(FBIOyF) Posgrado - Tesis

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Plásmidos de tipo Rep_3 en la diseminación de genes de beta-lactamasas tipo OXA y la resistencia a carbapenemes en Acinetobacter baumannii
(2023) Sánchez, Rocio Inés; Viale, Alejandro M.; Morán-Barrio, Jorgelina
La combinación entre el uso poco racional de antimicrobianos y la capacidad de diferentes bacterias patógenas de adquirir y acumular genes de resistencia a los mismos ha conducido a la selección de poblaciones bacterianas con fenotipos de multirresistencia (MR) en el ambiente nosocomial, y por lo tanto a una disminución acentuada de las opciones terapéuticas para el tratamiento de infecciones. Entre estos, Acinetobacter baumannii es uno de los patógenos de relevancia en infecciones asociadas con altas tasas de morbi-mortalidad. Este microorganismo Gram-negativo, aeróbico no fermentativo, causa complicaciones clínicas tales como neumonía, bacteriemia, infecciones del tracto urinario, infecciones en piel y tejidos blandos, meningitis secundaria, infecciones en heridas y quemaduras, especialmente en pacientes inmunocomprometidos. Ha demostrado una sorprendente capacidad de evolucionar MR ante el tratamiento con diversos antimicrobianos, y la rápida adquisición y diseminación de resistencia adicional a los -lactámicos carbapenemes, uno de los últimos recursos terapéuticos disponibles, constituye así un serio problema para el tratamiento de infecciones. Recientemente la Organización Mundial de la Salud (OMS) estableció una lista de patógenos MR de prioridad para el desarrollo de nuevas herramientas terapéuticas, siendo A. baumannii categorizado de prioridad crítica por su rápida capacidad de adquirir nuevas resistencias incluyendo a los carbapenemes (https://www.who.int/mediacentre/news/releases/2017/Antimicrobial_resistance_VPC_27FEB2017.pdf?ua=1). Abordar este problema en forma racional requiere un conocimiento avanzado de la fisiopatología de este organismo, incluyendo los mecanismos implicados en la adquisición y diseminación de resistencia antibiótica. Los objetivos del presente trabajo de Tesis Doctoral abarcaron el estudio de los principales mecanismos de resistencia a carbapenemes desarrollados por A. baumannii, incluyendo la contribución de reducciones en la permeabilidad de ME y la caracterización detallada de plásmidos de resistencia involucrados en la diseminación del gen de la carbapenemasa blaOXA-58 entre la población nosocomial de este patógeno, con énfasis en cepas del complejo clonal CC15 (esquema Pasteur) prevalente en nuestra región. Los resultados del primer objetivo sobre la contribución de la proteína de membrana externa (PME) CarO de A. baumannii a la resistencia a carbapenemes utilizando estudios genéticos en la cepa modelo de A. baylii ADP1 expresando las distintas variables de CarO de A. baumannii avalan la existencia de diferentes canales con selectividad diferencial hacia sustratos como aminoácidos básicos e imipenem en la ME. También nos indican que reducciones en la permeabilidad a carbapenemes por pérdidas de PME en A. baumannii pueden contribuir a, pero no son determinantes principales de, dichas resistencias. Estudios utilizando geles de poliacrilamida bidimensionales (2D) indicaron que CarO se encuentra en la ME de cepas de A. baumannii así como de recambiantes de ADP1 formando tanto complejos homo-oligoméricos como hetero-oligoméricos con OmpA, la proteína mayoritaria de la ME. Ello apoya la hipótesis de que estos oligómeros podrían generar canales acuosos de mayor diámetro que facilitarían el ingreso de aminoácidos básicos o de carbapenemes a través de esta barrera de permeabilidad. Los resultados del segundo objetivo sobre la caracterización de plásmidos de resistencia a carbapenemes presentes en cepas clínicas locales de A. baumannii perteneciente al CC15 contribuyen a comprender la capacidad de las mismas de diseminar el gen de la carbapenemasa OXA-58 (blaOXA-58) en el ambiente nosocomial. Dichos plásmidos se encuentran en un estado dinámico de formación y resolución de co-integrados mediado por eventos de recombinación sitio-específica empleando sitios reconocidos por recombinasas XerC/D. Ello conduce a la generación de diferentes multi-replicones portando módulos de adaptabilidad conteniendo al gen blaOXA-58, lo cual contribuye a su movilización y diseminación en la población bacteriana mediante transferencia horizontal de genes. La presencia de diferentes módulos de replicación en una misma molécula de plásmido confiere evidentes ventajas para la diseminación y persistencia del co-integrado durante el tránsito por múltiples hospedadores, pero genera interrogantes sobre si todos estos replicones son efectivamente activos o sobre posibles conflictos que conduzcan a la pérdida del mismo o del módulo de adaptabilidad que esta porta. Encontramos que los 4 diferentes módulos replicativos que componen estos multi-replicones se mostraron activos al ser clonados en forma individual en diversos hospedadores del género Acinetobacter, incluyendo cepas nosocomiales y ambientales. Ello indica para los mismos un amplio rango de hospedador frente a eventos de transferencia horizontal, permitiendo así la rápida diseminación de la resistencia dentro de especies del género coexistiendo en el ambiente nosocomial. La caracterización detallada de la secuencia de los distintos módulos replicativos, sumada a ensayos funcionales, indicaron que todos ellos responden al modelo de iterones con regulación negativa del número de copias y donde cada uno posee un gen distintivo para una proteína de inicio de la replicación RepAci de la superfamilia Rep_3. El número de copias por célula de los módulos de replicación clonados en forma individual, medido en hospedadores modelo del género Acinetobacter, varió entre 5 a 8 ubicándolos en el espectro moderado. En uno de ellos identificamos regiones repetitivas independientes de los iterones las cuales se mostraron como reguladores negativos de su replicación, con potencial impacto en la resistencia antibiótica. Demostramos, asimismo, y por vez primera, que replicones Rep_3 de plásmidos de A. baumannii presentan incompatibilidad funcional, desarrollando una metodología a tal efecto. Nuestros resultados indicaron además que las clasificaciones basadas en identidades de secuencia de proteínas RepAci no son buenas predictoras de incompatibilidad funcional, y por ende de la posible coexistencia de diferentes replicones en una misma célula. En síntesis, esta tesis contribuye a definir algunos de los factores involucrados en la evolución y diseminación de resistencia a carbapenemes mediada por plásmidos en la población nosocomial de especies del género Acinetobacter, y pueden contribuir al diseño racional de medidas y herramientas farmacológicas para el control de infecciones debidas a patógenos oportunistas multirresistentes en el ámbito hospitalario.
