(FBIOyF) Posgrado - Tesis

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Embargo
Roles biológicos de proteínas asociadas a neurodegeneración en células tumorales
(2024) Zanotti, Lucía Camila; Menacho Márquez, Mauricio; Pérez, Ana R.
El cáncer y las enfermedades neurodegenerativas representan una grave problemática sanitaria a nivel mundial ya que afectan a un gran número de personas en todo el planeta. Ambos grupos de enfermedades son el resultado de la interacción entre genes y factores ambientales. Sin embargo, la diferencia clave entre ambas radica en que los procesos biológicos característicos que conducen a estas patologías ocurren en sentido opuesto: en el cáncer se produce una división celular descontrolada mientras que, en las enfermedades neurodegenerativas, la principal manifestación es la muerte celular. Numerosos estudios han demostrado una relación directa entre la Enfermedad de Parkinson (EP), el segundo trastorno neurodegenerativo más frecuente a nivel mundial, y el desarrollo de melanoma; en particular, estudios epidemiológicos han evidenciado un mayor riesgo de desarrollar melanoma en personas con EP, y sorprendentemente, esta relación también se da en sentido inverso. Una posible conexión entre estas patologías radica en la alteración de las funciones de las sinucleínas, un grupo de proteínas neuronales que incluye alfa-, beta- y gamma-sinucleína (αS, βS y ɣS, respectivamente), implicadas tanto en cáncer como en neurodegeneración. En particular, ɣS ha mostrado estar asociada con el desarrollo de varios tipos de tumores, como el de mama, pulmón y próstata promoviendo la proliferación y la resistencia a la apoptosis, además de influir en la capacidad de las células tumorales para migrar e invadir otros tejidos. Esto sugiere que ɣS podría ser relevante en la progresión del cáncer por lo que está siendo investigada como un posible biomarcador para la detección temprana de la enfermedad. Sin embargo, hasta la fecha, no se ha investigado su papel en melanoma. Por ello, la presente tesis tiene como objetivo estudiar la función de ɣS en el desarrollo del melanoma, el cáncer de piel más mortal. A través de un enfoque integral que incluye estudios in silico, in vitro e in vivo, observamos que ɣS participa en procesos de proliferación, migración y adhesión celular, fundamentales en la progresión del melanoma. Modulando sus niveles endógenos en células de melanoma observamos que las vías de MAPK y PI3K/AKT se veían afectadas al cambiar su expresión. A su vez, demostramos que ɣS es capaz de formar fibrillas in vitro y que las células son capaces de incorporar la proteína cuando se le adiciona a su medio de cultivo. Estos resultados fueron corroborados en un modelo in vivo donde vimos que la disminución de los niveles de ɣS conducen a un menor crecimiento tumoral y a un menor número de metástasis mientras que, el pretratamiento con ɣS, aumentó el tamaño tumoral sin afectar el desarrollo de metástasis. Por último, mediante un abordaje in silico confirmamos que vías de señalización y procesos relacionados con la matriz extracelular, adhesión y migración celular están sobrerrepresentadas cuando cambian los niveles de ɣS en tumores de pacientes. Aunque estudios adicionales son necesarios para entender el mecanismo de acción de ɣS en melanoma, esta tesis sugiere su implicación activa en la progresión y malignidad del melanoma, estableciendo un fundamento para futuras investigaciones.
Embargo
Revalorización de descartes agroindustriales: producción de fructooligosacáridos (prebióticos) a partir de descartes de zanahoria
(2024) Guerra, Laureana; Clementz, Adriana; Romanini, Diana
En Argentina se desecha un volumen de 80 a 100 toneladas diarias de zanahorias durante la época de cosecha (junio a diciembre), debido a que las mismas no cumplen con los estándares de calidad, forma y tamaño impuestos por el mercado consumidor. Sólo un 10-20% del descarte se aprovecha para la alimentación del ganado, mientras que el resto se vierte en campos cercanos donde se descompone a cielo abierto, generando proliferación de plagas, malos olores y gases de efecto invernadero. Al impacto negativo que esto tiene sobre el ambiente, se suman las graves pérdidas económicas para los productores y las consecuencias éticas y sociales asociadas al descarte de alimentos. Esta situación se repite en otras áreas productoras a nivel mundial. Las zanahorias descartadas poseen las mismas condiciones de madurez, frescura y características nutricionales que aquellas comercializadas. Además, son fuente de azúcares, carotenoides, pectinas, fibras, vitaminas y minerales, lo cual les otorga un enorme potencial de revalorización. Por otro lado, la creciente preferencia de los consumidores por alimentos más saludables ha estimulado el desarrollo de nuevos ingredientes que proporcionen mayores beneficios para la salud humana. En este contexto, en los últimos años ha tomado relevancia un grupo de prebióticos conocidos como fructooligosacáridos (FOS), capaces de estimular el crecimiento de la microbiota intestinal saludable (lactobacilos y bifidobacterias) y promover múltiples beneficios para la salud al ser consumidos regularmente. Los FOS pueden ser usados, además, como endulzantes de bajas calorías y reemplazantes de grasas y azúcares, por lo que son incorporados a una amplia gama de alimentos funcionales como bebidas, yogurts, barras de cereal y fórmulas infantiles. Estos prebióticos pueden sintetizarse a partir de la sacarosa mediante enzimas con actividad transfructosilasa (At) tales como β-fructofuranosidasa (FFasa. EC. 3.2.1.26) y fructosiltransferasa (FTasa. EC. 2.4.1.9). Dichas enzimas pueden producirse mediante fermentación en estado sólido (FES) utilizando descartes agroindustriales y microorganismos tales como hongos filamentosos, bacterias o levaduras. Este trabajo de tesis tuvo como objetivo principal la revalorización de descartes de zanahoria generados en la región para la obtención de una bebida prebiótica de zanahorias, con FOS sintetizados in situ mediante síntesis enzimática. Para cumplir con el objetivo general del proyecto, en primer lugar, se estudió la producción de enzimas con actividad FFasa mediante FES utilizando hongos filamentosos (A. niger y A. oryzae) y bagazo de zanahorias como sustrato. La máxima producción de FFasa (118 U/mL) se alcanzó utilizando A. niger como productor y suplementando el bagazo con un medio enriquecido en fuentes de nitrógeno tales como (NH4)2SO4, extracto de levadura y urea (MNtz). La enzima obtenida fue parcialmente purificada 12,5 veces, obteniéndose una fracción (FP1) con At específica de 59 Ut/mg. La misma fue identificada como βfructofuranosidasa, con un PM de 63,6 KDa y PI de 5,06. La enzima FFasa presente en (FP1) fue capaz de catalizar eficientemente la síntesis de FOS in situ en jugo de zanahorias, permitiendo la obtención de un jugo prebiótico con 50,4 g/L FOS. Finalmente, se evaluó la deshidratación del jugo prebiótico obtenido mediante secado spray. El máximo rendimiento (54%) se obtuvo utilizando maltodextrina como carrier en proporción 1:1 y jugo de 15°Bx. Los polvos obtenidos en estas condiciones mostraron características fisicoquímicas adecuadas y superaron las pruebas de aceptabilidad en el análisis sensorial cuantitativo descriptivo (QDA) y análisis sensorial hedónico. Se determinó que la temperatura de secado óptima para obtener el máximo rendimiento y conservación de compuestos de interés (FOS y β-carotenos), así como características fisicoquímicas adecuadas en el polvo era 140°C. Este trabajo aporta un conocimiento valioso para la revalorización de residuos de zanahoria mediante su transformación en un producto con alto valor nutricional y comercial. También abre las puertas para ampliar el estudio de la producción de FOS en el país, utilizando diversos descartes agroindustriales.
Embargo
Estudio de la respuesta a patógenos en cultivares de Solanum tuberosum L. de interés agronómico. Empleo de biocontroladores como estrategia de protección a la enfermedad
(2023) Martínez, María Florencia; Martin, Ana Paula; Marano, María Rosa
En esta Tesis, se aborda exhaustivamente la problemática de las enfermedades virales que impactan en cultivos agronómicos, resultando en pérdidas significativas en rendimiento y en calidad fitosanitaria. Se destaca la intrincada red de señalización que las plantas activan en respuesta a los patógenos, siendo determinante para establecer su resistencia o susceptibilidad. La resistencia, caracterizada por la inhibición de la replicación y el movimiento intercelular del patógeno viral, con frecuencia se acompaña de una respuesta hipersensible (HR) que implica la muerte celular programada en el sitio de la infección. En plantas susceptibles, los síntomas de la enfermedad no están restringidos espacialmente. La activación del sistema inmunitario en las plantas se configura como una tarea fundamental para salvaguardar los cultivos frente al ataque del patógeno. Previamente, se determinó que la proteína de movimiento de 25 kDa del virus X de la papa (PVX) cepa ROTH1 (25K1) actúa como efector viral en la HR mediada por Nb en las hojas de S. tuberosum cv. Pentland (genotipo Nb), y su regulación está bajo la influencia del ácido salicílico (AS). En este trabajo se profundizó el estudio de esta interacción mediante la evaluación integral del papel de los microARNs y sus secuencias blanco, identificando los principales procesos biológicos involucrados. Además, se caracterizó la respuesta de defensa de cultivares de papa locales frente a PVX y Phytophthora infestans, siendo este último también un patógeno importante de la papa, mediante el uso de herramientas moleculares. Se resalta la importancia de comprender y mejorar la resistencia de las plantas a través de estudios integrales. Asimismo, se exploró la actividad bioprotectora del extracto acuoso de romero (EAR). Los resultados demostraron que el EAR reduce los síntomas, la multiplicación y diseminación del patógeno cuando se aplica antes de la inoculación. En conclusión, este trabajo integral aborda la respuesta de las plantas, en especial ante patógenos virales, desde la perspectiva molecular hasta la implementación práctica de medidas bioprotectoras, como el uso de extractos naturales, ofreciendo así una contribución valiosa para la protección de los cultivos agrícolas.
