que la hiperacetilación farmacológica aumenta la fosforilación de sustratos de PKA en espermatozoides de ratón, incluso en ausencia de AMPc. El objetivo principal de la tesis fue dilucidar los mecanismos por los cuales la acetilación de lisinas modula la actividad de PKAc. Para ello, se purificó PKAc recombinante (recPKAc) y se sometió a acetilación in vitro usando extractos de espermatozoides de ratón con acetiltransferasas endógenas. Se utilizaron inhibidores de deacetilasas (TSA y NAM) y Acetil-CoA como donador de grupo acetilo. La acetilación se verificó mediante Western blot y se identificaron tres lisinas acetiladas (Lys168, Lys279 y Lys309) usando espectrometría de masas. La Lys168, ubicada en el bucle catalítico, interacciona con los grupos fosfato β y γ del ATP y es clave para la unión de ATP y la catálisis. Mediante Resonancia Magnética Nuclear (RMN) de recPKAc marcada con 15N se detectaron cambios estructurales tras la acetilación, especialmente en el bucle de glicinas y en el sitio de activación. Esto sugiere que la acetilación induce modificaciones que podrían impactar en la unión de ATP y la catálisis Finalmente, se evaluó la actividad enzimática de recPKAc acetilada y no acetilada usando un ensayo electroforético (KiMSA). La acetilación aumentó significativamente la actividad catalítica de PKAc. Se descartó que este efecto se debiera a variaciones en la fosforilación de la Thr197 (pivotal para la activación en células somáticas). Mediante cinética enzimática se observó que la acetilación disminuye la Km de PKAc para ATP en un orden de magnitud, lo que indicaría mayor afinidad por ATP y, en consecuencia, mayor actividad catalítica. En conjunto, estos resultados sugieren que la acetilación de lisinas modula la actividad de PKAc al alterar su estructura y aumentar su afinidad por ATP, desempeñando un papel clave en la regulación de la capacitación espermática.Ítem Embargo Rol del eje AMPc/PKA en los eventos asociados a la capacitación de espermatozoides de mamíferos(Universidad Nacional de Rosario. Facultad de Ciencias Bioquímicas y Farmacéuticas, 2025) Novero, Analia G.; Krapf, Darío; Buffone, Mariano Gabriel; https://orcid.org/0009-0004-7481-2121La capacitación espermática es un proceso fundamental que deben atravesar los espermatozoides para adquirir capacidad fecundante. Se caracteriza por: 1) un cambio en el patrón de motilidad flagelar (hiperactivación); y 2) la adquisición de la capacidad para sufrir la reacción acrosómica (RA) al exponerse a progesterona. Al incubar espermatozoides en un medio capacitante se estimula la activación temprana de la Proteína Quinasa A (PKA), una Ser/Thr quinasa de amplio espectro involucrada en la regulación de distintos procesos celulares. El adenosín monofosfato cíclico (AMPc), generado al inicio de la capacitación por la adenilato ciclasa soluble (sAC), es el primer eslabón de esta cascada, y su principal blanco es la activación de PKA. PKA es un heterotetrámero compuesto por dos subunidades catalíticas (PKA-C) y dos subunidades regulatorias (PKA-RII), que permanecen unidas en su estado inactivo. La activación de esta enzima depende, en gran parte, de su adecuada localización en regiones subcelulares específicas. En este contexto, las proteínas de anclaje a PKA (AKAPs) actúan como andamiajes para la formación de microdominios de señalización, restringiendo la actividad de PKA a sitios determinados. A pesar de los avances en el estudio de PKA, aún no se comprende completamente qué ocurre con sus subunidades cuando el AMPc se une a las subunidades regulatorias. Existen dos modelos que podrían explicar su activación: el modelo de disociación y el modelo de no disociación. Dado que los procesos mediados por PKA son esenciales para la adquisición de la competencia fecundante, comprender cómo esta quinasa se regula en el espacio y el tiempo es crucial para dilucidar los pasos de la capacitación espermática. En primer lugar, nos propusimos desarrollar un método sencillo, robusto y confiable para medir la actividad de PKA. Por otro lado, aunque numerosos estudios han abordado el rol de esta quinasa en la capacitación, aún no se conoce con exactitud la totalidad de eventos moleculares que regula ni su localización precisa en el espermatozoide tras este proceso. Por ello, resulta fundamental determinar la ubicación de sus subunidades y su interacción con proteínas de anclaje, lo que permitirá identificar los diferentes signalosomas en los que PKA actúa y los eventos que regula, ya sea directa o indirectamente. Dentro de los cambios moleculares claves que suceden tras la capacitación se encuentra también la hiperpolarización del potencial de membrana plasmática (Em), un evento asociado a la RA. SLO3 es el canal de potasio responsable de este evento, es un canal sensible a pH y experimentos utilizando como farmacología inhibitoria H89, han vinculado a PKA con este proceso. Además, se ha observado que ratones knockout (KO) para el canal de potasio específico de espermatozoides SLO3 no hiperpolarizan su Em y son infértiles. En esta tesis, investigamos el mecanismo molecular que dispara la hiperpolarización de la membrana plasmática en los espermatozoides, ya sea antes o después de la activación de PKA. Para ello, utilizamos espermatozoides murinos wildtype (WT) y transgénicos (KO) como modelos experimentales. Aplicamos inhibidores farmacológicos específicos para sAC y PKA, así como análogos permeables de AMPc. Para determinar las concentraciones óptimas de estos compuestos, realizamos ensayos de Western Blot (WB) y actividad de PKA mediante el método “KiMSA” (versatile kinase mobility shift assay), desarrollado en nuestro laboratorio y explicado en el primer capítulo de esta tesis. Luego, de los distintos tratamientos, evaluamos el potencial de membrana mediante fluorimetría poblacional utilizando el fluoróforo DISC 3,5 para tal fin. Sorprendentemente, encontramos que la inhibición de PKA con sPKI no impide la hiperpolarización del potencial de membrana (Em). En contraste, la inhibición con H89 bloquea este proceso, pero dicho efecto es reversible mediante el análogo de AMPC, 8Br-AMPc, lo que confirma la inespecificidad de H89, cuyo mecanismo de acción es la competencia con ATP. Estos resultados nos permitieron descartar que la actividad catalítica de PKA sea un requisito para la hiperpolarización. Sin embargo, nuestros hallazgos sugieren que el AMPc está directamente involucrado en la activación de SLO3, ya que análogos permeables de este nucleótido promueven la hiperpolarización, mientras que inhibidores de su producción, como TDI10220, bloquean este efecto. En conjunto, estos resultados respaldan la hipótesis de que el AMPc regula el potencial de membrana a través de un blanco distinto a la PKA. Exploramos distintos análogos de AMPc para identificar el target responsable de la hiperpolarización. Se encontró que el intercambiador Na+/H+(sNHE), especifico de espermatozoides, cuya función principal es alcalinizar el interior celular y que, además, posee un sitio de unión a AMPc es un eslabón crucial en este proceso. Ratones KO para sNHE no logran hiperpolarizar, y esta deficiencia no se revierte con análogos de AMPc como 8Br AMPc o db-AMPc, pero sí con alcalinización farmacológica, lo que sugiere que SLO3 se activa mediante la alcalinización inducida por sNHE. Además, descubrimos que la acción de sNHE no es independiente, ya que otro intercambiador, NHE1, también participa en este proceso. Este segundo intercambiador, cuya función se desconoce bastante, podría ser activado por calcio ya que posee un sitio de unión a calcio/calmodulina. Analizamos el papel del calcio en la hiperpolarización y observamos que los espermatozoides de ratones