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Estudio del rol de la Aquaporina-1 en la progresión del colangiocarcinoma
(2023) Gaspari, César Ismael; Gradilone, Sergio Alejandro; Marinelli, Raúl A.
El colangiocarcinoma (CCA) constituye un grupo heterogéneo de tumores de hígado que se originan en las células epiteliales del árbol biliar o colangiocitos. El CCA es asintomático en estadios iniciales, por lo que usualmente se diagnostica en etapas avanzadas, siendo las opciones terapéuticas escasas y el pronóstico de la enfermedad ominoso. Su incidencia y mortalidad se han incrementado en las últimas décadas mundialmente, constituyendo un problema de salud global. A pesar de los avances en la biología del tumor, en su diagnóstico y tratamiento, el pronóstico de los pacientes no ha mejorado sustancialmente en la última década. Por esta razón, existe una necesidad imperiosa de identificar los mecanismos que regulan la progresión del tumor para poder transformarlos en dianas terapéuticas, desarrollar herramientas dirigidas a estos blancos, utilizarlas en pacientes y mejorar el pronóstico de la enfermedad. Las aquaporinas (AQPs) conforman una familia de canales de membrana que facilitan el transporte osmótico de agua como así también la difusión de algunas moléculas pequeñas. La AQP1 fue identificada en 1992 por el Dr. Peter Agre, premio Nobel en Química 2003. Diversas AQPs se expresan en el hígado, específicamente, en colangiocitos se expresan las AQPs 1, 4 y 11. Se ha involucrado a las AQPs en diferentes procesos de las células tumorales, tales como, proliferación, migración, invasión y angiogénesis. No obstante, su rol en el CCA ha sido muy poco estudiado y además, los resultados son controvertidos. Sobre esta base, el Objetivo General de este Trabajo de Tesis fue estudiar el rol de la AQP1 en la progresión del CCA y si su modulación modifica el comportamiento tumoral. Inicialmente se correlacionaron los niveles de expresión de AQP1 con la sobrevida global de un grupo de pacientes con CCA. Los pacientes con menores niveles de expresión de AQP1, presentaron una sobrevida global significativamente inferior. Para los estudios in vitro, utilizamos una línea de CCA intrahepático humana (HuCCT1) en la que se confirmó la expresión intracelular de AQP1 mediante fraccionamiento subcelular e inmunobloting. Luego, desarrollamos un modelo de esta línea celular AQP1 knock-out (KO) mediante la técnica CRISPR/Cas9 y evaluamos posibles efectos en el fenotipo tumoral, mediante ensayos de proliferación y migración en tiempo real. Encontramos que las células AQP1 KO presentaron un aumento significativo tanto en la proliferación como en la migración, sugiriendo una función crucial de la AQP1 en la progresión del tumor. Posteriormente, para dilucidar los mecanismos mediante los cuales la ausencia de AQP1 modifica la agresividad de las células neoplásicas, decidimos hacer un estudio de “Next-Generation Sequencing”. Encontramos 500 genes regulados negativamente y 1083 genes regulados positivamente en las células AQP1 KO. A continuación, estudiamos algunas de las biofunciones identificadas. Basándonos en estudios de otros grupos en los que se asocian las AQPs con la transición epiteliomesénquima (EMT), decidimos focalizarnos en este programa celular. Mediante PCR de tiempo real e inmunobloting, detectamos pérdida de expresión de marcadores epiteliales y sobreexpresión de marcadores mesenquimales en las células AQP1 KO, confirmando una activación de la EMT. Seguidamente, decidimos explorar las vías de señalización involucradas en estos cambios del fenotipo tumoral. Basándonos en nuestros resultados de “Nextgeneration Sequencing” y en publicaciones, estudiamos el eje ‘insulin-like growth factor 2/insulin receptor pathway/insulin-like growth factor receptor 1” (IGF2/IR/IGFR1) como ruta de señalización potencialmente involucrada en proliferación y migración. Mediante la evaluación de la expresión por PCR en tiempo real de la expresión de ciertos genes relacionados con la ruta de señalización y utilizando la técnica de inmunobloting para analizar los niveles de fosforilación de los receptores, observamos un aumento significativo en la activación de la vía en las células AQP1 KO. El tratamiento con Linsitinib redujo la proliferación en estas células, lo que respalda la importancia de esta vía. Finalmente, se realizó un modelo de xenotransplante en ratones utilizando células AQP1 KO, que mostraron un crecimiento tumoral más rápido y una menor expresión del marcador epitelial CDH1, confirmando la agresividad de estas células. En resumen, las células de CCA deficientes en AQP1 presentan un fenotipo más agresivo in vitro; se confirmó una disminución de los marcadores epiteliales y un aumento de los marcadores mesenquimales, lo cual indica que la falta de AQP1 activa el programa de EMT, y por lo tanto aumentado su capacidad metastásica. Estos hallazgos fueron reproducidos en un modelo de xenotransplante in vivo. Cuando se analizó una cohorte de pacientes con CCA se comprobó una correlación entre expresión de AQP1 y sobrevida global. En conclusión, este estudio sugiere que AQP1 desempeña un papel crucial en la supresión de la tumorigenicidad en células de CCA intrahepático. Los resultados respaldan la importancia de investigar y comprender los mecanismos subyacentes en el CCA para mejorar las opciones de tratamiento y el pronóstico de los pacientes.