Embargo
Desarrollo de una plataforma para la producción de enzimas recombinantes de interés industrial en gram-positivos
(2024) Lacava, Franco Emanuel; Aguirre, Andrés; Cerminati, Sebastián
El aceite crudo de soja requiere de un tratamiento exhaustivo para alcanzar los estándares exigidos tanto para el consumo humano como para la producción de biodiesel. Durante este tratamiento, el aceite se somete a un proceso de desgomado con el objetivo de reducir el contenido de fosfolípidos presentes. Existen tres métodos principales de desgomado: desgomado acuoso, desgomado ácido y desgomado enzimático. Este último se caracteriza por el uso de fosfolipasas del tipo C (PLC) para hidrolizar los fosfolípidos presentes, generando diacilglicéridos y productos solubles en agua. Este proceso tiene como principal ventaja que permite hidrolizar cerca del 90 % de los fosfolípidos presentes. Además, supone un aumento en el rendimiento del proceso, ya que los diacilglicéridos generados se reparten en la fase oleosa, incrementando su volumen. Finalmente, si se compara con el desgomado acuoso, el volumen de las gomas es menor y, por consiguiente, el contenido de aceite atrapado en ellas también lo es. El presente trabajo de Tesis se llevó a cabo en un laboratorio especializado en la producción de enzimas recombinantes destinadas al tratamiento de aceites y subproductos de la industria oleoquímica. Previo al inicio de esta investigación, en dicho laboratorio se había logrado desarrollar un cóctel enzimático conformado por dos fosfolipasas de tipo C y una glicerofosfolípido-colesterol acil transferasa, que permitía la hidrólisis eficaz de los fosfolípidos presentes en el aceite crudo de soja. Sin embargo, a pesar de la eficacia del cóctel, su principal desventaja era la manufactura de dos de sus tres enzimas en Escherichia coli, un microorganismo no secretor. Esto elevaba significativamente los costos de producción y presentaba un obstáculo para la viabilidad comercial del producto. Por lo tanto, surgió la necesidad de buscar un microorganismo gram-positivo secretor que permita la expresión de las fosfolipasas presentes en el cóctel enzimático. Empleando el microorganismo gram-positivo secretor Corynebacterium glutamicum, se evaluaron siete secuencias que codifican para enzimas con actividad PIPLC. Dos de las siete enzimas fueron producidas exitosamente en el medio extracelular y su expresión se evaluó posteriormente en cultivos de alta densidad celular. Debido a la concentración obtenida, se decidió seguir trabajando con la PI-PLC de Streptomyces antibioticus (PI-PLCSa1). Dicha enzima se caracterizó en aceite, donde se optimizó tiempo de reacción, temperatura de reacción y dosis mínima. La misma presentó una actividad especifica 33 veces superior a la PI-PLC que formaba parte del cóctel enzimático desarrollado previamente en el laboratorio. Paralelamente, se llevó a cabo la producción de la enzima PC-PLCBc en C. glutamicum y se comprobó que el cóctel enzimático así conformado permite la hidrólisis completa de los fosfolípidos PC, PE y PI, sin la necesidad del agregado de la glicerofosfolípido-colesterol acil transferasa. A pesar de estos muy buenos resultados, surgió la necesidad de la búsqueda de otro microorganismo grampositivo secretor debido a que las fermentaciones de C. glutamicum carecían de reproducibilidad y presentaban el inconveniente de la constante formación de espuma cuando se alcanzaban altas densidades celulares. Para superar dicho inconveniente, se optó por evaluar a Bacillus licheniformis como microorganismo productor. Se llevaron a cabo una serie de mutaciones en el genoma con el objetivo de obtener una cepa chasis para la producción de proteínas heterólogas. Para ello, se realizaron deleciones en genes que codifican para proteasas extracelulares, factores de transcripción que regulan el proceso de esporulación, genes involucrados en la síntesis de pigmentos, autolisinas, profagos y genes que codifican para proteínas abundantes en el secretoma de B. licheniformis. Utilizando un promotor constitutivo doble, se evaluaron distintos sitios de integración para el gen que codifica para la enzima PI-PLCSa1 y se construyeron cepas productoras con tres copias en el genoma del gen que codifica para la enzima PI-PLCSa1 y dos copias del gen que codifica para la enzima PC-PLCBc. Dichas cepas se evaluaron posteriormente en cultivos de alta densidad celular, consiguiendo rendimientos similares o superiores a los obtenidos con C. glutamicum utilizando un plásmido con alto número de copias. Finalmente, se llevó a cabo el escalado del proceso de producción de la enzima PI-PLCSa1 en la planta de la empresa Keclon SA ubicada en la ciudad de San Lorenzo. Se llevó a cabo una fermentación de 15.000 litros iniciales, obteniéndose 3,4 g/L de la enzima de interés al final del proceso y 2.065 litros de una formulación con una concentración final de 11,6 g/L de PI-PLCSa1.
Embargo
Obtención, identificación y caracterización del mecanismo de acción de compuestos bioactivos con acción antibacteriana
(2024) Casal, Alejo; García Véscovi, Eleonora; Furlán, Ricardo Luis Eugenio
Salmonella es un género de bacilos gramnegativos y anaerobios facultativos perteneciente a la familia Enterobacteriaceae. Estas bacterias son responsables de diversas enfermedades en humanos y animales, que van desde gastroenteritis y fiebre entérica hasta bacteriemia e infecciones localizadas, además de poder estar presentes en estado de portador asintomático. El tipo de infección varía según el serotipo de Salmonella y las características del hospedador. En este proyecto, se trabajó con Salmonella enterica serovar Typhimurium, un serotipo que puede infectar a una variedad de hospedadores y causar gastroenteritis en humanos, ganado, caballos y otros animales. La infección por Salmonella generalmente ocurre a través de la ingesta de agua o alimentos contaminados. Las bacterias que logran sobrevivir al ambiente ácido del estómago y competir exitosamente con la microbiota intestinal, pueden colonizar el intestino delgado. En casos de gastroenteritis, las bacterias suelen permanecer en el tracto intestinal, gracias a la acción de células del sistema inmunológico, como los neutrófilos, lo que permite que la enfermedad sea autolimitada en adultos inmunocompetentes. Sin embargo, cuando la infección se vuelve sistémica, las bacterias son fagocitadas por los macrófagos intestinales y posteriormente diseminadas a través del sistema retículo-endotelial. Las bacterias tienen una notable capacidad de adaptarse a una amplia gama de condiciones ambientales, lo que se debe en gran medida a la regulación flexible de su vasto reservorio genético. Los sistemas de dos componentes (TCS) juegan un papel crucial en la transducción de señales, conectando estímulos externos con respuestas adaptativas específicas. Un TCS típico consta de dos proteínas conservadas: una histidina quinasa (HQ) y una proteína reguladora de respuesta (RR). La HQ actúa como sensor de cambios ambientales, como variaciones en la concentración de iones, pH o la presencia de moléculas específicas. Al detectar estos estímulos, la HQ se autofosforila en un residuo de histidina y transfiere el grupo fosfato a un residuo de aspartato en la RR. La RR, una vez fosforilada, regula la expresión de genes específicos, permitiendo que la bacteria ajuste su comportamiento y sobreviva en condiciones cambiantes. El sistema de dos componentes PhoP/PhoQ en Salmonella Typhimurium está compuesto por la histidina quinasa PhoQ y el regulador de respuesta PhoP. Este sistema responde a diversas señales ambientales a las que la bacteria se enfrenta durante su ciclo de vida dentro del hospedador, como la disponibilidad de Mg²⁺, la presencia de péptidos catiónicos antimicrobianos (CAMPs), ácidos grasos insaturados de cadena larga, y un pH ácido. Como mecanismo de adaptación, PhoP/PhoQ regula la expresión de genes que participan en la homeostasis de magnesio, la modificación del lipopolisacárido (LPS) para resistir a los CAMPs y la tolerancia al pH ácido. Además, controla la expresión de dos sistemas de secreción tipo III codificados en las islas de patogenicidad I y II, necesarios para el ingreso, supervivencia y proliferación dentro de células fagocíticas y no fagocíticas. La Organización Mundial de la Salud ha identificado a las bacterias resistentes a antibióticos como una de las mayores amenazas para la salud mundial. Estas bacterias causan infecciones difíciles de tratar debido a la disminución de la eficacia de los tratamientos disponibles, lo que prolonga las hospitalizaciones, incrementa los costos médicos y aumenta las tasas de mortalidad. Entre las principales causas del desarrollo de resistencias se encuentran el mal uso generalizado y el uso excesivo de antibióticos en la medicina y la industria alimentaria. En este contexto, las cepas de Salmonella resistentes a fluoroquinolonas se encuentran entre las bacterias prioritarias para el desarrollo de nuevas terapias. Los genes de virulencia en Salmonella son esenciales para causar infección, pero no son indispensables para la viabilidad de la bacteria. Por tanto, los fármacos que puedan inhibir la patogenicidad sin afectar los genes esenciales podrían reducir la aparición de mecanismos de resistencia. Dado que PhoP/PhoQ es un regulador clave de la virulencia en Salmonella, y que los sistemas de dos componentes no están presentes en mamíferos, este sistema se presenta como un objetivo prometedor para el desarrollo de nuevos antimicrobianos. La colistina, un antibiótico reservado para tratar infecciones graves causadas por bacterias gramnegativas resistentes, se utiliza en situaciones críticas debido a su eficacia contra patógenos como Pseudomonas aeruginosa y Klebsiella pneumoniae. Sin embargo, su uso está restringido debido al aumento de la resistencia, lo que ha impulsado la investigación de combinaciones con otros antibióticos, como rifampicina y carbapenemes, para mejorar la eficacia y reducir la resistencia. Las codrogas o adyuvantes de antibióticos pueden potenciar la actividad de los antibióticos y prevenir el desarrollo de resistencia, aprovechando sinergias entre fármacos para obtener una eficacia superior a la suma de sus efectos individuales. Esto resulta en una muerte celular más rápida y una menor probabilidad de aparición de resistencia. En este contexto, el desarrollo de fármacos que potencien el efecto antibacteriano de la colistina es especialmente valioso. En la primera parte de este trabajo, se implementó una estrategia para identificar compuestos producidos por bacterias del género Streptomyces que pudieran dirigirse selectivamente a la actividad del sistema de transducción de señales de dos componentes PhoP/PhoQ, clave en la patogenicidad de Salmonella. Las bacterias del género Streptomyces son conocidas por ser una fuente importante de compuestos con actividad antibiótica. Tras realizar el screening, se descubrió que la azomicina, un nitroimidazol secretado naturalmente por S. eurocidicus, inhibe específicamente la actividad del sistema PhoP/PhoQ tanto en medios ricos como mínimos, y además reprime in vivo la replicación intramacrofágica de Salmonella. Aunque los nitroimidazoles ya son conocidos por su actividad antimicrobiana frente a bacterias y parásitos, este estudio reporta por primera vez una actividad antivirulenta de la azomicina a concentraciones subletales. La azomicina no interfirió con el efecto inhibidor del Mg2+ cuando se añadieron simultáneamente al medio de crecimiento de Salmonella, lo que sugiere un mecanismo de acción distinto. Además, estos resultados indican que su acción es reversible e independiente de PhoQ, apuntando a que el regulador de respuesta PhoP podría ser el blanco principal de la azomicina. A pesar de que el mecanismo de acción antibacteriano de los nitroimidazoles no está completamente dilucidado, se cree que estos fármacos se activan por la reducción de su grupo nitro, un proceso favorecido en condiciones anaeróbicas. En este estudio, se demostró que el grupo nitro es