KO para CatSper I no logran hiperpolarizar su membrana, pero recuperan el fenotipo tras la inducción de alcalinización farmacológica. Estos hallazgos demuestran un rol dual de ambos intercambiadore, activados por AMPc o por calcio, necesarios para el umbral de alcalinización requerida para la activación de SLO3. Aunque descartamos el rol catalítico de PKA en la hiperpolarización, estudios publicados anteriormente, resaltan la importancia de su localización subcelular específica para que ocurran eventos asociados a la capacitación. En consecuencia, nuestro siguiente objetivo fue detallar la localización de las subunidades catalíticas y regulatorias de PKA durante la capacitación espermática y su asociación con AKAPs, con énfasis en AKAP4, el AKAP predominante en espermatozoides. Mediante microscopía confocal con detector Airyscan y superresolución (DNAPAINT), analizamos la ubicación de PKA-RII, PKA-C y AKAP4 en espermatozoides capacitados y no capacitados. Encontramos que las subunidades regulatorias y catalíticas se separan drásticamente durante la capacitación: PKA-C se localiza en el centro del flagelo, mientras que PKA-RII migra hacia la periferia, donde se encuentra AKAP4. No se detectó asociación entre PKA y AKAP4 en espermatozoides no capacitados, lo que sugiere la posible existencia de otros AKAPs o proteínas de anclaje en el estado inactivo de PKA. Además, PKA-RII se redistribuyó en la vaina fibrosa (FS) en una conformación de cuatro columnas, coincidente con la ubicación del canal CatSper. En espermatozoides KO para CatSper, esta estructura se perdió, lo que sugiere que CatSper es crucial para la relocalización de PKA-RII y que esta subunidad podría desempeñar un papel en la señalización dentro de esta región clave para la capacitación espermática. En base a los resultados obtenidos, concluimos que: 1) El AMPc es esencial para la activación del canal de potasio SLO3, pero su acción no está mediada por la actividad catalítica de PKA. 2) La hiperpolarización de la membrana espermática requiere la acción coordinada de dos intercambiadores de Na⁺/H⁺, sNHE y NHE1. 3) La localización subcelular de las subunidades de PKA cambia drásticamente durante la capacitación espermática. 4) La presencia del canal CatSper es fundamental para la correcta relocalización de PKA-RII.Ítem Embargo Rol de la presentación cruzada de antígenos en la generación de la respuesta inmunitaria contra el parásito Trypanosoma cruzi(Universidad Nacional de Rosario. Facultad de Ciencias Bioquímicas y Farmacéuticas, 2025) Biscari, Lucía; Alloatti, Andrés; Pérez, Ana R.La enfermedad de Chagas, causada por el protozoo intracelular Trypanosoma cruzi, constituye un importante problema de salud pública en América Latina y, debido a los movimientos migratorios, también en regiones no endémicas. A más de un siglo de su descubrimiento, no existe una vacuna aprobada para su prevención o tratamiento, y las terapias actuales presentan limitaciones en eficacia y toxicidad, especialmente en la fase crónica. La activación de linfocitos T CD8⁺ es clave para el control del parásito, por lo que comprender los mecanismos que inducen esta respuesta, en particular la presentación cruzada de antígenos por moléculas del complejo principal de histocompatibilidad clase I, reviste importancia tanto básica como aplicada. El objetivo general de esta tesis fue profundizar en los mecanismos que subyacen a la activación de linfocitos T CD8⁺ específicos frente a T. cruzi, con énfasis en la presentación cruzada por células dendríticas, y evaluar plataformas vacunales experimentales capaces de inducir respuestas inmunitarias protectoras mediadas por estos linfocitos. En el Capítulo 1 se analizó la relevancia funcional de la presentación cruzada dependiente de Sec22b en la respuesta frente a T. cruzi. Empleando un modelo murino con deleción específica de Sec22b en células dendríticas, se observó una menor activación de linfocitos T CD8⁺, asociada a mayor parasitemia y susceptibilidad a la infección. Además, se evidenció el reclutamiento de proteínas clave de la maquinaria de presentación cruzada (LAMP-1, calreticulina y tapasina) a la vacuola parasitófora, lo que apoya su posible participación en esta vía. El Capítulo 2 exploró una estrategia profiláctica basada en la transferencia adoptiva de células dendríticas derivadas de médula ósea activadas con LPS y cargadas ex vivo con el epítope inmunodominante TsKb20, derivado de transialidasas de T. cruzi. Esta inmunización generó una respuesta robusta de linfocitos T CD8⁺ específicos, productores de IFN-γ y con desarrollo de memoria efectora. Aunque la protección fue parcial y restringida a hembras, el modelo demostró ser útil para evaluar epítopes candidatos. En el Capítulo 3, se diseñó una estrategia vacunal con mayor potencial traslacional, basada en el direccionamiento antigénico in vivo mediante conjugados péptido-anticuerpo específicos para Clec9A, receptor expresado en células dendríticas convencionales de tipo 1, subpoblación clave para el inicio de respuestas inmunitarias frente a patógenos intracelulares. Esta formulación, combinada con el adyuvante Poly I:C, generó una población de linfocitos T CD8+ específicos con fenotipo efector, evidenciado por el aumento en la expresión de marcadores de activación y la producción de citoquinas tipo Th1, así como memoria efectora, y mostró una tendencia a la protección parcial frente a la infección aguda. En conjunto, los resultados destacan el rol de la presentación cruzada en la activación de linfocitos T CD8⁺ frente a T. cruzi y apoyan el desarrollo de vacunas racionales basadas en epítopes seleccionados mediante enfoques in silico o inmunopeptidómicos, con potencial aplicación terapéutica y/o preventiva frente a la enfermedad de Chagas.Ítem Embargo Reguladores transcripcionales tipo MlrA de Salmonella implicados en la formación de biopelículas y en virulencia(Universidad Nacional de Rosario. Facultad de Ciencias Bioquímicas y Farmacéuticas, 2025) Tulin, Gonzalo; Soncini, Fernando C.Salmonella Typhimurium es un patógeno relevante para la salud pública debido a su capacidad de causar infecciones intestinales y sistémicas, así como a su habilidad para persistir en el ambiente mediante la formación de biopelículas (Hall-Stoodley et al., 2004; Scherer & Miller, 2001; Waldner et al., 2012) . Estas estructuras multicelulares están compuestas principalmente de curli y celulosa, componentes clave de la matriz extracelular cuya síntesis está regulada por CsgD, un activador transcripcional maestro (Gerstel & Römling, 2003; Römling et al., 2000). Aunque el principal regulador de CsgD es MlrA (P. K. Brown et al., 2001), en este trabajo se investigó a STM1266, un miembro de la familia MerR específico de Salmonella (McClelland et al., 2001), para dilucidar su rol en la formación de biopelículas y la respuesta adaptativa a diferentes condiciones ambientales. En el primer capítulo, se caracterizó estructural y funcionalmente a STM1266, demostrando que este regulador es inducido en condiciones de bajas temperaturas y limitación de nutrientes. Mediante análisis estructurales, se identificaron similitudes con MlrA en su dominio N-terminal, mientras que la región C-terminal presenta divergencias que podrían explicar su especialización funcional. Ensayos fenotípicos revelaron que STM1266 modula la formación de biopelículas promoviendo la producción de curli y celulosa en condiciones óptimas, favoreciendo además la transición hacia un estilo de vida sésil mediante la supresión de la motilidad tipo swimming. Adicionalmente, los resultados destacaron la dependencia parcial de STM1266 de MlrA y CsgD, aunque también se observaron efectos independientes, lo que sugiere