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Mejoramiento biotecnológico de la calidad del durazno, mapeo por asociación de caracteres de interés agronómico
(2023) Aballay, Maximiliano Martín; Sánchez, Gerardo; Cervigni, Gerardo Domingo Lucio
El duraznero es una especie que pertenece a la familia Rosaceae, el cual presenta un periodo juvenil que requiere entre 3 a 4 años para desarrollarse completamente. Debido al carácter auto-compatible y los extensos periodos de generación, esta especie posee una reducida variabilidad genética en comparación con otras. Estas características dificultan el mejoramiento del duraznero, por lo cual es de vital importancia implementar herramientas que modernicen los programas de mejora con el fin de escalar el desarrollo de nuevas variedades. Durante los últimos años se han producido grandes avances en las tecnologías de secuenciación, que han impulsado los estudios genómicos de duraznero. Esto permitió la implementación de la metodología GenomeWide Association Study (GWAS), para identificar variantes genéticas vinculadas a caracteres fenotípicos. Sin embargo, la complejidad de los caracteres poligénicos y la dificultad para diferenciar las variantes causales de otras altamente correlacionadas son las principales limitaciones de GWAS. Una alternativa de interés para este tipo de análisis, es el algoritmo de aprendizaje automático Random Forest (RF), el cual puede analizar grandes conjuntos de datos genómicos, y definir la influencia que tienen las variantes genéticas sobre los caracteres fenotípicos, siendo capaz de generar predicciones para dichos caracteres. Estas propiedades hacen de RF un método prometedor para ser aplicado en duraznero, ya que el entrenamiento de este tipo de modelos podría ayudar a identificar variantes genéticas asociadas a caracteres fenotípicos complejos, y predecir su comportamiento según la presencia/ausencia de estas variantes. En este trabajo se realizó la puesta a punto de la plataforma de genotipado de alto rendimiento conocida como double digest Restriction-site Associated DNA sequencing (ddRAD-seq) en duraznero, la cual no había sido aplicada en esta especie hasta el momento. Esta plataforma fue utilizada para caracterizar en profundidad la variabilidad genética contenida en la colección de germoplasma de la Estación Experimental Agropecuaria (EEA) San Pedro. Como resultado de este proceso se genotiparon 237 accesiones de duraznero (en donde se incluyen 3 portainjertos) y 2 ciruelos japoneses. Los datos de secuenciación presentan en promedio 1 M de lecturas de extremos apareados(2 × 250 pb) por genotipo. A partir del alineamiento de las lecturas al genoma de referencia se observó que las mismas se distribuyen de manera uniforme a lo largo de los 8 cromosomas. En la búsqueda de variantes se identificaron un total de 197.906 Single Nucleotide Polymorphisms (SNP), 16.338 Insertions/Deletions (InDel) y 2.712 Simple Sequence Repeats (SSR). Estas variantes luego de ser filtradas utilizando un porcentaje de datos faltantes menor al 10 % y un valor de Minor allele Frequency (MAF) mayor al 1 % se redujeron a 11.871 SNP, 1.214 InDel y 499 SSR (sumando un total de 13.584 variantes). Mediante una combinación de análisis multivariados se describió la relación que existe entre los genotipos de duraznero. Además, con la inclusión de los datos de 48 genotipos de duraznero recientemente secuenciados fue posible describir por primera vez fuentes de variabilidad de germoplasmas naturalizado en el país. Elset de 13.584 variantes genéticas de las 237 accesiones de duraznero fue utilizado para analizar la asociación con caracteres de interés agronómico mediante las metodologías de GWAS y RF. Estos métodos tienen la capacidad de identificar variantes asociadas con un carácter en particular, pero utilizan enfoques diferentes. Al utilizar ambas metodologías se busca comprobar si RF se puede desempeñar de igual manera o mejor que GWAS en duraznero, además de validar la metodología RF como método de predicción para ser aplicado en el programa de mejoramiento de duraznero. Con estos métodos se analizaron los caracteres color de pulpa, tipo de pulpa, vellosidad del fruto, capacidad antioxidante, contenido de fenoles, firmeza, peso, contenido de sólidos solubles, fecha de floración y fecha de cosecha. Como resultado de este análisis se observó asociación con los dos métodos para los caracteres color de pulpa, tipo de pulpa, vellosidad del fruto, fecha de floración y fecha de cosecha. Los dos métodos apuntan a regiones genómicas similares en cada carácter que presentó asociación. Para cada una de estas regiones se identificaron las principales variantes asociadas con cada carácter, así como también los haplobloques que contienen a dichas variantes. Los datos de las 13.584 variantes genéticas también fueron utilizados para realizar la simulación de cruzamientos entre genotipos y analizar las características de la progenie artificial obtenida. Con el objetivo de evaluar la capacidad de estas simulaciones, primero se generaron una serie de cruzamientos de prueba para comparar con cruzamientos reales que se encuentran junto a los parentales dentro de los 237 genotipos analizados. A partir del análisis de estos datos se observó que con las simulaciones de cruzamientos es posible generar genotipos artificiales con perfiles genómicos cercanos a los originados por cruzamientos reales. Una vez realizada esta validación se procedió a simular todos los cruzamientos posibles entre los 237 genotipos, con una progenie de 100 genotipos artificiales por cruzamiento. Para estos nuevos genotipos se realizaron predicciones utilizando los modelos de RF previamente entrenados con datos de caracteres de vellosidad del fruto, color de pulpa, tipo de pulpa, fecha de floración y fecha de cosecha. Como resultado de esta serie de simulaciones se obtuvo un total de 2.820.300 genotipos artificiales, para los cuales se predijo el comportamiento de cada uno de los caracteres mencionados. Con estas predicciones es posible identificar aquellos genotipos artificiales que presentan las características de mayor interés y reconocer la combinación de parentales de la cual provienen. De esta manera se puede realizar una selección más rigurosa de parentales a cruzar, ayudando a desarrollar un programa de mejoramiento de duraznero más eficiente