indispensable para que la azomicina ejerza su acción inhibitoria sobre PhoP, aunque se descartó que actúe como un agente inductor de estrés oxidativo. El valor de IC50 estimado fue de 3,59 µg/ml (31,79 μM), lo cual es consistente con la concentración necesaria para superar las barreras impuestas por la envoltura bacteriana y alcanzar PhoP en el citoplasma. Además, se evaluó el efecto de la azomicina en la reducción de la letalidad de la infección por Salmonella en el organismo modelo Galleria mellonella. Los resultados mostraron que la administración de azomicina logró reducir la mortalidad en un 48% en comparación con el grupo control, lo que sugiere un potencial terapéutico significativo en la mitigación de la virulencia de Salmonella. Es destacable que la azomicina inhibiera la expresión génica regulada por PhoP en S. Typhimurium, S. Dublin y S. Enteritidis, mientras que concentraciones equivalentes no tuvieron efecto sobre el sistema PhoP/PhoQ en S. marcescens o E. coli. Esto sugiere que la azomicina no alteraría este sistema de señalización en otras enterobacterias, lo cual representa una ventaja significativa, ya que su acción se limitaría al patógeno objetivo sin afectar la microbiota del huésped. En resumen, esta primera parte de la tesis revela el potencial de la azomicina para ser reposicionada como una novedosa terapia antivirulenta contra infecciones por Salmonella. Asimismo, nuestros resultados destacan la eficacia de un enfoque de detección para identificar compuestos antivirulentos derivados de fuentes naturales. En la segunda parte de esta tesis, se evaluó una serie de compuestos sintéticos, que consistía en 1,2,3-ditiazoles y benzenosulfonamidas. Los ditiazoles APM007 y APM014 sobresalieron por su capacidad para inhibir la virulencia de Salmonella Typhimurium al interferir con el sistema de dos componentes PhoP/PhoQ, sin comprometer la viabilidad celular del patógeno, lo que los posiciona como inhibidores potenciales de la virulencia de este organismo. Estos compuestos se seleccionaron tras un riguroso proceso de selección en tres etapas, donde se evaluó su efecto sobre genes reporteros dependientes de PhoP/PhoQ y su selectividad hacia este sistema. Los resultados obtenidos indican que, aunque estos ditiazoles parecen dirigirse a la proteína sensora PhoQ, lo hacen mediante un mecanismo de acción diferente a los cationes divalentes, especialmente el Mg2+. Además, se observó que su efecto inhibidor es menos pronunciado en condiciones reductoras del periplasma, a través de un mecanismo dependiente de la proteína de membrana MgrB, reguladora del sistema PhoP/PhoQ. Es importante destacar que, en los ensayos realizados, los ditiazoles no mostraron citotoxicidad sobre macrófagos y lograron alcanzar las bacterias intracelulares, inhibiendo la proliferación intramacrofágica de Salmonella de manera dependiente de PhoP/PhoQ. Esto sugiere que estos compuestos podrían bloquear un paso clave en la infección sistémica, confiriéndoles un considerable potencial terapéutico. Además, se demostró que los ditiazoles actúan como potenciadores de la colistina, lo que sugiere su utilidad como coadyuvantes en el tratamiento de infecciones por Salmonella, incluidas aquellas provocadas por cepas resistentes de relevancia clínica. En conjunto, los resultados de esta segunda parte sugieren que los ditiazoles pueden inhibir selectivamente la virulencia de Salmonella sin afectar su viabilidad celular, lo que representa una alternativa prometedora para el desarrollo de nuevos fármacos que retrasen el surgimiento de la resistencia bacteriana. Además, su uso como adyuvantes de colistina posiciona a los ditiazoles APM007 y APM014 como compuestos de gran interés para el desarrollo de nuevas estrategias terapéuticas contra infecciones bacterianas. En resumen, se identificaron y caracterizaron tres compuestos relevantes: la azomicina de origen natural y los ditiazoles sintéticos APM007 y APM014. Estos resultados subrayan la importancia de mantener una perspectiva amplia en la búsqueda de compuestos activos con potencial uso terapéutico. En un contexto donde la resistencia bacteriana es creciente, se vuelve esencial adoptar enfoques innovadores que amplíen el abanico de búsqueda, considerando tanto fuentes naturales como sintéticas y explorando diferentes mecanismos de acción. Este enfoque integrado puede abrir nuevas vías para el desarrollo de terapias efectivas contra patógenos multirresistentes.
Embargo
Caracterización del rol fisiológico de la enzima FabH en micobacterias: impacto en la síntesis de lípidos y viabilidad
(2024) Savoretti, Franco; Gago, Gabriela
La tuberculosis continúa siendo una de las enfermedades infecciosas que provoca la mayor cantidad de muertes entre los adultos a nivel mundial. Mycobacterium tuberculosis es el agente etiológico de la tuberculosis y el éxito de este patógeno se debe en gran medida a su notable capacidad para sobrevivir en el huésped infectado, donde puede persistir durante varias décadas; siendo su inusual pared celular un factor clave en esta supervivencia. Los ácidos micólicos son los componentes mayoritarios de su envoltura celular y aportan a las características distintivas de esta bacteria, como son, su patogenicidad y su alta resistencia a los antibióticos comúnmente utilizados en la clínica. La biosíntesis de los ácidos micólicos involucra dos sintasas de ácidos grasos (FAS) diferentes, denominadas FAS I y FAS II. FAS I realiza la síntesis de novo de ácidos grasos, mientras que el sistema FAS II elonga los productos de FAS I. El producto del sistema FAS II es el meromicolil-ACP, uno de los sustratos utilizados para la síntesis de ácidos micólicos. Mediante una reacción de condensación entre el meromicolil-ACP y un acil-CoA producido por el sistema FAS I se forman los ácidos micólicos. Los componentes de esta vía han sido estudiados en profundidad no sólo por su relevancia para la síntesis de los ácidos micólicos, ácidos grasos de membrana, lípidos de reserva y lípidos complejos, sino también por ser el blanco de las principales drogas antituberculosas utilizadas para combatir la enfermedad. Sin embargo, aún hay componentes de esta vía que no han sido descriptos en profundidad. Este es el caso del paso metabólico que conecta a ambos sistemas FAS, es decir, la introducción de los productos del sistema FAS I en la vía FAS II. Es por esto que en esta tesis nos centramos en el estudio del rol fisiológico de la enzima FabH. Esta enzima es la única postulada hasta el momento con el rol de interconectar a los sistemas FAS. FabH cataliza una reacción de condensación entre un acil-CoA, producido por el sistema FAS I, con malonil-ACP para dar lugar a un βcetoacil-ACP. El producto de reacción de la enzima FabH inicia la síntesis en el sistema FAS II, por lo tanto, el rol postulado para FabH sería tomar los productos de FAS I para introducirlos e iniciar la síntesis en el sistema FAS II. Luego de varios ciclos de elongación en el sistema FAS II se da lugar a la cadena meromicolato, que junto con un acil-CoA proveniente del sistema FAS I, dan lugar a los ácidos micólicos. Por lo tanto, la enzima FabH tiene un rol clave en la síntesis de los ácidos micólicos, siendo un punto de unión entre ambos sistemas FAS. La función de la enzima FabH fue estudiada previamente por otros grupos de investigación mediante ensayos in vitro y también mediante la obtención de la estructura cristalográfica de la proteína unida a su sustrato. Sin embargo, hasta el momento no se ha estudiado in vivo el rol de FabH en la síntesis de ácidos micólicos. Por esta razón, en esta tesis construimos una cepa mutante ΔfabH en la cepa avirulenta Mycobacterium tuberculosis H37Ra. Confirmamos que la enzima FabH tiene un rol en la síntesis de ácidos micólicos, que se evidenció como una leve disminución en la síntesis de ácidos micólicos en la cepa ΔfabH. Además, la cepa ΔfabH es más sensible que la cepa salvaje al estrés ácido en medio sólido y líquido y a los compuestos isoniacida y cerulenina en medio sólido. No obstante, el gen no resultó ser esencial para el crecimiento de M. tuberculosis H37Ra in vitro y a pesar de la leve disminución observada en la síntesis de ácidos micólicos, la cepa mutante fue capaz de sintetizar estos componentes clave de la envoltura. Este resultado indicaría que existiría una vía o proteína alternativa a FabH capaz de iniciar la síntesis de la cadena meromicolato en el sistema FAS II que permite sostener la síntesis de ácidos micólicos. Para responder a esta hipótesis, realizamos un experimento de proteómica cuantitativa mediante LC-MS/MS, con el objetivo de identificar alguna proteína o vía cuya expresión se viera alterada en la cepa ΔfabH. En este ensayo encontramos que los niveles de la proteína EchA6 estaban aumentados 3.6 veces en la cepa ΔfabH. En un reporte previo realizado por otro grupo de investigación, se demostró que una cepa mutante en echA6 resultó ser deficiente en la síntesis de ácidos micólicos. Además, mediante doble híbrido se vio que EchA6 interacciona con KasA, una enzima del sistema FAS II, y que es capaz de unir acil-CoAs de cadena larga, el mismo sustrato que utiliza la enzima FabH. La combinación de nuestros resultados con este reporte nos condujo a hipotetizar que la enzima KasA podría tomar acil-CoAs de EchA6, de manera alternativa a su sustrato natural los acilAcpM, y de esta manera iniciar la síntesis en el sistema FAS II. En el análisis proteómico también encontramos que varias enzimas relevantes para la síntesis de lípidos complejos y triacilglicéridos se encontraron disminuidas en la cepa ΔfabH, sugiriendo un reordenamiento en el metabolismo de lípidos más global. Entre estas se encuentran cuatro enzimas triacilglicérido sintasa y cinco enzimas (MbtC, FadD26, FadD29, FadD21, y Ag85B) involucradas en la síntesis de distintos lípidos complejos, importantes tanto para la composición de la envoltura como para la patogenicidad de M. tuberculosis. La cepa ΔfabH posee alteraciones fenotípicas, como son la mayor sensibilidad al estrés ácido y la leve disminución en la síntesis de ácidos micólicos. Además, en el análisis proteómico se vio una disminución en la abundancia de enzimas implicadas en la síntesis de lípidos importantes para la patogenicidad. Por todo esto, creemos que una cepa mutante ΔfabH en M. tuberculosis H37Rv es una excelente candidata para la obtención de una cepa atenuada para la virulencia. Para evaluar si la proteína EchA6 tiene un rol en la síntesis de ácidos micólicos, utilizando la herramienta CRISPRi construimos las cepas echA6KD y ΔfabH-echA6KD, en las cuales los niveles de expresión de echA6 son reprimidos ante el agregado de anhidrotetraciclina. En primer lugar, observamos que EchA6 no es esencial para la viabilidad de M. tuberculosis H37Ra, a diferencia de lo reportado para la proteína de M. bovis BCG. Además, al analizar la síntesis de ácidos micólicos en ambas cepas mediante cromatografía en capa delgada, pudimos concluir que la proteína EchA6 no estaría implicada en la síntesis de ácidos micólicos en M. tuberculosis H37Ra en las condiciones estudiadas. Por lo tanto, a pesar de los esfuerzos realizados en este trabajo de tesis por buscar algún mecanismo alternativo a FabH por el cual se inicie la síntesis de la cadena meromicolato en el sistema FAS II, esta pregunta aún continúa abierta. A pesar de que los componentes de los sistemas FAS I y FAS II están ampliamente estudiados, la interconexión entre estos dos sistemas aún no está totalmente descripta. Además, la leve disminución observada para la síntesis de ácidos micólicos en la cepa ΔfabH no corresponde con el rol que se le asigna a FabH, como la única enzima que interconecta a los sistemas FAS I y FAS II. A partir de los resultados de esta tesis podemos concluir entonces que aún existen componentes no identificados en el modelo de síntesis de ácidos micólicos y, por lo tanto, es necesario profundizar los estudios respecto al mecanismo que interconecta ambos sistemas FAS para coordinar la síntesis de ácidos grasos y ácidos micólicos.