la existencia de rutas reguladoras alternativas. En paralelo se logró la expresión y purificación de la región Cterminal de STM1266 para la generación de anticuerpos específicos, los cuales permitieron evaluar su expresión y función en distintas condiciones. En el segundo capítulo, se exploraron los genes regulados por STM1266 mediante mutagénesis al azar y análisis transcriptómicos. Utilizando una mutagénesis con el transposón MudJ observamos que STM1266 regula la expresión de bapA (Latasa et al., 2005b), y lo hace de manera independiente de CsgD, lo que resalta su versatilidad como regulador. Mediante RNA-Seq se identificaron 151 genes activados y 46 reprimidos, incluyendo aquellos relacionados con la producción de matriz extracelular (csgA, csgB), metabolismo de purinas y pirimidinas, y respuesta al estrés. Además, se identificó que STM1266 puede modular la producción de curli tanto de forma dependiente como independiente de CsgD, expandiendo su impacto en la formación de biopelículas bajo diferentes condiciones ambientales. Estos resultados posicionan a STM1266 como un regulador clave en la reprogramación del estilo de vida de Salmonella Typhimurium, integrando señales ambientales para conectar la formación de biopelículas con procesos adaptativos y metabólicos esenciales, proporcionando nuevos conocimientos sobre la regulación transcripcional en Salmonella, destacando el papel de STM1266 en la adhesión bacteriana, la adaptación metabólica y la persistencia en entornos desafiantes, sentando las bases para futuras investigaciones y estrategias de control antimicrobiano.Ítem Embargo Impacto de la síntesis de ácidos grasos insaturados y de la movilización de colesterol en la biología de Caenorhabditis elegans(Universidad Nacional de Rosario. Facultad de Ciencias Bioquímicas y Farmacéuticas, 2025) Battista, Bernabé; De Mendoza, Diego; Binolfi, AndrésEl interés en el metabolismo lipídico ha aumentado significativamente en los últimos años, especialmente desde que desregulaciones en el mismo se han asociado con patologías como obesidad, ateroesclerosis, diabetes, enfermedades neurodegenerativas y cardiovasculares. Según la Organización Mundial de la Salud, estás ultimas son la principal causa de muerte en el mundo, siendo uno de sus factores de riesgo principales la alimentación poco saludable. Por este motivo, comprender el papel activo que desempeñan los lípidos en la fisiología celular y su influencia en la regulación de la homeostasis energética se ha vuelto particularmente relevante. Un modelo animal atractivo para estudiar metabolismo lipídico es el gusano redondo Caenorhabditis elegans. Mejor conocido por su utilidad para análisis genéticos, este organismo modelo es de fácil mantenimiento en el laboratorio, su genoma está completamente secuenciado y tiene un ciclo de vida corto que, entre otras características, lo convierten en un organismo ideal para comprender procesos biológicos como aquellos relacionados con la salud humana. Si bien los nemátodos son capaces de sintetizar diferentes tipos de lípidos, muchos de ellos aún son desconocidos. Hasta la fecha, la investigación en el campo de los lípidos en C. elegans se ha enfocado principalmente en la caracterización de los genes involucrados en la biosíntesis, almacenamiento y degradación, así como aquellos que cumplen funciones regulatorias. Además, se han estudiado las consecuencias neurológicas que surgen cuando algunos de estos compuestos no se sintetizan correctamente. Por este motivo, en este trabajo nos propusimos entender el rol que desempeñan los ácidos grasos y el colesterol sobre la biología de C. elegans. Los ácidos grasos insaturados (UFAs) pueden ser monoinsaturados (MUFAs) conteniendo un doble enlace C-C, o poliinsaturados (PUFAs) conteniendo dos o más dobles enlaces C-C. El nemátodo C. elegans se diferencia de la mayoría de los animales por tener la capacidad de producir una gran variedad de UFAs empleando acetil-CoA como precursor. La biosíntesis de UFAs depende de la conversión de ácidos grasos saturados a insaturados mediada por la actividad de las enzimas desaturasas ∆9. Los nemátodos cuentan con 3 genes que codifican para estas enzimas, fat-5 (palmitoil-CoA ∆9 desaturasa), fat-6 y fat-7 (estearoil-CoA ∆9 desaturasas). La vía de síntesis de UFAs en C. elegans comienza con el ácido palmítico (16:0), obtenido de la dieta de E. coli o sintetizado de novo, el cual es convertido en ácido palmitoleico (16:1 ∆9) por FAT-5. El ácido palmítico (16:0) también puede ser elongado a ácido esteárico (SA, 18:0), el sustrato para la desaturación por FAT-6 y FAT-7 hacia ácido oleico (OA, 18:1 ∆9), siendo este último el precursor de todos los PUFAs que produce C. elegans. Debido a que la actividad desaturasa ∆9 es esencial, un nemátodo mutante fat-6-(-); fat-5-(-);fat-7-(-) es inviable, por lo que en nuestro laboratorio desarrollamos una mutante condicional que puede ser depletada de UFAs en el estadio larval deseado. Para la construcción de esta mutante empleamos el sistema degron inducible por auxina (AID), originario de Arabidopsis thaliana, que recientemente fue adaptado para su uso en C. elegans. Para esto, sobre un trasfondo genético fat-6-(-);fat-5-(-) editamos el gen fat-7, mediante CRISPR-Cas9, adicionándole una secuencia de reconocimiento para su degradación en el proteasoma que es inducible por auxina. De esta manera, suplementando el medio de crecimiento con esta hormona vegetal podemos interrumpir la síntesis de UFAs en el soma de esta cepa, que llamamos DDM6. Para poder entender las consecuencias fisiológicas de la falta de UFAs realizamos una caracterización funcional de DDM6. Descubrimos que la depleción de estos lípidos produce arresto larval en los estadios L1 y L2, pero no en L3 o L4 que logran alcanzar la adultez, sugiriendo un rol esencial de la síntesis de OA para la transición a la adultez desde los primeros estadios larvales. Mediante GC-MS y RMN de extractos de lípidos demostramos que la reducción observada en los UFAs que exhiben los gusanos tratados con auxina se debe a una disminución acentuada de los PUFAs más que de los MUFAs. Además, esta depleción de FAT-7 interfiere con los depósitos de grasas al disminuir el tamaño y la cantidad de triacilgliceroles almacenados en las gotas lipídicas, lo cual evidenciamos mediante microscopía de fluorescencia y RMN de gusanos vivos enriquecidos isotópicamente con 13C. Finalmente, mostramos que la exposición a auxina de los gusanos DDM6 induce esterilidad de manera reversible, lo cual se demuestra por la marcada reducción en la progenie producida autónomamente por los gusanos hermafroditas. Con el fin de entender las causas biológicas responsables de la reducción en la fertilidad observada en gusanos DDM6 expuestos a auxina, realizamos una serie de ensayos bioquímicos que nos facilitaron evaluar ciertos marcadores de desarrollo germinal. Encontramos que la deficiencia de UFAs induce alteraciones mitóticas y meióticas en la línea germinal. Por otro lado, mediante ensayos de inmunohistoquímica descubrimos que un contexto de baja desaturación ∆9 conduce a la formación de estructuras de membrana aberrantes y altera la correcta formación del complejo de poro nuclear en la línea germinal. Sin embargo, no encontramos evidencia de que la falta de UFAs induzca apoptosis o alterare la correcta segregación de los cromosomas homólogos en la línea germinal. Por último, en este proyecto de tesis nos propusimos entender como el transporte de colesterol influye sobre la fisiología de C. elegans. El colesterol, además de ser un componente estructural de las membranas celulares, es el precursor de hormonas esteroideas y ácidos biliares, volviéndolo esencial para el desarrollo