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Desarrollo de fosfolipasas y procesos sustentables para el tratamiento de aceites vegetales
(2023) Val, Diego S.; Menzella, Hugo G.; Peirú, Salvador
La creciente demanda de alimentos y biocombustibles exige a la industria de aceites vegetales tecnologías sustentables para mitigar la contaminación causada por los procesos de refinación química. En las últimas dos décadas, varios métodos enzimáticos han demostrado ser eficientes en la reducción de los residuos generados. Sin embargo, todavía es necesario mejorar la relación costo-beneficio de dichos procesos para lograr la adopción generalizada de estas tecnologías. En particular, el desgomado enzimático con fosfolipasas tipo C (PLCs) es una tecnología innovadora que provee un beneficio económico inmediato, al extraer cantidades adicionales de aceite desgomado. No obstante, las PLCs naturales no son activas en las condiciones en las que operan las plantas de refinación de aceite, por lo que estas necesitan ser modificadas insertando operaciones unitarias adicionales. A pesar de los beneficios evidentes de este proceso amigable con el medio ambiente la necesidad de invertir en equipos previo a su implementación y los gastos operativos asociados al proceso son una barrera para su adopción masiva. Una solución a este desafío podría ser el diseño de enzimas con características especialmente adaptadas a las condiciones físicas en las que operan las plantas actuales de la industria aceitera. En este trabajo de tesis se seleccionaron y analizaron secuencias homólogas a la enzima modelo fosfolipasa C de Bacillus cereus (CePLC) de diferentes fuentes y se eligióun subconjunto de ejemplos para expresar y caracterizar. A continuación, utilizando un conjunto de 13 secuencias homólogas se obtuvo una secuencia no natural (ChPLC) aplicando la estrategia de diseño de secuencia consenso. Las enzimas se expresaron en el hospedador C. glutamicum y se comparó la actividad y estabilidad de las enzimas a distintas temperaturas. La enzima sintética ChPLC exhibió los mejores resultados tanto en parámetros cinéticos como en ensayos de estabilidad térmica en medio acuoso. En ensayos de desgomado en aceite crudo de soja, ChPLC demostró ser eficiente a altas temperaturas. En base a estos resultados se elaboró un análisis de secuencias y modelado estructural que permitió identificar los sitios con mayor probabilidad de ser responsables del aumento de estabilidad. Se demostró experimentalmente que mutaciones puntuales en estos sitios alteran el proceso de desplegado de ChPLC, desestabilizando la enzima consenso. Para que ChPLC sea comercializada en el mercado local e internacional, es necesario producir la enzima a costos competitivos en comparación con las alternativas comerciales actuales. Con este objetivo, se optimizó la producción de ChPLC en cultivos de alta densidad en Corynebacterium glutamicum, el hospedador inicial que se eligió para su producción en el laboratorio, logrando un título de 1,2 g/L. Se demostró mediante un sencillo análisis de costos que los títulos obtenidos en la producción de la enzima en este trabajo doctoral deben mejorarse hasta diez veces para que la producción de la misma sea rentable. A continuación, se demostró que la enzima ChPLC posee la estabilidad térmica y la eficiencia necesarias para establecer un proceso que se ajuste al corto tiempo de residencia y a la alta temperatura que se utiliza en el proceso de desgomado con agua en las plantas de refinación tradicionales. Además, se demostró que con el 60 % de la dosis recomendada para las fosfolipasas comerciales, la enzima sintética genera un 2 % de aceite adicional. En base a estos resultados, y mediante un análisis tecno-económico, se predijo que la enzima ChPLC sería capaz de reducir los costos del desgomado enzimático en un 58 %. Esto proporciona la solución necesaria para promover la adopción global de esta tecnología por parte de refinerías de todos los tamaños sin inversiones de capital. Se espera que esta tecnología tenga especial impacto en mercados como el de nuestro país, donde el 90 % de las refinerías realizan desgomado acuoso. Su implementación en nuestro país generaría 180 mil toneladas de aceite de soja adicionales, con un valor exportable para Argentina superior a los 200 millones de dólares, al precio actual del aceite de soja. El proceso presentado en esta tesis fue concebido para que sea accesible a todos los productores de aceite vegetal, independientemente de su capacidad de procesamiento y ubicación geográfica, trayendo un potencial beneficio anual para la economía global en el rango de mil millones de dólares, considerando únicamente su aplicación en el refinado de aceite de soja.