Embargo
Desarrollo de novedosas metodologías de elucidación estructural basadas en cálculos computacionales de RMN
(2024) Marcarino, Maribel Oriana; Sarotti, Ariel Marcelo; Zanardi, María Marta
La necesidad de descubrir nuevas moléculas con valiosas propiedades ha motorizado el avance de diferentes ramas de la química, desde la tradicional exploración de productos naturales hasta los enfoques más recientes de síntesis orientada a la diversidad. El descubrimiento de fármacos, productos naturales, agroquímicos, catalizadores u otros compuestos de interés es un proceso complejo y costoso en el cual convergen diferentes áreas del conocimiento, que dependen de cada caso particular. Si bien tradicionalmente estas etapas se realizan de forma experimental, en años recientes los métodos computacionales se han ido integrando a este esfuerzo multidisciplinario posibilitando no sólo un mejor entendimiento del sistema en estudio sino también una considerable reducción de tiempos y costos. Tan grande ha sido el impacto logrado que en la actualidad muchas de estas herramientas se han transformado en indispensables para ciertos campos disciplinares. Sin embargo, quedan muchos retos que afrontar, los mismos que estimulan la innovación y el mejoramiento de métodos que permitan combinar de forma sinérgica y multidisciplinar las fortalezas que ofrecen diferentes áreas del conocimiento. Así surge la química cuántica como una disciplina que se extiende más allá de los límites tradicionales que separan la química, la física, la biología y la ciencia de la computación; permitiendo la investigación del comportamiento de la materia a nivel molecular mediante un sistema de ordenadores, cuando la investigación de laboratorio sea inapropiada, poco práctica o imposible. La gran capacidad predictiva de la química cuántica podría transformarse en una herramienta de pronóstico y evaluación extraordinariamente más poderosa al incorporar elementos de inteligencia artificial o aprendizaje autónomo (machine learning). El empleo de estas técnicas disruptivas permite analizar bases de datos y detectar patrones de comportamiento entre variables calculables o medibles con propiedades o actividades químicas o biológicas de interés, y en base a ellos poder realizar predicciones sobre nuevos casos. En la presente Tesis Doctoral propone abordar el estudio y desarrollo de herramientas que faciliten el descubrimiento de nuevas moléculas orgánicas valiosas mediante una combinación de métodos experimentales con simulaciones cuánticas de bajo costo computacional y sofisticados métodos estadísticos y de inteligencia artificial. La incorporación de estas técnicas a menudo desconectadas entre sí permitirá brindar nuevas estrategias para aportar soluciones innovadoras a problemas desafiantes y complejos.
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Estudio y aplicación de lodos biológicos de origen industrial para la biorremediación de hidrocarburos: análisis de las comunidades microbianas y de los bioprocesos degradativos involucrados en la eliminación del diésel
(2024) Olivera, Camila; Salvatierra, Lucas Matías; Pérez, Leonardo Martín
A pesar del crecimiento de las energías renovables, el petróleo y el gas natural continúan siendo las principales fuentes de energía a nivel global, representando cerca del 80% del consumo total. Las actividades asociadas a su extracción, refinación y transporte generan grandes volúmenes de residuos contaminantes, siendo los hidrocarburos (HC) una de las principales causas de contaminación de suelos y aguas. En particular, el diésel representa un contaminante frecuente debido a su uso extendido en múltiples sectores. Frente a esta problemática, la biorremediación —un proceso basado en el uso del metabolismo microbiano para degradar contaminantes— se posiciona como una alternativa eficiente, económica y sustentable frente a los métodos físico-químicos tradicionales. Esta puede implementarse mediante bioestimulación o bioaumentación, siendo esta última especialmente útil cuando las comunidades microbianas nativas no presentan capacidad degradadora suficiente. En esta Tesis se estudió la aplicabilidad de lodos residuales de alta carga bacteriológica, provenientes de digestores anaeróbicos, para la biorremediación de hidrocarburos del diésel. Precedidos por una detallada explicación de la metodología experimental, los resultados obtenidos permitieron analizar cambios en la eficiencia de biodegradación, como así también de la actividad metabólica y estructura de la comunidad microbiana bajo distintas condiciones operativas, origen del inóculo y sistema de escalado. Durante los años de trabajo de doctorado se destinó un gran esfuerzo al diseño y mejora de los sistemas experimentales, al mismo tiempo que a la incorporación de herramientas de química analítica, microbiología, biología molecular y bioinformática. Con un primer estudio que buscó evaluar la capacidad del consorcio microbiano del lodo para degradar diésel comercial en medio líquido. Los resultados fueron satisfactorios, respaldando la formulación de las hipótesis y la presentación del plan de Tesis doctoral. La separación entre la fase acuosa (medio con microorganismos) y orgánica (diésel comercial en fase libre) obligó a un replanteo experimental. Para sortear este efecto, se comenzaron a realizar ensayos en peceras de unos 3 litros, llenas de arena saturada de humedad por el agregado del lodo, pero sin líquido libre en la superficie. Estos cambios incrementaron notablemente la eficiencia de degradación. El resultado de estas modificaciones, luego de varios intentos e iteraciones, fueron plasmados en la construcción de sistemas a escala piloto de aproximadamente 200 litros. Paralelamente, y para poder estudiar simultáneamente múltiples variables, se procedió a reducir la escala, llevándola nuevamente al laboratorio. Se emplearon así tubos estériles de polipropileno de 50 ml, rellenos de arena sin saturación de fase líquida libre. El uso de arena permitió resultados semejantes con una manipulación mucho más simple. Para poder llevar adelante mediciones periódicas, cada determinación se llevó a cabo a partir del contenido total de un tubo reactor. De esta forma, una misma condición bajo estudio involucró muchas unidades individuales preparadas de idéntica manera. Al momento de realizar un análisis, un tubo del set era retirado al azar y utilizado para tal fin, mientras sus idénticos continuaban el ensayo hasta que les tocase su turno. Todo este recorrido, permitió obtener un sistema experimental robusto y óptimo para el seguimiento de la degradación de los hidrocarburos bajo distintas condiciones y en forma simultánea, resolviendo la complejidad del muestreo estadístico de un gran reactor voluminoso. Estos sistemas permitieron, entre otras cosas, verificar la capacidad de degradación de diésel de 5 inóculos provenientes de diversos biodigestores. La caracterización de la estructura de la comunidad bacteriana y sus modificaciones brindaron un remarcable fortalecimiento de las discusiones y conclusiones obtenidas.
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Aislamiento e identificación de biocontroladores autóctonos de cepas fitopatógenas
(2024) Santone, Antonella; Campos Bermúdez, Valeria Alina; Spampinato, Claudia P.