y la salud. Debido a que tanto el exceso como la falta de colesterol son perjudiciales para la salud, gran cantidad de procesos regulatorios han evolucionado para controlar vías metabólicas de involucran esteroles. A diferencia de lo que ocurre con mamíferos, C. elegans es auxótrofo para colesterol por lo que requiere un suplemento dietario constante para sobrevivir. En los nemátodos este esterol es requerido para el crecimiento y la progresión por los diferentes estadios larvales. Además, el colesterol regula el ingreso a un estadio de diapausa especializado que permite la supervivencia bajo condiciones desfavorables llamado larva dauer. Los esteroles que regulan la formación de la larva dauer son moléculas similares a los ácidos biliares denominados ácidos dafacrónicos (ADs). Estos inhiben el estado dauer al unirse a un receptor hormonal nuclear llamado DAF-12, que en ausencia de ADs activa el programa dauer. Tras la ingesta de colesterol, la distribución vesicular de este lípido en C. elegans es mediada por varios sistemas de transporte, incluyendo las vitelogeninas. Después de la endocitosis mediada por receptores de los transportadores de colesterol, este es transportado a través del sistema endolisosomal y dirigido a otros compartimentos celulares con la ayuda de los homólogos del transportador tipo Niemann-Pick C1 (NPC1), NCR-1;NCR-2. A pesar del conocimiento actual sobre estos circuitos, varios aspectos de las vías involucradas en el transporte y la distribución del colesterol en C. elegans aún no se han elucidado. Durante la última década, estudios en líneas celulares o fibroblastos, han mostrado que transportadores como las proteínas esteroidogénicas reguladoras agudas (StAR) y los dominios de transferencia de lípidos relacionados con StAR (START) en los sitios de contacto de membrana proporcionan una vía importante para la transferencia de colesterol del sistema endosomal-lisosomal a otras organelas celulares. Para mejorar nuestra comprensión del transporte de esteroles en C. elegans, realizamos investigaciones estructurales y funcionales de TAG-340, un ortólogo de la proteína humana STARD3, que une esteroles y genera sitios de contacto entre los endosomas/lisosomas y el retículo endoplásmico o mitocondrias. Utilizamos técnicas de dicroísmo circular y resonancia magnética nuclear para examinar la unión del colesterol, y también determinamos la estructura del dominio START de TAG-340/STARD3 mediante cristalografía de rayos X. Elucidamos las estructuras cristalinas del dominio STAR solo y en complejo con colesterol, lo que proporcionó información valiosa sobre el mecanismo de unión del lípido. También descubrimos que el silenciamiento por ARNi de TAG-340 intensifica el arresto dauer en el desarrollo de los dobles mutantes ncr-2-(-);ncr-1-(-), lo que indica que TAG-340/STARD3 está involucrada en la regulación del transporte intracelular de colesterol en C. elegans. En general, nuestros resultados demuestran la primera estructura cristalina de un dominio START en complejo con colesterol y proporcionan evidencia de que TAG-340/STARD3 funciona como una proteína de transferencia de lípidos y participa en el flujo vesicular de colesterol en C. elegans.Ítem Embargo Síntesis, modulación y conjugación de sistemas heterocíclicos dirigidos a la obtención de compuestos con diversos puntos de interacción biológica(Universidad Nacional de Rosario. Facultad de Ciencias Bioquímicas y Farmacéuticas, 2025) Permingeat Squizatto, Caterina; Delpiccolo, Carina M. L.; La Venia, AgustinaLos carbenos metálicos, obtenidos tradicionalmente a partir de la descomposición catalizada por metales de compuestos diazo, han demostrado ser herramientas fundamentales en la síntesis orgánica. Sin embargo, las limitaciones asociadas a los diazocompuestos, como su alta reactividad, inestabilidad y riesgos operativos, han impulsado la búsqueda de alternativas más seguras y versátiles. En este contexto, los N-sulfonil-1,2,3-triazoles han emergido como precursores eficaces de carbenos metálicos, gracias a su facilidad de síntesis mediante cicloadición azida-alquino catalizada por cobre(I). En nuestro estudio, sintetizamos un tosiltriazol modelo utilizando distintas metodologías. Los resultados demostraron que el catalizador CuTC ofrece altos niveles de conversión y selectividad, superando ampliamente a otros complejos de cobre(I). Con el tosiltriazol como modelo, exploramos su reactividad frente a alquenos utilizando octanoato de rodio(II) (Rh2(Oct)4) como catalizador, con el objetivo de generar selectivamente 2,3-dihidropirroles. Este tipo de heterociclos es de gran interés debido a su ubicuidad en productos bioactivos y su relevancia farmacéutica. Durante la optimización de las condiciones de reacción, identificamos factores críticos como la temperatura, el solvente y la concentración. Logramos obtener 2,3-dihidropirroles con rendimientos de moderados a muy buenos bajo condiciones optimizadas, minimizando subproductos resultantes de la hidrólisis del carbeno. Además, evaluamos la influencia de diferentes alquenos, observando que los estirenos con grupos donadores de electrones en posición para u orto presentaban mejores rendimientos en la formación de los productos deseados. Asimismo, desarrollamos metodologías complementarias para la obtención selectiva de ciclopropiliminas. Estas moléculas mostraron configuración trans, confirmada mediante RMN NOESY 1-D y cálculos computacionales (DFT). Posteriormente, se llevó a cabo su transformación en aldehídos y aminas con potencial aplicación en química medicinal y de síntesis. Estas estructuras intermedias también abren la posibilidad de explorar nuevas rutas sintéticas para la generación de bibliotecas moleculares diversificadas. Además, investigamos la síntesis de 2,3-dihidropirroles enantioméricamente enriquecidos, relevantes en farmacología y ciencia de materiales. Se exploraron dos enfoques: el uso de catalizadores quirales de dirodio(II) y el empleo de un sustrato quiral derivado de la oxazolidinona de Evans. Los resultados obtenidos evidenciaron el potencial de ambas estrategias para inducir quiralidad en la estructura del 2,3-dihidropirrol, aunque también revelaron ciertas limitaciones en el control estereoquímico bajo las condiciones estudiadas. Se reconoce que factores como el tamaño y la naturaleza del precursor de carbeno, así como la estructura del catalizador o del sustrato, influyen de forma decisiva en la eficiencia y selectividad del proceso. A lo largo del proyecto y ya contando con más experiencia en este tipo de química, implementamos estrategias one-pot que integraron múltiples etapas de reacción, mejorando los rendimientos globales y simplificando los procesos experimentales al evitar el aislamiento de intermedios. Además, realizamos reacciones libres de solventes, las cuales demostraron ser igualmente eficientes y permitieron un escalado exitoso sin pérdida de rendimiento. Luego, estudiamos la reacción de los carbenos de Rh(II) con nucleófilos alternativos. Hemos sido capaces de utilizar nuestras condiciones óptimas de reacción para la síntesis de estructuras diversas, como oxazolinas, pirroles y tiazoles. Particularmente, profundizamos el estudio de la reacción con amidas secundarias, generando estructuras indólicas altamente funcionalizadas. Este hallazgo representa un avance significativo, ya que los compuestos indólicos son esenciales en la química de productos naturales y el diseño de fármacos. También se identificó la influencia crítica del solvente en la selectividad de estas reacciones, lo que aporta información valiosa para futuros estudios. Por otro lado, evaluamos la aplicabilidad de las metodologías desarrolladas mediante la