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Caracterización del secretoma del microalga Scenedesmus sp. y su participación en la degradación de celulosa
(2023) Velázquez, María Belén; Menzella, Hugo G.; Peirú, Salvador
Las microalgas son microorganismos unicelulares o pluricelulares simples, que se extienden por todo el planeta ocupando tanto ecosistemas acuáticos como terrestres. Gracias a esta organización celular sencilla son capaces de vivir en condiciones ambientales adversas y proliferar rápidamente (do Nascimento, 2015). Junto con las cianobacterias, conforman la base de toda la cadena trófica. A pesar de su organización celular simple, tienen un metabolismo complejo, propio de los eucariotas, realizan fotosíntesis, sintetizan polímeros complejos, producen vitaminas y antioxidantes (Potvin, 2010). Las microalgas, especialmente las pertenecientes a las Chlorococales, se han utilizado tradicionalmente para la alimentación de especies acuáticas. En los últimos años, se ha renovado el interés por las mismas debido a su capacidad para producir numerosos compuestos de valor agregado, y al mejor entendimiento de su metabolismo y capacidad de generación de bioestimulantes, biofertilizantes, y biopesticidas en procesos altamente rentables, como la implementación de biorrefinerías. La generación de recursos energéticos renovables y la gestión de residuos son las principales preocupaciones del siglo XXI. Los residuos agrícolas y forestales lignocelulósicos son una materia prima prometedora para la producción de biocombustibles y productos de valor añadido debido a su alta disponibilidad y bajo costo (do Nascimento, 2015). Sin embargo, todavía no se ha publicado ningún proceso comercial para la hidrólisis enzimática de la celulosa. La razón principal es el alto costo de las enzimas necesarias, la baja actividad específica, la susceptibilidad a la inactivación y la dificultad de reciclaje (Potvin, 2010). La línea de investigación del laboratorio en la que se basa este trabajo tiene como objetivo combinar el potencial de crecimiento de las microalgas y su versatilidad, con el aprovechamiento de residuos agroindustriales. En mi trabajo de tesis comenzamos con el aislamiento e identificación de algas nativas del Rio Paraná para utilizarlas como fuente de nuevas enzimas y productos de interés industrial. Para ello, obtuvimos la autorización de la Dirección de Recursos Naturales de la provincia para la toma de muestra y la creación de un banco de microalgas regionales de la provincia de Santa Fe. En la primera recolección de muestras de agua, se aisló una cepa de microalga con actividad degradativa de celulosa, Scenedesmus sp. base de este plan de tesis. Scenedesmus es un género algal ampliamente distribuido en agua dulce, con un tamaño aproximado de 20 µm. Una característica distintiva de dicho género es el crecimiento en grupos (o coenobium) que van desde cuatro a diez o más células unidas. Sus células más externas pueden contener espinas, las cuales son un grupo de soportes largos unidos que permiten que el coenobium flote. Scenedesmus, como otros miembros de los Chlorococcales, contiene altas proporciones de proteínas y lípidos, y posee una excelente capacidad de tratamiento de aguas residuales, secuestro de CO2 y adaptación a condiciones ambientales extremas (Chng., 2016). Actualmente, el género Scenedesmus está siendo explotado eficientemente para obtener bioestimulantes a partir del tratamiento de aguas residuales o de purines de cerdo (Sánchez-Zurano, 2021). Sin embargo, la presencia de celulasas y la capacidad celulolítica de este género de algas es poco conocida. En 1970 Burczyk y colaboradores (Burczyk, 1970), informaron la presencia de celulasas extracelulares en Scenedesmus obliquus. Casi en simultáneo Dvořáková-Hladká (Dvořáková-Hladká, 1971) y colaboradores informaron actividad beta-glucosidasa en S. obliquus, que le permite crecer utilizando celobiosa como sustrato. En 2012, Blifernez-Klassen y colaboradores (Blifernez-Klassen, 2012) informaron que la microalga fotoheterótrofa Chlamydomonas reinhardtii, es capaz de degradar y asimilar celulosa exógena (Gan, 2003). Este interesante hallazgo nos llevó a buscar celulasas en nuestro organismo de estudio. Las celulasas hidrolizan los enlaces β-1,4 glucosídicos del polímero de glucosa por dos vías diferentes, las endoglucanasas cortan posiciones aleatorias a lo largo de la cadena de celulosa, y las exoglucanasas actúan progresivamente sobre los extremos terminales del polímero, liberando moléculas de glucosa, o celobiosa. Finalmente, las moléculas de celobiosa producidas son convertidas en glucosa por las betaglucosidasas intra y extracelulares (EC 3.2.1.21), las celudextrinasas (EC 3.2.1.4) y las celudextrinas fosforilasas (EC 2.4.1.49), dependiendo de las características de cada especie celulolítica (Gan, 2003). Aparte de estar presentes en heterótrofos, las celulasas pertenecientes a la familia de las glicósido hidrolasas (GH9) también se han descrito en plantas superiores. Sin embargo, se ha informado que las celulasas de las plantas participan en la biosíntesis y remodelación de la celulosa más que en su degradación (Imoto, 2005). En este trabajo de tesis se describen los pasos realizados para la identificación del género y especie del organismo en estudio. Resultando un aislamiento de una Scenedesmus que corresponde a una cepa de S. quadricauda que denominamos, S. quadricauda SFE-03. Hemos puesto a punto los parámetros óptimos de crecimiento del alga para la secreción de celulasas a escala de laboratorio. Purificamos las enzimas responsables de esta actividad hidrolítica, y caracterizaremos su eficiencia y estabilidad enzimática en condiciones estándar y ante la adición de compuestos usualmente presentes en la hidrólisis industrial de la lignocelulosa. Hemos probado sustratos naturales (cascarilla de soja, rastrojo de trigo, cascara de girasol) observando actividad sobre los mismos y hemos escalado la producción hasta reactores de 10 litros. Los cultivos líquidos de la cepa nativa de S. quadricauda SFE-03, se crecieron fototróficamente en tres medios distintos: B3N, MM con alto