El uso de los microorganismos como agentes de control biológico (ACBs) para prevenir o controlar enfermedades causadas por la infección de patógenos en las plantas cultivadas es una alternativa sustentable que ha mostrado ser efectiva en un amplio número de especies vegetales. Los mecanismos de acción de dichos microorganismos se basan en la competencia por los nutrientes o el espacio, la producción de antibióticos o la activación de mecanismos de resistencia en la planta. Ampliar el conocimiento de los modos de acción de diferentes hongos y bacterias que presentan efecto antagónico sobre otros microorganismos permitiría generar productos de control biológico (CB) más eficientes para proteger a las especies de interés agronómico contra las enfermedades producidas por los fitopatógenos. Asimismo, existen ACBs que poseen la capacidad de aumentar la biodisponibilidad de nutrientes del suelo, conduciendo a un incremento en la biomasa de la planta y en el rendimiento del cultivo. Por lo tanto, la aplicación de microorganismos con capacidad para actuar como biocontroladores y al mismo tiempo, para promover el crecimiento vegetal (PGP, del inglés, plant growth promotor) representaría una alternativa eficiente al uso de agroquímicos. Las especies del género Trichoderma se han estudiado ampliamente como microorganismos beneficiosos para las plantas y representan las especies de hongos más utilizadas para el CB y para la PGP. Considerando la diversidad de los mecanismos de acción de Trichoderma y sus diferentes roles ecológicos, es de interés en este trabajo de tesis evaluar el efecto protector inducido por distintas cepas y especies de Trichoderma frente a fitopatógenos con diferentes estrategias de ataque y estudiar la capacidad de PGP y los compuestos involucrados. El presente trabajo se enfoca, por un lado, al estudio de la respuesta de defensa desencadenada en Arabidopsis thaliana a partir de la colonización de las raíces por Trichoderma. Para ello, se evaluó la protección contra el ataque de un patógeno biotrófico como es Pseudomonas syringae y contra uno de tipo necrotrófico como es Botrytis cinerea, mediante el análisis de la expresión diferencial de genes de defensa durante el priming en Arabidopsis thaliana. Los resultados obtenidos demuestran que Trichoderma activaría tanto las vías del ácido salicílico (SA) como del ácido jasmónico (JA) y del etileno (ET), desencadenando así una respuesta de defensa en A. thaliana contra patógenos con diferentes estilos de vida. Por otro lado, se llevó a cabo una selección de cepas nativas mediante distintos ensayos de CB y de PGP y se evaluó la interacción de dichas cepas con dos especies vegetales de interés agrícola: soja (Glycine max (L.) Merrill) y tomate (Solanum lycopersicum) a través de ensayos in planta. Se encontró una cepa nativa de Trichoderma con capacidad de proteger al cultivo de soja contra el cancro del tallo, enfermedad causada por el hongo Diaporthe phaseolorum y de promover el crecimiento y el rendimiento del tomate. Estos resultados comprenden las bases para el desarrollo futuro de productos bioactivos o bioinoculantes a partir de esta cepa de Trichoderma, lo que representaría una alternativa sustentable a la aplicación de agroquímicos.
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Sistemas micelares biocompatibles formados por surfactantes sintéticos y biológicos: formulación, análisis y aplicaciones
(2024) Martini, Georgina; Pellegrini Malpiedi, Luciana; Bustillo, Soledad
El presente trabajo de tesis se centró en el desarrollo y caracterización fisicoquímica de nuevas formulaciones de micelas mixtas biocompatibles, formadas por biosurfactantes (BS) y surfactantes (SF) sintéticos no iónicos. Inicialmente, se estudiaron las propiedades fisicoquímicas y aplicaciones de un extracto de BS del tipo lipopéptidos (LP) producido por Pseudomonas syringae pv. tabaci (PTA) en un biorreactor con columna de fraccionamiento de espumas. Tras 14 h de fermentación, se obtuvo un índice de emulsificación (IE) del 63% y una concentración de BS de 550 mg/L. La concentración micelar crítica (CMC) fue de 1.844,68 mg/L, reduciendo la tensión superficial a 30,07 mN/m. Al estudiar el efecto del pH en soluciones acuosas de citrato de sodio (NaCit), se observó una disminución significativa en la CMC, la cual disminuyó hasta 863,20 mg/L en pH 5,00 y hasta 341,98 mg/L en pH 7,00. El diámetro hidrodinámico (Dh) de los autoensamblados formados fue de 87,63 nm en agua, incrementando su valor hasta 173 nm en presencia de NaCit. Las emulsiones formadas con hidrocarburos mostraron una estabilidad superior al 90% después de 24 horas. Posteriormente, se abordó la formulación y caracterización fisicoquímica de sistemas micelares mixtos combinando surfactantes sintéticos (SF) como Tergitol 15-S-7 (Tg7) y Genapol X-080 (GX) con biosurfactantes (BS) como ramnolípidos (RL) comerciales y extracto de LP producido en nuestro laboratorio. Se encontró que la CMC de Tg7 y GX en agua fue de 18,23 mg/L y 21,14 mg/L, respectivamente. Ambos valores disminuyeron en presencia de aniones comsmotrópicos como el NaCit. Al combinar los SF con BS, se observó sinergia en los sistemas con LP, mientras que los sistemas con RL mostraron interacciones desfavorables. Se determinó la concentración necesaria para reducir la tensión superficial en 20 mN/m (C20), con valores de 13,75 mg/L para Tg7 y 10,55 mg/L para GX en agua, mejorando en medios con NaCit y en sistemas con LP. El análisis hidrodinámico mostró un aumento en el Dh de las micelas con el pH y la presencia de NaCit, indicando la formación de estructuras más asimétricas en ambientes de alta fuerza iónica. En cuanto al potencial zeta (ζ), la adición de RL aumentó la carga negativa en pH 7,00. En cambio, los LP no modificaron significativamente el ζ. Finalmente, las curvas de coexistencia para la separación de fases revelaron que los sistemas en NaCit a pH 7,00 alcanzaron las temperaturas de separación de fase más bajas, lo que, junto con la presencia de LP, favoreció la separación de fases a menores temperaturas, lo que puede ser útil en procesos de extracción de biomoléculas y aplicaciones industriales sostenibles. En una tercera etapa, se exploró el uso de sistemas micelares de dos fases acuosas (SMDFA) para la extracción de biomoléculas, específicamente tocoferoles (TF) y el colorante azul cibacron (AC), empleando combinaciones de SF sintéticos (Tg7 y GX) y BS (RL y LP). Los resultados mostraron que los valores de coeficiente de reparto (Kr) para AC en SMDFA sin BS fueron mayores a 5, con preferencia por la fase superior rica en micelas. La adición de RL y LP mostró efectos distintos en la extracción de AC, siendo el extracto de LP el que presentó menor eficacia, probablemente debido a su composición química. Un diseño factorial 2³ identificó las mejores condiciones extractivas para los TF, que consistieron en utilizar Tg7 al 9% p/p y RL al 0,25% p/p en NaCit 100 mM a pH 5,00 y 56°C, logrando una recuperación casi completa de TF en la fase superior, con alta actividad antioxidante. Además, se compararon dos metodologías de recuperación de TF de desodorizado de soja: saponificación modificada seguida de extracción con SMDFA y saponificación convencional seguida de extracción con solventes. La saponificación modificada seguida de extracción con SMDFA superó al método convencional, alcanzando un índice de acidez de 1,44% y una recuperación de γ-tocoferol del 91,98% en la fase superior micelar. Además, se obtuvo una alta eficiencia de asociación (94% para α-tocoferol), sugiriendo que los SMDFA también pueden mejorar la estabilidad y biodisponibilidad de los TF. Finalmente, se evaluó la citotoxicidad y actividad antimicrobiana de los SF Tg7, GX y el extracto de LP de PTA en células eucariotas y bacterianas. En células C2C12, Tg7 y GX demostraron baja citotoxicidad a concentraciones menores de 0,05 mg/mL, mientras que el extracto LP no fue citotóxico hasta 5 mg/mL. En mezclas de surfactantes, el efecto citotóxico se atribuyó a las mayores concentraciones de Tg7 y GX. Además, se observó que el extracto LP indujo necrosis celular, confirmado mediante pruebas de morfología y liberación de LDH. En cuanto a su potencial antitumoral, el LP inhibió en un 58% la adhesión de células tumorales LM3 y en un 37% su migración, sugiriendo que puede obstaculizar la propagación de células cancerígenas. Los ensayos antimicrobianos mostraron inhibición significativa de Staphylococcus aureus con el extracto LP y otros surfactantes, mientras que no hubo actividad inhibitoria contra Escherichia coli. Estos resultados evidencian la baja citotoxicidad y el potencial del extracto LP como agente antimicrobiano y antitumoral en distintas aplicaciones biotecnológicas.
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Desarrollo de compuestos de alto valor agregado a partir de biomasa residual
(2024) Crespo Guridi, Carmela Ariadna; Mangione, María Inés
La química orgánica sintética representa una herramienta fundamental para el desarrollo de nuevos productos químicos. En las últimas décadas, con la producción de compuestos quirales enantioméricamente puros, se ha puesto en evidencia los beneficios de emplear los carbohidratos, ya que constituyen materiales de partida muy versátiles para la construcción enantioespecífica de estructuras complejas con aplicaciones químicas, biológicas e industriales. Levoglucosenona es un compuesto perteneciente al grupo de derivados quirales de carbohidratos, y ha sido empleada como sintón quiral para la síntesis de una amplia variedad de productos. La misma se obtiene de la pirólisis de material celulósico y posterior destilación a presión reducida del bio-aceite obtenido, y constituye una unidad estructural enantioméricamente pura con un gran potencial para su transformación en diversos derivados quirales. En este trabajo de Tesis, levoglucosenona fue el material de partida propuesto para la construcción del esqueleto carbonado de un potencial agente herbicida, herbarumin I, y para la síntesis de otros derivados estructurales como potenciales sustratos con actividad biológica. En el Capítulo I se describe la optimización lograda de la secuencia sintética hacia el intermediario clave tri-O-acetil-D-alal a partir de levoglucosenona, la cual ya había sido patentada por nuestro grupo de investigación. Dicha secuencia pudo optimizarse con la disminución de tiempos de reacción, cantidades de solventes y reactivos tóxicos, lográndose un aporte significativo ambiental desde la óptica de la Química Verde. En el Capítulo II se describen los avances logrados en la obtención del esqueleto carbonado de herbarumin I, alcanzando intermediarios avanzados para la secuencia de síntesis propuesta. La obtención de estos intermediarios forma parte de un intensivo trabajo de investigación, ya que han demostrado comportamientos químicos inesperados, lo cual constituye un gran aporte al conocimiento científico de interés teórico y experimental para la síntesis de la molécula objetivo. En el Capítulo III se presentan derivados de levoglucosenona que fueron evaluados de acuerdo a su actividad biológica, mediante distintos trabajos en colaboración, encontrándose potenciales agentes herbicidas, insecticidas y fungicidas. Los resultados presentados en este trabajo de Tesis Doctoral aportan datos experimentales de gran utilidad en la obtención de compuestos enantioméricamente puros de alto valor agregado, así como también un notable avance en la secuencia de síntesis para la obtención de herbarumin I desde tri-O-acetil-D-alal.