funcionalización de los productos obtenidos con moléculas bioactivas conocidas, utilizando la técnica de hibridación molecular. En este contexto, combinamos 2,3-dihidropirroles y ciclopropiliminas con productos naturales bioactivos como el L-mentol y la deshidroepiandrosterona (DHEA), obteniendo híbridos funcionalizados con rendimientos de moderados a buenos en forma de mezcla diastereoisomérica. Además, se estudió la actividad antiproliferativa de una selección representativa de los compuestos sintetizados, mediante ensayos in vitro frente a la línea celular tumoral B16-F0 (melanoma murino) y la línea no tumoral NMuMG (epitelio mamario murino), lo que permitió evaluar tanto la potencia como la selectividad de los compuestos. Algunos derivados demostraron una inhibición significativa del crecimiento celular en la línea tumoral, con baja citotoxicidad sobre células normales. Estos resultados preliminares destacan el potencial bioactivo de las estructuras obtenidas y subrayan la importancia de continuar explorando la relación estructuraactividad para optimizar el diseño de nuevas entidades con aplicaciones terapéuticas. Por último, diseñamos una ruta sintética para la obtención del tosiltriazol en fase sólida, marcando un avance hacia el desarrollo de precursores de carbenos sobre soporte polimérico. Aunque se logró sintetizar el tosiltriazol, la limitación actual radica en la comprobación directa de su formación utilizando técnicas espectroscópicas avanzadas, lo cual representa un objetivo prioritario para estudios futuros. En conclusión, este trabajo no solo expande el conocimiento sobre la química de carbenos de rodio derivados de sulfoniltriazoles, sino que también proporciona herramientas y estrategias innovadoras para la síntesis de compuestos de alto valor agregado con potencial impacto en la química medicinal y el desarrollo de nuevos fármacos.Ítem Embargo Hepatitis E, un virus emergente: desarrollo de herramientas diagnósticas, análisis del escenario epidemiológico en la zona núcleo maicera de Argentina y su impacto en pacientes inmunosuprimidos(Universidad Nacional de Rosario. Facultad de Ciencias Bioquímicas y Farmacéuticas, 2025) Acosta, Julián; Cavatorta, Ana Laura; Marziali, Federico EmanuelEl Virus de la Hepatitis E (HEV), de transmisión entérica, es uno de los principales agentes causantes de hepatitis aguda en todo el mundo, con cuatro genotipos principales (HEV-1 a 4) que afectan a los humanos. Es considerada una zoonosis emergente, que se disemina principalmente a través de los alimentos en los países en desarrollo y/o con pobres condiciones sanitarias. La Organización Mundial de la Salud (OMS) estima que anualmente se registran más de 20 millones de infecciones y 40.000 fallecimientos, lo que la posiciona como una de las principales causas de mortalidad por hepatitis aguda de origen viral en el mundo, constituyendo un desafío significativo para la Salud Pública. En este contexto, la complejidad del problema demanda una gestión integrada que contemple la salud humana, animal y ambiental, bajo el concepto de Una Salud. El desconocimiento de la verdadera magnitud de la infección y la ausencia de herramientas diagnósticas confiables representan un problema concreto para grupos de riesgo como los pacientes inmunosuprimidos o con hepatopatías crónicas. Con un mejor conocimiento del peso de la infección y las vías de transmisión en nuestra población, y disponiendo de metodologías diagnósticas eficaces, dicho riesgo podría reducirse. Por lo tanto, el objetivo general de esta tesis consistió en optimizar técnicas sensibles y específicas que aporten a mejorar el diagnóstico y monitoreo del virus en poblaciones humanas, animales y en el medioambiente, promoviendo el desarrollo y aplicación de tecnología regional. En primer lugar, optimizamos una reacción en cadena de la polimerasa con transcripción inversa en tiempo real (RT-qPCR) con control interno, para aumentar la performance de las metodologías utilizadas actualmente en nuestro medio. Los resultados obtenidos subrayan la relevancia de haber logrado desarrollar una metodología superadora a la utilizada en la mayoría de los laboratorios bioquímicos y reportes académicos de Argentina, a la cual denominamos HEV/MS2 dúplex RT-qPCR, aportando ventajas en relación al diagnóstico de la infección. Posteriormente, al disponer de esta herramienta demostramos la circulación del HEV en cerdos de establecimientos comerciales localizados en distintos lugares de la zona núcleo maicera de nuestro país, lo que resulta clave considerando que estos animales representan uno de los principales reservorios del virus y el crecimiento de la producción porcina en nuestra región. Por otro lado, considerando la relevancia clínica de la infección por HEV, realizamos un estudio en individuos inmunocomprometidos por diversas etiologías. Asimismo, efectuamos el seguimiento de una cohorte de pacientes con enfermedad hepática crónica durante dos años. Los resultados obtenidos confirmaron el mayor impacto de la infección en estos grupos vulnerables, en comparación con las poblaciones control y general. Al mismo tiempo, resaltaron la importancia de considerar el contexto epidemiológico como un factor clave en la infección por HEV en nuestra región. Otro aspecto para destacar de este trabajo de tesis es que, por primera vez en Argentina, logramos demostrar un vínculo epidemiológico en un productor porcino que desarrolló hepatitis aguda debido a una infección por HEV. Este hallazgo confirma la transmisión zoonótica viral y respalda la asociación entre exposiciones ocupacionales y el mayor riesgo de contraer hepatitis E. Finalmente, y una vez demostrada la circulación de HEV en la región, tanto en animales como en humanos, decidimos profundizar el estudio de esta zoonosis bajo el enfoque de Una Salud. Por ello, planteamos como último objetivo sentar las bases para evaluar el escenario epidemiológico del HEV en el medioambiente, específicamente en matrices acuosas, con la hipótesis de que el agua puede actuar como una fuente de diseminación viral. En este sentido, desarrollamos una técnica de concentración de partículas virales con la incorporación de un control interno, la cual fue validada en aguas de distintos orígenes, obteniendo resultados reproducibles y dentro del rango de sensibilidad del ensayo. En conclusión, esta metodología representa una alternativa sensible, reproducible y de bajo requerimiento instrumental para la detección del HEV en el ambiente. En función de lo expuesto, este trabajo de tesis resalta la importancia de haber conformado un equipo multidisciplinario integrado por profesionales de las áreas de salud humana, animal y ambiental. Este enfoque colaborativo permitió la generación de nuevos conocimientos, aportando de manera significativa a la comprensión del escenario epidemiológico del HEV en nuestra región.