contenido en sal y mixotróficamente en TAP o B3N, añadiendo diferentes fuentes de carbono, en ciclos de luz/oscuridad 12:12 y en oscuridad continua sin burbujeo. Para evaluar las condiciones óptimas para la secreción de celulasa, las algas se cultivaron a diferentes temperaturas (T) y pH, en placas de agar con carboximetilcelulosa (CMC) y celobiosa (CB) al 0.1 % (p/v). El mayor crecimiento de las algas se produjo a un pH igual a 7 en el medio B3N + CB a una temperatura de 24 °C. Por otro lado, al ensayar actividades hidrolíticas frente a distintos sustratos, se obtuvo una actividad mayoritaria en zimogramas y en medio líquido in vitro sobre celobiosa, sugiriendo la presencia de actividad β-glucosidasa en el sobrenadante de nuestra cepa. Se secuenció el genoma y transcriptoma de nuestra cepa nativa mediante secuenciación Illumina Novoseq en la empresa Novogen de Estados Unidos, con una cobertura de 100x y una longitud de fragmentos igual a 350pb de extremos apareados. Luego del análisis y curado de la calidad de las lecturas, realizamos el ensamblado del genoma y el transcriptoma junto con la predicción de productos génicos. Se encontraron 45540 ORF completos en la transcriptómica. Las proteínas fueron predichas con Blast2go (Götz, 2008) y realizamos búsquedas de glucosilhidrolasas de diferentes familias presentes en otros miembros del clado Viridiplantae. Se encontraron homólogos de GH1, GH5, GH9 y GH10. Hemos identificado genes de celulasas (GH1, GH5 y GH9) en la secuencia del genoma de S. quadricauda LWG002611 que no habían sido reportados a la fecha, y de S.quadricauda SFE-03. Además, hemos realizado un análisis bioinformático comparativo en varios genomas de algas Scenedesmaceae disponibles (S. obliquus EN0004 v1.0, S. obliquus UTEX B 3031, S. obliquus var. DOE0013 v1., S. sp. NREL 46B-D3 v1.0, Tetradesmus deserticola SNI-2 v1.0). La mayoría de las secuencias estudiadas presentaban una mayor similitud de secuencia con enzimas de invertebrados, hongos, bacterias y otras microalgas que con celulasas de plantas; y los datos de modelado 3D obtenidos mostraron que tanto las principales estructuras de las proteínas modeladas como los principales residuos de aminoácidos implicados en la catálisis y la unión a sustrato están bien conservados en las enzimas de S. quadricauda SFE-03. Con el propósito de caracterizar la pared de S. quadricauda SFE-03 generamos algas transgénicas de nuestra cepa nativa. Se obtuvieron dos clones de algas transformadas con el plásmido pChlamy_3 (Invitrogen) al que se le clonó la secuencia de direccionamiento a pared de una GP2 de C. reinhardtii (Accession Number CAJ98661.1fusionada a la secuencia de uno de los dominios de unión a almidón de la SSIII del mismo alga, SBD3 (Accession Number DQ019314) y luego de su caracterización morfológica mediante tinciones, microscopía confocal y microscopía electrónica de barrido, se ensayó el contenido de pectinas solubles. Las algas transgénicas obtenidas presentan un tamaño celular mayor que las de tipo salvaje y su relación superficie-volumen se ve afectada; este mayor tamaño favorece su floculación. Además, poseen alterados los componentes de la pared celular, en concreto la capa de pectina, que aumenta la unión entre células formando un conglomerado. Observamos una mayor laxitud de la pared celular y un aumento de aproximadamente tres veces la cantidad de pectinas, hecho que concuerda con el fenotipo obtenido en las plantas transgénicas. El estudio del crecimiento en fotobiorreactores es clave para aumentar la productividad en las microalgas. A finales del año 2021, resulté beneficiada con una beca de investigación con perspectiva de género nacional e internacional de la provincia de Santa Fe, para viajar a Almería España a la mayor planta de producción de biomasa algal en Europa con proyectos financiados por la Unión Europea. La estadía, para completar mi trabajo de tesis doctoral, amplió mi conocimiento en este campo, aún no explotado en Argentina, adquirí los conocimientos necesarios para el manejo y puesta a punto de cultivos a gran escala de microalgas y el manejo de fotobiorreactores, cosechadoras y concentradores industriales. Este trabajo presenta la optimización de un medio de cultivo económico (considerando volúmenes de hasta 12 000 litros) para el crecimiento de Tetraselmis chuii (una cepa recientemente aprobada para consumo humano) considerando una intensidad de luz e inyección de CO2 específicas. Además, para esta alga y Spirulina platensis (Artrospira) y Chlorella vulgaris se estudió la eficiencia fotosintética, a irradiancia fija y variable, así como las cantidades de proteínas, carbohidratos, lípidos y clorofilas en diferentes días de cultivo a escala de laboratorio. El análisis de la eficiencia del transporte de electrones de las tres cepas nos permitió concluir que T. chuii es una buena cepa para el cultivo externo en fotobiorreactores abiertos y además, los rendimientos cuánticos fueron similares a los de C. vulgaris, cepa actualmente utilizada en los mercados actuales. Además, se espera que el rendimiento proteico de esta cepa sea similar al de S. platensis, lo que podría ser de interés, tanto para consumo humano como acuícola o para la obtención de aminoácidos para producir biofertilizantes. Además, como parte de dos experimentos que se estaban llevando a cabo en Almería, se pudo demostrar un gran porcentaje de remoción de la materia orgánica, fosfatos y nitratos presentes en los purines de cerdo, por parte de la cepa de S. almeriensis. Por otro lado, en la puesta a punto del tratamiento de aguas residuales, se demostró un buen crecimiento algal en los reactores raceway de volúmenes de hasta 12000 litros con ese medio de cultivo. En dichos procesos operé los reactores de capa fina de 500 litros de cultivo y raceway, de 12 000 litros totales, realizando las medidas de viabilidad y cantidad de nutrientes de cada uno. En nuestro instituto, se pusieron en marcha dos biorreactores de diseño propio, tipo columnas de 10 y 50 litros, con inyección de CO2, y seguimiento de temperatura, oxígeno disuelto, poder redox y pH por un sistema de arduino programado en CEFOBI.