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Biorremediación de metales pesados en aguas y efluentes: bioprospección y generación de algas genéticamente modificadas
(2024) Burdisso, María Lucía; Pagani, María Ayelén; Gómez Casati, Diego Fabián
Las actividades humanas liberan metales al ambiente, y los métodos fisicoquímicos para separarlos presentan numerosas desventajas. Las algas son útiles debido a su rápido crecimiento, bajo costo y capacidad biorremediadora. Ésta última podría mejorarse sobreexpresando proteínas de unión a metales como las metalotioneinas (MTs) o las frataxinas. Hasta la fecha, se han identificado numerosas MTs en plantas, no así en algas. Los objetivos de esta tesis fueron generar y caracterizar microalgas con el fin de mejorar su capacidad quelante, e identificar nuevas secuencias de MTs de algas con potencial para la biorremediación. Se generaron líneas transgénicas de Chlamydomonas reinhardtii que expresan la MT de soja GmMT3 (CrGmMT3), la frataxina endógena (CrFH), y la frataxina de maíz en citosol (CrZmFH2) y en mitocondria (CrCoxZmFH2). Mediante ICP-MS, se observó que las líneas fueron capaces de acumular mayores cantidades de Cu y Zn comparadas con la cepa salvaje y fueron más eficientes en la acumulación de Fe, Zn, Ni, Mn y Cr provenientes de un lodo de desecho industrial. Los consorcios de las microalgas generadas mejoraron la eficiencia de biorremediación de las microalgas individuales, especialmente el consorcio V (CrGmMT3, CrZmFH2 y CrCoxZmFH2). Adicionalmente, las algas fueron inmovilizadas en esferas de alginato para facilitar el escalado. En general, la inmovilización mejoró la eficiencia biorremediadora y protegió a la biomasa. Con el objetivo de encontrar nuevas MTs con características útiles para ser usadas en biorremediación, se realizaron análisis bioinformáticos y se identificaron 124 nuevas posibles secuencias de MTs en los tres grupos de algas (Chlorophytas, Rodophytas y Ochrophytas). Estas secuencias se caracterizaron mediante redes de similitudes y alineamientos de secuencias, observándose heterogeneidad en su disposición, y patrones de distribucion de cisteínas que en general no se asemejan a los de las plantas, ni a otras MTs ya caracterizadas. Las MTs de Chlorophytas presentaron mayor heterogeneidad en sus secuencias que las de Rodophytas y Ochrophytas, que mostraron mayor similitud entre sí. En base a la prevalencia de Cys en las secuencias se seleccionaron cuatro posibles MTs de algas, correspondientes a Ectocarpus siliculosus (EsilMT1 y EsilMT2), a Auxenochlorella prototheicoides (AproMT) y a Galdieria sulphuraria (GsulMT), y se evaluaron sus preferencias y capacidad de unión a metales y resistencia a un agente pro-oxidante (H2O2). Se sintetizaron los complejos metal-MT in vivo en presencia de iones metálicos de estas proteínas y se caracterizaron por ICP-AES y ESI-MS. Los resultados mostraron que una mayor cantidad de residuos Cys aumenta la cantidad de iones Zn, Cd o Cu que pueden unir las proteínas. EsilMT1 demostró tener alta afinidad por Zn y Cu, afinidad intermedia por Cd y menor resistencia al H2O2 que las otras MTs. EsilMT2, presentó baja afinidad a metales, pero confirió resistencia al H2O2. AproMT, exhibió mayor afinidad por Zn e intermedia para Cd y Cu, aunque favoreció el crecimiento en presencia de éstos últimos o de H2O2. GsulMT mostró alta afinidad por Zn y Cd, creció bien en medios ricos en dichos metales o en presencia de H2O2, pero con baja afinidad por Cu y sin ventajas de crecimiento en su presencia. Esta tesis subraya el potencial de las microalgas, y las MTs de algas como estrategias prometedoras para la biorremediación de aguas contaminadas con metales.
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Análisis genómico funcional de bacterias
(2024) Torres Manno, Mariano A.; Espariz, Martín; Blancato, Víctor Sebastián
El presente estudio busca establecer un marco teórico para la clasificación racional y efectiva de cepas del grupo Lactococcus lactis, así como desarrollar una herramienta bioinformática destinada a la minería génica y el perfilamiento funcional de cepas bacterianas. Adicionalmente, se pretende diseñar un sistema de clasificación integral para las genomoespecies del grupo Bacillus cereus, integrando datos moleculares, ecológicos y evolutivos. Por último, se utilizarán datos de secuenciación metagenómica para inferir rasgos funcionales (positivos y negativos) asociados al microbioma del rumen.
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Caracterización genética y molecular de los efectores TAL PthA de Xanthomonas citri subsp. citri AT, cepa supresora de la cancrosis bacteriana de los cítricos
(2024) Uviedo, Facundo; Marano, María Rosa; Roeschlin, Roxana Andrea; https://orcid.org/0000-0003-0437-589X
Resultados preliminares demuestran que los genes pthA de la cepa X. citri AT presentan un patrón polimórfico diferente al de la cepa de referencia X. citri 306, lo que sugiere su posible implicancia en la patogenicidad específica del hospedador cítrico analizado (Siciliano, 2009; Roeschlin, 2015). La enzima de restricción BamHI permite separar los diferentes genes de pthA (Al‐ Saadi y col., 2007; Shiotani y col., 2007) y así obtener un perfil de bandas de ADN correspondiente a los diferentes genes pthA codificados por los plásmidos de las cepas X. citri AT y X. citri 306. Los ensayos de Southern Blot, utilizando una sonda específica para pthA permitieron identificar los diferentes alelos de pthA (Siciliano, 2009). Resultó interesante observar que la cepa de referencia X. citri 306 presenta un fragmento de 3,3 kb que correspondería al gen pthA4 (da Silva y col., 2002; Al‐Saadi y col., 2007; Shiotani y col., 2007), mientras que en la cepa X. citri AT se identificó un fragmento de menor tamaño, aproximadamente 2,3 kb correspondiente a un nuevo alelo presente en esta variante. Además, se detectó un fragmento diferencial de 3,8 kb en X. citri AT. En el presente Capítulo, se propone caracterizar funcionalmente los genes de pthA identificados en la cepa X. citri AT, los cuales difieren de sus homólogos en X. citri 306. Para ello, se plantearon los siguientes objetivos: i) Evaluar la capacidad del efector TAL PthA4 en restaurar la virulencia de X. citri AT en C. limon y C. sinensis; ii) Complementar cepas mutantes de X. citri 306 en los genes pthA con los diferentes plásmidos recombinantes conteniendo los efectores TAL de X. citri AT; iii) Verificar la expresión de los PthA mediante Western Blot utilizando anticuerpos monoclonales anti-3xFLAG; iv) Evaluar el comportamiento de las cepas complementadas con los diferentes efectores TAL de X. citri A T a través de ensayos de patogenicidad en Citrus spp. utilizando dos métodos de inoculación: infiltración e hisopado.
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Rol de la transducción de señales y de los mecanismos endocítico-degradativos en colestasis: Su modulación por el agente terapéutico ácido ursodesoxicólico
(2024) Medeot, Anabela Carolina; Roma, Marcelo Gabriel; Crocenzi, Fernando A.
El estradiol 17β-D-glucurónido (E217G) induce colestasis al desencadenar la endocitosis y una posterior retención intracelular de los transportadores canaliculares Bsep y Mrp2, a través de la activación de las vías de señalización cPKC y PI3K/Akt, respectivamente. La colestasis del embarazo, se asocia al aumento de los niveles hepatocelulares de E217G. El tratamiento de primera línea para esta patología es el ácido ursodesoxicólico. Dado que los mecanismos de acción protectores de AUDC en la colestasis inducida por E217G no han sido elucidados, en este trabajo de tesis evaluamos si el tauroursodesoxicolato (TUDC), principal metabolito activo de UDCA, previene la endocitosis de transportadores canaliculares al contrarrestar la activación cPKC y PI3K/Akt inducida por E217G. Para ello, estudiamos, en primera instancia, el efecto de TUDC en las fallas secretoras de los transportadores Bsep y Mrp2 producidas por E217G en los modelos de duplas aisladas de hepatocitos de rata e hígado aislado y perfundido de rata. En ambos modelos, encontramos que TUDC previene las alteraciones secretoras producidas tanto sobre Bsep como sobre Mrp2. Además, en el modelo de hígado aislado y perfundido de rata, evaluamos el efecto de TUDC sobre la disminución del flujo biliar producido por el estrógeno, encontrando que TUDC mejora dicho parámetro. En este último modelo, también realizamos estudios de la localización de los transportadores canaliculares de interés por inmunotinción seguido de microscopía confocal, lo cual reveló que TUDC previene la desinserción y deslocalización de ambos transportadores. Por otro lado, para estudiar las vías que participan en este mecanismo protector, mediante la utilización del modelo de hepatocitos aislados de rata y subsiguiente análisis por Western blot, pudimos determinar que TUDC previene el encendido de las vías de señalización cPKC y PI3K, evitando así que los transportadores permanezcan internalizados por acción de E217G. También demostramos que el mecanismo por el cual TUDC inhibe el encendido de dichas vías de señalización requiere del aumento de Ca2+ citosólico, la formación del complejo Ca2+-CaM y la subsiguiente activación de la CaMKII. Por otro lado, en este trabajo de tesis, indagamos sobre el destino post-endocítico de los transportadores canaliculares endocitados ante un insulto colestásico sostenido por tiempos prolongados. Observamos, utilizando el modelo de hepatocitos en sándwich de colágeno, que el transportador canalicular Mrp2, pero no Bsep, es degradado vía proteosomal a las 24 h de tratamiento con los agentes colestásicos E217G y taurolitocolato (TLC), viéndose afectadas tanto su localización como su función de transporte. Estas alteraciones fueron prevenidas cuando se cotrataron los hepatocitos con TUDC y E217G. Estos hallazgos aportan conocimientos sobre los patomecanismos colestásicos del E217G y los mecanismos por el cual el TUDC actúa como agente anticolestásico en patologías colestásicas provocadas por el compuesto estrogénico. Esto ayuda a la comprensión de los mecanismos anticolestásicos del TUDC, y permite contar con información novel acerca de los nuevos blancos terapéuticos en la colestasis por estrógenos, de potencial utilidad para el desarrollo de fármacos alternativos al TUDC, con acción terapéutica efectiva en mujeres con colestasis del embarazo no respondedoras al tratamiento convencional con el ácido ursodesoxicólico.