Ítem Embargo Estudio de las propiedades fisicoquímicas, estructurales y funcionales de sistemas compuestos por proteínas de quinua y sus hidrolizados, alginato y ácidos grasos monoinsaturados para el diseño de alimentos funcionales(Universidad Nacional de Rosario. Facultad de Ciencias Bioquímicas y Farmacéuticas, 2025) Lingiardi, Nadia; Spelzini, Darío; Galante, MicaelaEl objetivo del presente trabajo fue desarrollar y caracterizar emulsiones gelificadas a partir de concentrados de proteína de quinua (CPQ) y sus hidrolizados (HPQ), alginato de sodio y ácidos grasos monoinsaturados. Se obtuvieron CPQ por el método de precipitación isoeléctrica. Se formularon emulsiones gelificadas (EG) con 0,5; 1 y 2% p/v de CPQ, 0,5% p/v de alginato de sodio y 10, 30 y 50% v/v de fracción de volumen de aceite de girasol alto oleico. La gelificación se realizó mediante el empleo de membranas de diálisis con CaCl2 (5% p/v) como agente gelificante. Se estudió el efecto de la concentración de CPQ y de la fracción de volumen de aceite sobre las propiedades fisicoquímicas y mecánicas de las EG formuladas. Se evaluó, además, la microestructura, color y capacidad de retención de agua, así como la estabilidad térmica y física de estos sistemas. Por otro lado, el CPQ fue hidrolizado con alcalasa. Los HPQ resultantes fueron evaluados por sus propiedades funcionales y biológicas. Se determinó la hidrofobicidad superficial, la capacidad emulsionante, la actividad quelante de hierro y su poder reductor, así como la actividad antibacteriana. Finalmente se formularon y caracterizaron emulsiones gelificadas a base de HPQ (0,5; 1 y 2% p/v), 1% p/v de alginato de sodio y 30% v/v de fracción de volumen de aceite de girasol alto oleico (EGH). Se evaluaron sus propiedades fisicoquímicas, mecánicas, reológicas y antioxidantes mediante los métodos de ABTS y DPPH. El análisis mostró que la concentración de CPQ y la fracción de volumen de aceite impactaron sobre las propiedades de las EG. Un aumento en la concentración de CPQ redujo el tamaño de las gotas de aceite, mientras que la dureza del gel aumentó con mayores concentraciones de proteína y aceite. El tratamiento térmico disminuyó la capacidad de retención de agua de las EG, a bajas fracciones de volumen de aceite. Además, las EG mostraron estabilidad frente al cremado. Por otro lado, la hidrólisis de los CPQ con alcalasa mejoró la hidrofobicidad superficial y las propiedades emulsionantes de las proteínas de quinua; los HPQ (grado de hidrólisis 30±4%) mostraron mayores índices de actividad emulsionante y de estabilidad de la emulsión en comparación con la proteína sin hidrolizar. Asimismo, este estudio demostró que los HPQ tienen potencial para ser utilizados en la formulación de EGH. Aunque la hidrólisis produjo una reducción significativa en la capacidad de retención de agua de los sistemas, en todas las muestras evaluadas este parámetro fue de alrededor del 70%. Los parámetros de textura también indicaron que las EGH resultaron autosustentables y podrían aplicarse en la formulación de alimentos semisólidos. Las proteínas de quinua afectaron las propiedades texturales de las EGH; la hidrólisis proteica disminuyó la dureza de los sistemas sin afectar su capacidad de recuperación y adhesividad. Las EGH demostraron actividad antioxidante significativa, lo que las posiciona como ingredientes funcionales para fortificación de alimentos y protección contra la oxidación. Tanto las EG como las EGH mostraron un comportamiento reológico típico de sólido viscoelástico en un amplio rango de frecuencias y temperaturas ensayado, lo que las hace adecuadas para aplicaciones industriales en alimentos semisólidos de origen vegetal En conclusión, este trabajo revela el gran potencial de las proteínas de quinua y sus hidrolizados para la formulación de emulsiones gelificadas, destacando sus propiedades funcionales y biológicas prometedoras para el desarrollo de productos alimentarios innovadores y saludables. La combinación de proteínas de quinua, alginato y aceite de girasol alto oleico resulta en sistemas altamente estables que podrían ser aplicados en productos alimentarios que requieran atributos texturales y reológicos específicos. Además, exhiben propiedades antioxidantes y emulsionantes mejoradas, especialmente cuando se emplean proteínas hidrolizadas, lo que las hace atractivas para la formulación de productos semisólidos de origen vegetal con valor agregado.Ítem Embargo Síntesis, caracterización y evaluación de la actividad de catalizadores biomiméticos de peroxidasas con potencial aplicación en la despolimerización oxidativa de lignina(Universidad Nacional de Rosario. Facultad de Ciencias Bioquímicas y Farmacéuticas, 2025) Ferreyra, Joaquín; Signorella, Sandra R.La lignina es el biopolímero más abundante en la naturaleza después de la celulosa. Por su estructura química, constituye la principal fuente renovable de unidades aromáticas presente en la naturaleza, lo que la posiciona como una alternativa sustentable para la producción de compuestos químicos y combustibles actualmente derivados de recursos fósiles. Sin embargo, su valorización industrial sigue siendo un desafío, y en la mayoría de los procesos continúa siendo tratada como subproducto de bajo valor principalmente destinado a la generación de energía. La existencia de metaloenzimas ligninolíticas en la naturaleza ha motivado el desarrollo de sistemas catalíticos basados en complejos de coordinación. Frente a la escasez de estudios sistemáticos que exploren en profundidad los factores electrónicos y estructurales responsables de la actividad catalítica observada en estos sistemas, en esta Tesis Doctoral se propuso reproducir la función catalítica de las peroxidasas –uno de los principales grupos de enzimas ligninolíticas– mediante complejos metálicos biomiméticos, tanto en fase homogénea como inmovilizados sobre un soporte mesoporoso, y evaluarlos como catalizadores en la oxidación por H2O2 de diferentes modelos estructurales de lignina. Se sintetizaron y caracterizaron una serie de complejos de Cu, Mn y Co con sitios donores de tipo N2O2 y N4, cuyas estructuras se muestran en la Figura 1. Se evaluó la actividad catalítica de los complejos en la oxidación por H2O2 de los siguientes modelos de unidades estructurales de lignina: fenol, 2-metoxifenol, 2,6-dimetoxifenol y alcohol veratrílico. Dentro de la serie de compuestos de coordinación estudiados, los complejos de Cu(II) formados por ligandos nitrogenados son los más eficientes para catalizar la oxidación tanto de los fenoles como del alcohol bencílico. La evidencia reunida a lo largo de esta Tesis permitió establecer que tanto el potencial redox de la cupla Cu(II)/Cu(I) como la geometría molecular en solución constituyen factores importantes para explicar las diferencias observadas en la actividad catalítica de estos complejos. Entre ellos, este último resulta especialmente relevante en la oxidación de modelos con sustituyentes –OCH3 en las posiciones orto al grupo hidroxilo. Para los catalizadores más activos, se realizaron estudios cinéticos que permitieron proponer mecanismos de reacción para la oxidación de los modelos fenólicos. Estos mecanismos parten de la formación inicial de un intermediario de tipo hidroperoxo-Cu(II), que actúa como especie oxidante. Un proceso competitivo no menor es la actividad catalasa que presentan varios de estos complejos en paralelo. En el caso del complejo [Cu(Py2pn (ClO4)2], se observó que este proceso también se inicia con la formación del mismo intermediario hidroperoxoCu(II), aunque la reacción progresa mediante la interacción con una segunda molécula de complejo, lo que conduce a la formación de un dímero trans-µ-1,2-peroxodiCu(II) en la etapa determinante de la velocidad. Por otra parte, los estudios preliminares realizados en medio básico con los catalizadores inmovilizados mostraron que la encapsulación de [Cu(Py2pn)(ClO4)2] y [Cu(phen)2](ClO4)2 en la sílica mesoporosa SBA-15 resulta en un incremento de su eficiencia catalítica en la oxidación de fenol por H2O2. Asimismo, se evaluó el uso del complejo [Cu(phen)2](ClO4)2 en el blanqueo de pulpa marrón con H2O2 en medio básico, logrando una disminución del 29% del número Kappa inicial del material empleando condiciones suaves.