Embargo
Biosurfactantes obtenidos a partir de especies de Pseudomonas syringae: producción, caracterización y exploración de sus propiedades fisicoquímicas
(2023) Haidar, Carla Nahir; Pellegrini Malpiedi, Luciana; Nerli, Bibiana Beatriz
Encontrar nuevos compuestos naturales biocompatibles con actividad interfacial/superficial adecuada y baja toxicidad sigue representando un gran desafío en la actualidad para la comunidad científica. En este contexto, este trabajo de tesis doctoral se focalizó en el estudio de la producción de biosurfactantes a partir de bacterias pertenecientes a la especie Pseudomonas syringae. Inicialmente, se realizó un análisis comparativo sobre la producción de biosurfactantes a partir de tres patovares de la especie mencionada: P. syringae pv tabaci, P. syringae pv tomato DC 3000 y P. syringae pv syringae. El mejor desempeño se observó para P. syringae pv tabaci, con productividad de 1,3 g/L y productividad específica de 0,8 g/g; valores significativamente superiores a los alcanzados por las otras cepas. Los análisis preliminares de caracterización química sugirieron la secreción de lipopéptidos para todas las P. syringae. Los extractos obtenidos demostraron una excelente actividad emulsionante y estabilidad frente a distintos compuestos hidrocarbonados. Además, no mostraron efecto citotóxico a dosis inferiores a 10,00 g/L contra la línea celular normal de riñón humano HEK-293, pero sí tuvieron una citotoxicidad diferencial contra líneas celulares tumorales humanas de melanoma SK MEL-28 y carcinoma de mama MDA MB231. En base a estos resultados, se seleccionó a P. syringae pv tabaci como microorganismo productor para ulteriores estudios. Posteriormente, se evaluaron diferentes fuentes de carbono hidrofílicas en el medio de cultivo de P. syringae pv tabaci. De todas ellas, el glicerol resultó ser el más adecuado para la producción de biosurfactantes, siendo seleccionado para ensayar su combinación con una fuente de carbono hidrofóbica: aceite residual de cocina, un producto de desecho altamente contaminante. Se demostró que la inclusión de este residuo indujo a una mayor síntesis de biosurfactantes, incrementando la productividad de 1,5 a 2,7 g/L. Además, el extracto de biosurfactantes a una dosis de 1,00 g/L resultó altamente compatible con las líneas celulares humanas ensayadas previamente, indicando que a las concentraciones de trabajo no es tóxico y, por ende, es adecuado para aplicaciones alimentarias y farmacéuticas. Una identificación más precisa y rigurosa de las moléculas tensoactivas presentes en los medios seleccionados (conteniendo solo glicerol o la combinación glicerol/aceite), fue realizada mediante espectrometría de masas. Se detectaron varios compuestos, entre ellos tres lipopéptidos cíclicos: siringomicina E, artrofactinas y siringopeptina 22-PhvB. Al comparar los compuestos presentes en cada medio, se observó que la inclusión del aceite residual en el medio de cultivo afectó levemente la biosíntesis de los mismos. A posteriori, se realizó una caracterización fisicoquímica de los extractos, focalizando los análisis en las propiedades de actividad superficial y emulsificante. Ambos extractos mostraron una actividad superficial similar, logrando una concentración micelar crítica cercana a los 900 mg/L. Adicionalmente, los mismos fueron capaces de emulsionar una amplia gama de compuestos hidrocarbonados a concentraciones relativamente bajas (0,10 a 1,00 mg/L). Por último, se observó que, para ambos extractos, variaciones en las condiciones experimentales de temperatura, salinidad y pH no afectaron sus propiedades fisicoquímicas. Inclusive, bajo algunas condiciones mejoraron notablemente sus desempeños, denotando un gran potencial para ser utilizados en varias aplicaciones a nivel industrial. Finalmente, se estudió el escalado de los procesos fermentativos mediante el empleo de dos reactores con geometrías diferentes, acoplados a una columna de fraccionamiento de espuma. Los resultados obtenidos demostraron la factibilidad de utilizar este método para integrar la producción y extracción de los biosurfactantes. Estos estudios permitieron concluir que P. syringae pv tabaci resultó ser un microorganismo productor de extractos de biosurfactantes con prometedoras propiedades fisicoquímicas, baja toxicidad y elevada estabilidad. Asimismo, se demostró la factibilidad de escalar el proceso productivo utilizando biorreactores acoplados a una columna de fraccionamiento de espumas.
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Bioquímica de frutos cítricos y arándanos. Estudio del rol del metabolismo relacionado con el mantenimiento de la calidad durante el período de poscosecha
(2023) Morales, Luisina Lourdes; Tripodi, Karina E. J.; Margarit, Ezequiel
La FAO (Food and Agriculture Organization) define “poscosecha” como el momento en el que el producto comestible es separado de la planta por el hombre con la intención de prepararlo para ser utilizado en el consumo, y finaliza cuando este alimento entra en posesión del consumidor final. Es justamente en este período en donde los frutos frescos son susceptibles de ser atacados por patógenos saprófitos o parásitos, debido a su alto contenido en agua y nutrientes, y porque han perdido la mayor parte de la resistencia intrínseca que los protege durante su desarrollo en el árbol. Además durante esta etapa comienza un proceso de decaimiento de la calidad de la fruta producto de posibles daños físicos, la deshidratación y la maduración que estará influenciada por la bioquímica, que determina su composición, firmeza y aspecto. Las pérdidas económicas ocasionadas por los problemas durante la poscosecha representan actualmente uno de los principales inconvenientes de la frutihorticultura mundial. El desarrollo de tecnologías más adecuadas para mitigar todos estos efectos y conservar el mantenimiento de la calidad de las frutas, es motivo de numerosas investigaciones. La presente tesis se basó en el estudio de la bioquímica y la fisiología de frutos cítricos (mandarina y naranja) y de una baya (arándano) en respuesta a diferentes tratamientos en la cosecha y la poscosecha. En el caso de los cítricos, se analizó un tratamiento térmico con agua caliente en dos variedades de gran interés comercial: Murcott y W-Murcott. Este tratamiento constituye una alternativa a los métodos físicos utilizados en el control de podredumbres, cuyas consecuencias en la calidad de estos frutos no ha sido explorada en profundidad. Por lo tanto, una de las metas fue analizar la incidencia de dicho tratamiento en la calidad de los frutos y sus cambios bioquímicos, evaluando la pertinencia de su aplicación. En estas mismas variedades de mandarinas y en naranjas Lane Late, se estudiaron las consecuencias de un tratamiento cuarentenario. Este tratamiento es un requisito de exportación para ciertos destinos, dada la necesidad de combatir a la mosca de la fruta. En el caso de las mandarinas, se realizó un análisis de parámetros de calidad y metabolómico, mientras que para las naranjas, además de la calidad físico-química, se estudió la calidad organoléptica percibida por consumidores. Finalmente, se investigaron las repercusiones de la utilización de mallas antigranizo en la calidad, la bioquímica y la actividad de enzimas del metabolismo de la pared celular, en arándanos de dos variedades comerciales: Snowchaser y Emerald.