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Función de los cuádruplex de guanina en la regulación post-transcripcional de la expresión génica
(2024) Bezzi, Georgina; Armas, Pablo; https://orcid.org/0000-0002-2218-9364
Este trabajo de Tesis Doctoral se centra en los cuádruplex de guanina (G4), estructuras no canónicas del ADN y ARN que afectan todos los procesos que involucran a estas moléculas. Los G4 formados en ARNm se han descripto como reguladores de la traducción con diferentes funciones dependiendo de las regiones en las que se encuentren. En este trabajo se propuso investigar la función de variantes genéticas en la regulación post-transcripcional de genes relevantes para enfermedades humanas (principalmente oncogenes) dependientes de G4 y estudiar la función de los G4 en la regulación post-transcripcional de genes con funciones en el desarrollo embrionario. Mediante herramientas bioinformáticas y espectroscópicas estudiamos la presencia de variantes de un solo nucleótido (SNV) en las secuencias formadoras de G4 (SNV-sG4) previamente informadas como reguladoras de la traducción en un grupo de oncogenes. Demostramos que algunas SNV afectan la formación y estabilidad de los G4, lo que podría influir en la expresión génica y predisponer a enfermedades. Experimentos de clonado de las sG4 de genes específicos en plásmidos con genes reporteros y transfección en células HEK-293 confirmaron que las SNV alteran los niveles de traducción, lo que sugiere su implicación en la regulación post-transcripcional y refuerza su potencial como objetivos terapéuticos en el tratamiento de enfermedades humanas. Por otro lado, se utilizó una novedosa estrategia bioinformática para identificar nuevas secuencias con potencial de formar G4 (PG4) conservadas funcionalmente en H. sapiens, M. musculus y D. rerio en genes asociados al desarrollo embrionario. Utilizando métodos biofísicos y ensayos de genes reporteros en células en cultivo, determinamos la formación de G4 y verificamos su capacidad de regular la traducción. Las funciones de dos de los G4 identificados fueron ensayadas in vivo el pez cebra mediante la microinyección en embriones de ARNm que contienen las PG4 en estudio controlando al gen reportero GFP sintetizados con GTP (capaces de formar G4) o con 7-deaza-GTP (incapaces de formar G4). Además, se produjo la disrupción específica de los G4 fusionados a GFP o endógenos mediante microinyección de oligonucleótidos antisentido (ASO) complementarios a las PG4. Los resultados demostraron que los G4 regulan la traducción in vivo y pueden actuar como elementos conservados de ajuste fino de la expresión génica durante el desarrollo embrionario. Durante el inicio de este trabajo de doctorado, la pandemia de COVID-19 causada por el SARS-CoV-2 nos desafió a sumar una nueva línea de investigación. Utilizando herramientas bioinformáticas, encontramos PG4 dentro del genoma de ARN del SARS-CoV-2, tanto en la hebra de sentido positivo como negativo (+/-gRNA), conservadas en betacoronavirus relacionados. Utilizando técnicas biofísicas y moleculares confirmamos la formación de cuatro G4, dos de los cuales fueron los primeros caracterizados experimentalmente en el -gRNA. Además, determinamos que CNBP, la proteína humana que se une con mayor abundancia al +gRNA del SARS-CoV-2, reconoce y promueve el desplegamiento de los G4 identificados en ambas hebras del ARN viral, sugiriendo su papel en la regulación de la expresión génica y replicación viral. Estos hallazgos señalan a los G4 como posibles blancos en el desarrollo de terapias antivirales.
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Caracterización de una fosfolipasa C de Bacillus cereus con aplicación industrial en el desgomado de aceite
(2024) Di Nardo, Luisina; Rasia, Rodolfo M.
El propósito principal de este proyecto es profundizar en el conocimiento sobre la fosfolipasa C con especificidad por fosfatidilcolina de Bacillus cereus (BcPLC), con el objetivo de facilitar el diseño racional de variantes que presenten una mayor termoestabilidad y que puedan adaptarse mejor a las condiciones que impone el uso industrial.
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Modulación de transportadores ABC hepáticos por prolactina en un modelo murino de obesidad e insulino-resistencia
(2024) Sedlmeier, María Guillermina; Francés, Daniel Eleazar; Ronco, María Teresa
El hígado es el órgano más importante en la metabolización de compuestos endógenos y exógenos. Los mismos son captados por los transportadores de la membrana basolateral del hepatocito, sufren luego reacciones de óxido-reducción e hidroxilaciones (reacciones de fase I) y reacciones de conjugación (reacciones de fase II) para aumentar su polaridad, facilitar su excreción y eventualmente disminuir su toxicidad. Los metabolitos son eliminados del hepatocito por vía apical a través de proteínas transportadoras específicas, pertenecientes a la familia de los ATP Binding Cassette (ABC), que incluye a la Glicoproteína P (PGP), Proteína asociada a resistencia a multidrogas 2 (MRP2) y la Proteína de resistencia al cáncer de mama (BCRP). La prolactina (PRL) es una hormona polipeptídica sintetizada principalmente por las células lactotropas de la adenohipófisis y está involucrada en múltiples funciones en el organismo, tanto fisiológicas (lactancia, reproducción, crecimiento y desarrollo, metabolismo) como patológicas (alteraciones en inmunidad y carcinogénesis). Las acciones de la PRL están mediadas por su receptor transmembrana, PRLR, el cual pertenece a la superfamilia de receptores de citoquinas y se encuentra expresado en diferentes tejidos: hígado, hipotálamo, pulmones, corazón, adipocitos, páncreas, estómago, intestino, riñón, bazo, ovario, glándula mamaria, etc. La vía clásica de señalización por PRL implica la unión de la hormona a su receptor predimerizado induciendo un cambio conformacional que conduce a la activación de Janus quinasa-2 (JAK-2) que fosforila residuos de tirosina en el dominio citoplasmático del receptor, seguido por el reclutamiento y fosforilación del factor de transcripción STAT5, un miembro de la familia de factores de transcripción Signal Transducers and activator of transcription. Este factor fosforilado se disocia del receptor, se dimeriza y se transloca al núcleo, activando la transcripción de genes diana. Vías alternativas que involucran la activación de proteínas quinasas (PI3K/AKT y MAPK) también han sido descritas. Generalmente, estas vías median la respuesta proliferativa y la diferenciación celular inducida por PRL. La obesidad resulta de la pérdida progresiva de la homeostasis entre el control de la ingesta de alimentos y el gasto de energía; la misma está altamente asociada con la resistencia a la insulina y constituye un factor de riesgo para el desarrollo de patologías como la diabetes mellitus tipo 2. El alto consumo de hidratos de carbono y/o grasas es uno de los principales factores ambientales que contribuyen a la actual epidemia mundial de obesidad. La obesidad y la resistencia a la insulina se encuentran generalmente acompañadas por un estado inflamatorio, caracterizado por un aumento en los niveles de citoquinas proinflamatorias tanto en la circulación como en los tejidos, así como por variaciones en los niveles séricos de distintas hormonas, entre ellas la PRL y la leptina. El hecho de que los niveles plasmáticos de PRL, entre los de otras hormonas, se encuentren alterados en diferentes modelos de obesidad e insulino-resistencia, sumado al aumento de interleuquinas pro-inflamatorias, sugieren la posible existencia de alteraciones en los sistemas de biotransformación y transportadores ABC en dichos modelos, con la consiguiente alteración del metabolismo y/o excreción biliar de compuestos que son sustratos, lo que conlleva a potenciales consecuencias sobre su eficacia y/o toxicidad. Se ha reportado que los niveles de PRL pueden encontrarse disminuidos o sin cambios en diferentes modelos de obesidad. Debido a esta discrepancia, nos propusimos evaluar los niveles de esta hormona en nuestro modelo de obesidad e insulino-resistencia inducido por una dieta rica en grasas (High Fat Diet, HFD) y evaluar cómo se encuentran los transportadores ABC hepáticos. Luego de 16 semanas de HFD los niveles plasmáticos de PRL en ratones C57BL/6 se encontraron aumentados significativamente, al igual que la expresión proteica de los transportadores PGP y BCRP en fracciones hepáticas enriquecidas en membrana canalicular. Además, para BCRP, también se evidenció un aumento a nivel de expresión de su mensajero (Abcg2). Asimismo, evaluamos el nivel de expresión del ARN mensajero para el receptor de PRL (Prlr), encontrándose aumentado significativamente en el grupo alimentado con HFD. Para evaluar si esos cambios en los transportadores se debían a la PRL, utilizamos bromocriptina (Brc), un agonista D2 dopaminérgico, que actúa sobre los receptores D2 de la hipófisis inhibiendo la secreción de PRL. En estos experimentos de inhibición corroboramos que los niveles plasmáticos de PRL en el grupo HFD se vieron disminuidos luego del tratamiento con Brc, observándose también una concomitante disminución en la expresión de los transportadores BCRP y PGP, sugiriendo que la PRL sería responsable, al menos en parte, del aumento de los niveles de expresión de dichos transportadores en el modelo de HFD. Se sabe que la expresión del gen Abcg2, que codifica para el transportador BCRP, es regulado transcripcionalmente por PRL a través de la vía que involucra a STAT5 en diferentes tipos celulares, pero se desconoce qué sucede en hígado. Por esta razón continuamos profundizando el estudio para conocer más sobre el mecanismo de acción de PRL sobre este transportador en hígado. Realizamos un análisis in silico para determinar la presencia de sitios putativos capaces de unir a STAT5 en el promotor de BCRP en hígado de ratón adulto, encontrando uno para STAT5b. Esto, sumado al hecho de que la dieta aumenta la translocación de STAT5 al núcleo, efecto que es contrarrestado por el uso de bromocriptina, nos sugiere que este factor de transcripción podría estar actuando en la modulación de BCRP hepático por PRL. Para confirmar la activación de STAT5 analizamos la expresión de algunos targets del mismo, como BCL-2 y BCL-xL, obteniendo una expresión proteica significativamente aumentada luego de la dieta, corrigiéndose este aumento con el uso de