Ítem Embargo Valorización de bioaceites y biocarbones obtenidos por pirólisis de material celulósico residual(2025) Pava Gómez, Beatriz Elena; Spanevello, Rolando Ángel; Sarotti, Ariel MarceloLa soja es el principal grano de producción nacional en Argentina. Esta es comúnmente sometida a un proceso de extracción para la producción de harina y aceite, generándose como subproducto cáscara de soja (más de 400 mil toneladas anuales). Este trabajo se centró en el aprovechamiento de este residuo de lignocelulósico, mediante el uso de procesos de pirólisis como una de las tecnologías de transformación química de biomasa en materiales de valor agregado. Para poder ofrecer alternativas bioeconómicas de reciclaje de la cáscara de soja, se identificaron las condiciones óptimas de generación de los productos de gran valor agregado. En el capítulo II, se determinaron las condiciones óptimas de pirólisis para la obtención de un carbón activado (CA) con gran capacidad de adsorción mediante diseños estadísticos de experimentos. La capacidad de adsorción de los distintos carbones preparados fue evaluada a través de la adsorción de azul de metileno, un colorante difícil de remover por las técnicas convencionales de tratamiento de agua y que sirve como indicador en la capacidad de adsorción del mismo. En este capítulo se muestra la caracterización del CA optimizado. Con el fin de poner a prueba la versatilidad de la adsorción del CA optimizado, en el capítulo III se estudió la adsorción de diferentes moléculas orgánicas, como ciprofloxacina, metil éster de ciprofloxacina, tiabendazol y amarillo ácido 17. Se realizó un estudio fisicoquímico, cinético y termodinámico para entender el comportamiento, los tipos de fuerzas intermoleculares que participan y posibles mecanismos del proceso de adsorción. Por otra parte, en el capítulo IV, fueron cuantificados los componentes mayoritarios de la cáscara de soja. Así mismo, se optimizó el proceso de obtención de levoglucosenona (LGO) 1.1 del bioaceite obtenido de la pirólisis convencional de la cáscara de soja con ayuda de estadística. LGO obtenida fue aislada con un grado de pureza adecuada para poder utilizarla en otras aplicaciones. Con el fin de evaluar la viabilidad de generar productos de alto valor agregado como CA y LGO a escala industrial, se realizó un aumento del escalado del proceso de laboratorio a piloto. Se pasó de procesar gramos (ensayos realizados en los capítulos II y IV), a procesar kilogramos en un reactor pirolítico piloto (capítulo V). En este capítulo se muestra un diseño general del reactor, los cambios sobre el equipo necesarios para alcanzar las condiciones de procesamiento óptimas, entre otros. LGO obtenida en capítulo IV fue empleada como material de partida para la generación de compuestos bioactivos. En el capítulo VI, se sintetizaron nuevos selenoderivados de LGO mediante reacciones de adición de tipo Michael sobre la cetona α,β-insaturada de LGO. Con estos compuestos se realizaron estudios de actividad biológica frente a Candida y Criptococcus. De igual manera, se sintetizaron compuestos que habían sido previamente reportados, los derivados halogenados de LGO (capítulo VII), con los cuales también se realizaron ensayos de actividad biológica frente a Candida y Criptococcus.Ítem Embargo Estudio de la función de TcBDF4 y TcBDF5, dos factores de remodelación de la cromatina de Trypanosoma cruzi(2025) Rodríguez Araya, Elvio; Serra, Esteban CarlosLa enfermedad de Chagas, causada por Trypanosoma cruzi, sigue siendo un problema relevante de salud en América Latina. La regulación de la expresión génica en este parásito ocurre a nivel postranscripcional y está influenciada por mecanismos epigenéticos, incluyendo la acetilación de histonas. En este contexto, las proteínas con bromodominio (BDF) son fundamentales en la regulación epigenética, ya que reconocen residuos de lisina acetilados en histonas y otros sustratos. En T. cruzi, se han identificado ocho BDF con estructuras diversas, cuya función aún no está completamente caracterizada. Esta tesis se centra en el estudio de TcBDF4 y TcBDF5, dos miembros de esta familia, y su integración en complejos asociados a la acetilación de histonas (HARC, por sus siglas en inglés). Se implementó una estrategia experimental multidisciplinaria dividida en cuatro capítulos, combinando enfoques proteómicos, bioinformáticos y funcionales. Mediante el uso de TurboID, se identificaron los interactomas de TcBDF4 y TcBDF5, revelando su participación en los complejos TcCRKT y TcNuA4, este último homólogo al complejo NuA4 de eucariotas superiores. Se determinó que TcBDF5 es un regulador central del grado de compactación de la cromatina, actuando a través de su integración en TcCRKT y su asociación con otros factores de remodelación epigenética. Su función es clave para modular los estados de condensación de la cromatina, equilibrando entre conformaciones más abiertas, que favorecerían la transcripción, y estados más compactos, que restringirían el acceso a la maquinaria transcripcional. El análisis estructural mediante AlphaFold2-multimer y dinámica molecular permitió predecir interacciones directas dentro de estos complejos, las cuales fueron validadas experimentalmente mediante ensayos de doble y triple híbrido en levaduras (Y2H/Y3H). A nivel bioinformático, se empleó una estrategia de ensamblado combinatorio para predecir la organización y estequiometría de los complejos identificados, integrando predicciones de dímeros y oligómeros con herramientas como FoldSeek, CombFold y teoría de grafos. Finalmente, se evaluó el impacto funcional de TcBDF5 en el ciclo de vida del parásito mediante la generación de líneas knockout y sobreexpresantes. Se observaron alteraciones significativas en el crecimiento y la morfología nuclear de los mutantes, lo que sugiere un rol esencial de TcBDF5 en la regulación epigenética de T. cruzi. Además, se identificó el dominio MRG de TcBDF5 como un blanco terapéutico clave, dado su papel en la regulación de la compactación de la cromatina. Este dominio participa en interacciones esenciales dentro del complejo TcCRKT, modulando directamente la transición entre estados más abiertos o compactos. Su inhibición podría representar una estrategia innovadora para alterar la estructura de la cromatina en el parásito y afectar su viabilidad. Los hallazgos de esta tesis aportan información clave sobre la función de TcBDF4 y TcBDF5 y sus interacciones dentro de los complejos HARC. Además, identifican potenciales blancos terapéuticos para el desarrollo de nuevas estrategias contra la enfermedad de Chagas.Ítem Embargo Estudio del papel de proteínas Vav en procesos celulares asociados al cáncer(2025-02) Cesatti Laluce, N.; Menacho Márquez, Mauricio; Girardini, JavierEl aumento de la expectativa de vida de las últimas décadas a nivel global ha contribuido a que el cáncer adquiera una mayor relevancia como una de las principales causas de muerte. Entre los distintos tipos de cáncer, aquellos que afectan a la piel han cobrado particular importancia, debido al deterioro progresivo de la capa de ozono y el consecuente aumento de exposición a radiación ultravioleta; principal factor ambiental implicado en el desarrollo de estas patologías. Por su parte, el melanoma es la forma más mortal de cáncer de piel y, tanto su incidencia como su mortalidad han aumentado en las últimas décadas. Las proteínas VAV son factores de intercambio de nucleótidos de guanina (GEF) que catalizan la activación de GTPasas, principalmente de la familia Rho/Rac. Por su actividad catalítica, se ha documentado ampliamente el rol protumoral de esta familia de GEF en diversos tipos de cánceres, entre ellos: de colon, mama, próstata e, incluso, de piel no melanoma, entre otros. En el presente trabajo, se llevó adelante un estudio del rol de VAV3 en el melanoma cutáneo. El papel de VAV3 en este tipo de cáncer no ha sido estudiado hasta el momento de publicación de este trabajo. La caracterización