bromocriptina. Además, se observó el mismo comportamiento para el nivel de expresión del mensajero para el receptor de PRL, otro blanco de este factor de transcripción. Estos resultados en conjunto nos sugieren que la PRL modula la expresión de BCRP a través de una de sus vías canónicas mediadas por STAT5. El cuadro de obesidad e insulino-resistencia se caracteriza por un estado inflamatorio, donde los niveles de citoquinas pro-inflamatorias circulantes y en tejidos se encuentran aumentados y donde el tejido adiposo juega un papel central. En otros modelos de alteraciones inflamatorias, como el inducido por LPS que conduce al aumento de citoquinas como IL-1, IL-6 y TNF-, las cuales se sabe que son capaces de modular la expresión y actividad de transportadores hepáticos, particularmente IL-1 y TNF- up regulan la expresión de PGP, mientras que IL-6 la disminuye. Dado que en nuestro modelo no sólo está aumentada la PRL sino también el nivel de las citoquinas proinflamatorias IL-1 IL-6 y TNF- circulante y además como se ha descripto un efecto hipoglucemiante de la bromocriptina, evaluamos si los cambios observados en estos transportadores se deben a la modulación por PRL del componente hormonal e inflamatorio, o si esta hormona tiene un efecto directo sobre el hepatocito, teniendo en cuenta que su receptor se encuentra aumentado en hígado. Utilizando un modelo in vitro observamos el efecto directo de PRL sobre el hepatocito, encontrando un aumento tanto de proteína como ARNm de BCRP luego del tratamiento con la hormona, corroborando el efecto observado in vivo. El efecto de los altos de niveles de PRL sobre los transportadores se observó incluso luego del aislamiento en hepatocitos de ratones que recibieron la HFD. En distintos modelos de obesidad, la expresión del transportador canalicular BCRP se encuentra aumentada y la de otros transportadores hepáticos están modificadas, afectando a la disponibilidad y excreción biliar de sus sustratos. Para atenuar o contrarrestar los efectos que trae consigo la obesidad (hiperglicemia, hiperinsulinemia, hipertensión, dislipidemia, entre otros) los pacientes obesos reciben múltiples fármacos. La problemática reside en que la dosificación de los mismos basada en el peso o volumen corporal de los pacientes, puede no ser satisfactoria en términos de seguridad o eficacia para este grupo de pacientes. Para estimar in vivo la relevancia de las alteraciones de BCRP por PRL en nuestro modelo, realizamos un estudio de la depuración de glibenclamida, sustrato modelo del transportador y que además es un hipoglucemiante utilizado en pacientes con obesidad y diabetes mellitus tipo 2. Los resultados arrojaron que, en ratones alimentados con una HFD, la desaparición plasmática de glibenclamida está acelerada y la misma se correspondió con un aumento de metabolitos de este sustrato en bilis, confirmando la alteración en el manejo de sustratos de BCRP. Para poder determinar si el mayor decaimiento plasmático se debe (en humanos, CYP3a4) del cual se ha reportado que su nivel de expresión disminuye en un modelo de obesidad inducido por una HFD. Es por ello que resulta sumamente importante poder restablecer los niveles de PRL para normalizar la expresión de BCRP y de esa manera lograr que la droga logre el efecto deseado. Estos resultados, además, nos hablan de la necesidad de incluir a pacientes obesos en los estudios de farmacocinética para lograr su éxito terapéutico. sólo a la modificación del valor proteico de BCRP y no a una mayor captación de sustrato por el hepatocito, evaluamos la expresión de algunos transportadores localizados en la membrana basolateral del hepatocito, responsables del transporte de sulfonilureas al interior del mismo, puesto que también su expresión puede verse afectada con la dieta. Dado que se han reportado cambios en los niveles de expresión del mensajero de OATPs en distintos modelos de obesidad, analizamos en nuestro modelo el nivel de expresión del mensajero para los transportadores OATPs (1a1; 1b2) observando que los mismos no se modifican con la dieta, pero sí disminuye el mensajero que codifica para Oatp1a4, lo que nos sugiere que la mayor depuración del sustrato se debe principalmente al aumento de BCRP inducido por PRL y no a un mayor ingreso del mismo al hepatocito. También descartamos que se deba a una mayor actividad de los sistemas de biotransformación debido a que la glibenclamida es metabolizada por el citocromo 3a11 (en humanos, CYP3a4) del cual se ha reportado que su nivel de expresión disminuye en un modelo de obesidad inducido por una HFD. Es por ello que resulta sumamente importante poder restablecer los niveles de PRL para normalizar la expresión de BCRP y de esa manera lograr que la droga logre el efecto deseado. Estos resultados, además, nos hablan de la necesidad de incluir a pacientes obesos en los estudios de farmacocinética para lograr su éxito terapéutico.
Embargo
Caracterización de pigmentos y enzimas producidas por una cepa aislada de Fusarium lichenicola
(2024) Melnichuk, Natasha; Romanini, Diana
La bioprospección implica la investigación de la biodiversidad para encontrar nuevos recursos de valor comercial como genes, organismos, metabolitos y proteínas. Las enzimas son un foco clave de la bioprospección debido a sus aplicaciones industriales. Estos catalizadores biológicos tienen una amplia variedad de usos, tanto en la naturaleza como en la industria. Un ejemplo de esto es su rol en la extracción de compuestos fenólicos (CF) a partir de la biomasa vegetal, un método más amigable con el medio ambiente en comparación con la extracción química tradicional. Además, este enfoque promueve los principios de la economía circular mediante la utilización de residuos agroindustriales para obtener CF de origen vegetal que son de alta relevancia por sus propiedades bioactivas. Por otro lado, los microorganismos productores de pigmentos también suelen ser blancos en un proyecto de bioprospección. Estas moléculas son alternativas interesantes a los colorantes sintéticos, ya que ofrecen funciones adicionales como bioactividad antibiótica, antifúngica o antioxidante. Esas ventajas hacen que los pigmentos microbianos sean de interés para diversas industrias como alimentaria, cosmética y textil. Este trabajo de tesis tuvo como objetivo el aislamiento de cepas de hongos filamentosos con potencial para producir pigmentos y enzimas para la extracción de compuestos fenólicos de la biomasa vegetal. En la figura 1 se esquematiza el trabajo de tesis realizado. En primer lugar, se realizó una bioprospección para aislar hongos filamentosos utilizando muestras de suelo recolectadas en un campo cercano a la localidad de Alcorta en Santa Fe, Argentina. Se aislaron cepas de hongos filamentosos y la cepa seleccionada para continuar con el trabajo fue Fusarium lichenicola ATC1. Mediante fermentación en estado sólido utilizando residuos agroindustriales como sustrato se evaluó la producción de tanasa, celulasa y pectinasa utilizando F. lichenicola ATC1. Además, se midió la capacidad antioxidante y los fenoles totales en los extractos de cultivo obteniéndose (44 ± 7) mmoles eq Trolox / 100 g SS y una concentración de fenoles de (3,1 ±0,3) gEAG/100 g SS. En cuanto al extracto pigmentado rojo, se evaluaron distintas estrategias de producción por fermentación y composición de medios de cultivo. Se avanzó en la caracterización química del extracto, sus propiedades bioactivas y sus posibles aplicaciones, entre las cuales se destacan la posibilidad de usarlo como colorante en la industria textil y su potente actividad antibiótica. Finalmente, se logró secuenciar el genoma de F. lichenicola ATC1, el cual no había sido depositado hasta la fecha lo cual permitió determinar la identidad taxonómica de la cepa ATC1. Actualmente, se está trabajando en la anotación de este genoma.
Embargo
Rol del sistema de reparación de apareamientos incorrectos en el ADN en respuesta al estrés genotóxico en Arabidopsis thaliana
(2023) Ramos, Rocío Soledad; Spampinato, Claudia P.
Como organismos sésiles, las plantas están continuamente expuestas a una variedad de factores ambientales adversos, tanto bióticos como abióticos, que pueden provocar daños en varias biomoléculas, entre ellas el ADN. Afortunadamente, todos los organismos vivos, incluidas las plantas, poseen una variedad de mecanismos para detectar y reparar los daños en el ADN con el fin de mantener la integridad del genoma. Uno de ellos es el sistema de reparación de apareamientos incorrectos en el ADN o MMR (por sus siglas en inglés, Mismatch Repair). Aunque las respuestas de las plantas al estrés, biótico o abiótico, y al daño en el ADN se han estudiado extensamente por separado, su posible interconexión sigue siendo relativamente inexplorada. Por ello, este trabajo de Tesis tuvo como objetivo investigar la función del sistema MMR, específicamente de las proteínas MSH6 (por sus siglas en inglés, MutS Homolog 6) y MSH7 (por sus siglas en inglés, MutS Homolog 7), en la respuesta de las plantas de Arabidopsis thaliana al estrés biótico y al estrés hídrico, ya que ciertos fitopatógenos, así como ciertos estreses abióticos, producen daños en el ADN. Los resultados obtenidos demostraron que MSH6 y MSH7 de A. thaliana tienen roles en la respuesta inmune a Pseudomonas syringae pv. tomato DC3000 (Pst DC3000). Más aún, estos roles serían diferenciales. Además, en este trabajo de Tesis, se demostró que la ausencia de MSH6 produce un fenotipo de menor susceptibilidad a Pst DC3000 en A. thaliana, presentando una menor apertura estomática y, en consecuencia, un menor ingreso bacteriano a la planta. Por otra parte, se demostró que la supresión de MSH6 produce una mayor acumulación del daño en el ADN y compromete la eliminación del peróxido de hidrógeno con respecto a las plantas salvajes (WT). Adicionalmente, se estudió la respuesta de las plantas mutantes msh6 frente al estrés hídrico, y se observó una menor inhibición de algunos parámetros fenotípicos frente al déficit hídrico y una menor tolerancia a la inundación en comparación con las plantas WT. Finalmente, se logró la mutagénesis sitio-dirigida del dominio Tudor del gen MSH6 de A. thaliana. En resumen, este Trabajo de Tesis, pudo demostrar la existencia de una interacción entre el sistema MMR y los mecanismos de la señalización del estrés en los organismos vegetales.

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