del rol de este GEF en melanoma se llevó adelante mediante abordajes in silico, in vitro e in vivo empleando modelos celulares, murinos y de bases de datos de pacientes. Los resultados obtenidos evidencian que VAV3 es el miembro de esta familia de GEF cuya expresión es más alta tanto en la piel como en el melanocito cutáneo en condiciones fisiológicas. Además, la expresión de este GEF se asocia directamente a la probabilidad de supervivencia de los pacientes, sugiriendo roles específicos de este miembro de la familia VAV. Por otra parte, se observó que la expresión de VAV3 está directamente implicada en procesos biológicos clave de la célula del melanoma, específicamente en la proliferación, la organización del citoesqueleto de actina, la migración y la apoptosis. Al mismo tiempo, en modelos animales de melanoma, la expresión de VAV3 se asoció inversamente a la agresividad de los tumores desarrollados. Finalmente, mediante abordajes bioinformáticos se identificó un amplio transcriptoma cuya expresión está asociada a la expresión de VAV3. Mediante análisis comparativo de modelos celulares y de bases de datos de pacientes, se identificó un reducido subgrupo de genes dependientes de la expresión de VAV3 y cuyas implicancias biológicas estarían relacionadas con la migración celular. El conjunto de resultados in silico, in vitro e in vivo aquí presentados dan evidencias de que la expresión de VAV3 guarda una relación inversa con la agresividad del melanoma cutáneo, sugiriendo que este GEF actúa como un gen supresor de tumores en el contexto de esta enfermedad.Ítem Embargo Relevancia del estado redox cloroplástico en el desarrollo foliar(2025) Demarchi, Mariana; Lodeyro, Anabella F.El objetivo del presente trabajo de Tesis es analizar el impacto del estado redox de los cloroplastos en procesos clave como el desarrollo foliar, la respuesta al estrés oxidativo, y la señalización retrógrada. Con este propósito, se adoptó como estrategia general la introducción de un gen proveniente de cianobacterias, ausente en plantas superiores, en diferentes especies vegetales. En este contexto, se emplearon las especies Arabidopsis (Arabidopsis thaliana), maíz (Zea mays) y tabaco (Nicotiana tabacum) que expresaban una flavodoxina (Fld) de Anabaena en cloroplastos. Estudios previos han demostrado que Fld actúa como un antioxidante general en los cloroplastos de líneas transgénicas, detoxificando las especies reactivas del oxígeno (EROs) generadas a nivel de la cadena fotosintética de transporte de electrones (CFTE), al aceptar electrones a nivel del fotosistema I de modo análogo a ferredoxina. En Arabidopsis, se investigó el efecto de esta flavoproteína en el desarrollo foliar y la respuesta al estrés. Estudios previos evidenciaron que la expresión de Fld confiere una mayor tolerancia a condiciones adversas, aunque este fenotipo conlleva una reducción en el tamaño foliar cuando la flavoproteína es expresada de manera constitutiva. Utilizando promotores inducibles para la expresión de Fld, pudimos demostrar en el presente trabajo de Tesis que Fld induce este fenotipo cuando su expresión ocurre durante la fase de expansión tardía del desarrollo foliar. Adicionalmente, se observó que la mayor tolerancia al estrés podría estar relacionada con la expresión de Fld en la etapa de proliferación celular. Adicionalmente, se investigó la importancia del estado redox de los cloroplastos dimórficos del maíz, una especie C4, en la tolerancia al estrés abiótico. Los resultados indicaron que la introducción de Fld en los cloroplastos de las células del mesófilo confiere una ventaja adaptativa bajo condiciones de sequía y estrés oxidativo. Sin embargo, la expresión de la flavoproteína en los cloroplastos de la vaina vascular no sólo no produjo beneficio alguno, sino que además aumentó la sensibilidad al estrés en estas líneas transgénicas. Por último, se analizó el impacto de los cambios en el estado redox de los cloroplastos sobre la señalización retrógrada durante episodios de estrés biótico en plantas de tabaco. Los resultados mostraron que la luz desempeña un papel fundamental durante la progresión de la infección, y que, bajo estas condiciones la expresión de Fld atenúa las lesiones provocadas por los patógenos. Además, las plantas transgénicas mostraron una reducción en la señalización retrógrada cloroplasto-núcleo, posiblemente debido a la menor presión de estrés percibida por las mismas. En resumen, el uso de flavodoxina como herramienta permitió establecer que el estado redox cloroplástico tiene la capacidad de influir en diversos procesos celulares clave en las plantas. Estos hallazgos no solo aportan valiosa información para la investigación científica, sino que también podrían aplicarse en estrategias de mejoramiento de cultivos con una respuesta optimizada frente a condiciones ambientales adversas.Ítem Embargo Alteración del transporte hepatocanalicular en la colestasis por estrógenos: papel de las especies reactivas del oxígeno(2024) Salas, Gimena; Crocenzi, Fernando A.; Basiglio, Cecilia LorenaEl metabolito endógeno del estradiol, el estradiol 17β-D-glucurónido (E17G), es considerado el principal responsable de la colestasis intrahepática del embarazo. El E17G altera la actividad de transportadores canaliculares, como la proteína asociada a resistencia a multidrogas 2 (Mrp2), a través de una internalización celular dependiente de la activación de distintas vías de señalización. Este fenómeno también se ha atribuido al estrés oxidativo en diferentes condiciones colestásicas experimentales. Sin embargo, aunque se ha avanzado considerablemente en el entendimiento de los mecanismos que participan en la colestasis por estrógenos, aún no existen reportes que involucren al estrés oxidativo en esta patología. Por lo tanto, el objetivo de este trabajo de tesis consiste en analizar la implicancia de las especies reactivas del oxígeno (ROS) en la colestasis por E17G, su origen, y las vías de señalización involucradas en el proceso de endocitosis del transportador Mrp2. Utilizando el modelo in vitro de duplas aisladas de hepatocitos de rata y el cultivo primario de hepatocitos de rata en configuración sándwich demostramos que compuestos antioxidantes previnieron la alteración de la actividad de Mrp2 inducida por E17G, siendo esta alteración igualmente prevenida por el inhibidor de la NADPH oxidasa (NOX) apocinina. En el modelo de hígado aislado y perfundido, el compuesto antioxidante N-acetilcisteína (NAC) previno el deterioro del flujo biliar y de la actividad de Mrp2 inducidos por E17G, confirmando así la participación de ROS en esta colestasis. En conclusión, la colestasis inducida por E17G está parcialmente mediada por ROS generados por NOX a través de la internalización de transportadores canaliculares como Mrp2, siendo ERK1/2 y p38MAPK necesarias para la activación de NOX. Asimismo, se utilizó el cultivo primario de hepatocitos para evidenciar que el pretratamiento con inhibidores específicos de la proteína kinasa regulada por señal extracelular 1/2 (ERK1/2) y de la proteína kinasa activada por mitógenos p38 (p38MAPK) inhibió la producción de ROS inducida por E17G. Mediante western blot, se demostró que la inhibición de NOX no afectó la fosforilación de ERK1/2 y p38MAPK. Ambos hallazgos sugieren que sería necesaria la activación de estas dos quinasas para que ocurra la activación de NOX. Además, tanto el silenciamiento de p47phox (subunidad reguladora citosólica de NOX) mediante ARNi, como la preincubación con apocinina en el cultivo de hepatocitos en configuración sándwich previnieron significativamente la internalización de Mrp2 inducida por E17G, lo que sugiere un papel crucial de NOX en este fenómeno.