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Efecto de exosomas secretados por células madre en procesos de reparación y diferenciación celular
(2023) Delgado Ocaña, Susana; Banchio, Claudia; Menacho Márquez, Mauricio
Las células madre neurales (NSCs) son células multipotentes que tienen la capacidad de autorrenovarse y de generar los tipos celulares que componen el sistema nervioso (SN). Debido a ello, estas células son esenciales para la generación del SN durante el desarrollo, y para su regeneración ante afecciones o condiciones de daño. Sin embargo, esta capacidad regenerativa es limitada debido a que la presencia de factores inflamatorios y un microambiente oxidativo afectan la supervivencia de las NSCs y la regeneración neuronal. El secretoma de las NSCs contiene los principales factores bioactivos que contribuirían a la regeneración, siendo los exosomas uno de los componentes fundamentales. Los exosomas son pequeñas vesículas extracelulares de origen endosomal que están constituidos por lípidos, proteínas y ácidos nucleicos. Participan en la comunicación entre las células del SN y tienen la capacidad de modificar la fisiología de las células aceptoras. En este trabajo de Tesis demostramos que los exosomas derivados de células madre neurales (NSC-Exo) regulan la proliferación y la diferenciación de las NSCs en condiciones que mimetizan un ambiente fisiológico, y en condiciones de daño como el estrés oxidativo e inflamatorio. Se estableció un protocolo para la purificación de NSC-Exo de calidad y pureza, y se demostró que las NSCs en cultivo captan dichos exosomas. Demostramos que en condiciones que mimetizan un ambiente fisiológico, los NSC-Exo inducen la proliferación de las NSCs, la diferenciación hacia el linaje neuronal y el desarrollo de parámetros morfológicos y funcionales asociados a la función neuronal. Evidenciamos que este efecto inductor de la diferenciación neuronal puede deberse a que los NSC-Exo aumentan la sobrevida y la proliferación de los progenitores neuronales. Desde el punto de vista terapéutico resulta importante evaluar si este efecto inductor de la proliferación y diferenciación neuronal se mantiene en ambientes reactivos de daño nervioso. Por este motivo, se estudió el efecto de los NSCExo en condiciones de estrés oxidativo e inflamatorio. Para ello establecimos dos modelos in vitro mediante la suplementación con peróxido de hidrógeno o medio de macrófagos activados con lipopolisacárido, para generar estrés oxidativo e inflamatorio, respectivamente. Demostramos que los NSC-Exo restauran la proliferación de las NSCs afectada por el daño oxidativo, aumentando la sobrevida y disminuyendo la generación de especies reactivas del oxígeno (ROS). Se comprobó que ambas condiciones de estrés inducen la diferenciación neuronal hacia un fenotipo aberrante morfológica y funcionalmente, y que el tratamiento con NSC-Exo favorece la recuperación de los parámetros afectados. Para comenzar con la caracterización de los NSC-Exo, realizamos un estudio proteómico e identificamos que los mismos portan numerosas proteínas con funciones relacionadas a la proliferación de la NSCs, y a la diferenciación neuronal. En conjunto, los resultados presentados en este trabajo de Tesis contribuyen a entender el rol fisiológico de los NSC-Exo en la proliferación y diferenciación de las NSCs, y aportan conocimiento científico para el desarrollo de estrategias terapéuticas para la regeneración del tejido nervioso
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Bases moleculares de la patogenicidad de Ralstonia Solanacearum: búsqueda de factores de virulencia asociados a la colonización y adaptación de la bacteria en el hospedador
(2023) Vandecaveye, Agustina; Orellano, Elena G.; Tondo, María Laura
Ralstonia solanacearum (Rso) es un patógeno saprófito que pertenece a las βproteobacterias y causa la enfermedad del marchitamiento bacteriano en más de 200 especies de plantas en todo el mundo. Esta enfermedad es considerada la más destructiva en plantas debido a su agresividad, amplia distribución geográfica y rango de hospedadores. En este estudio, se investigaron los mecanismos de glicosilación de proteínas de la superficie celular de Rso y su relación su relación con los mecanismos de patogenicidad en plantas hospedadoras, así como su influencia en la respuesta de defensa en plantas no hospedadoras. También se analizó la respuesta de Rso al estrés oxidativo, centrándose en el papel de las enzimas catalasas en los mecanismos de patogenicidad de Rso. Los flagelos desempeñan un papel importante en la virulencia de las bacterias patógenas y la glicosilación de los mismos puede afectar significativamente la motilidad bacteriana y la capacidad de causar infecciones. En este estudio, se han identificado distintos tipos de oligosacáridos en la flagelina de Rso GMI1000, evidenciando tanto N- como Oglicosilación. Asimismo, se han identificado genes codificantes para putativas glicosiltransferasas, Rsp0387 y Rsp0388, en cercanía a los genes del aparato flagelar, y se han generado cepas mutantes en dichos genes. Los resultados obtenidos indican una relación entre la glicosilación de la flagelina, la motilidad tipo swimming y la autoaglutinación de Rso GMI1000. Por otro lado, se investigaron las enzimas catalasas presentes en la bacteria Rso y se identificó que el gen Rsp1581 codifica una catalasa de tipo monofuncional denominada KatE, mientras que los genes Rsc0775/Rsc0776 codifican una enzima catalasaperoxidasa conocida como KatG. Se determinó que la actividad catalasa en Rso está regulada en función del crecimiento bacteriano. Además, se demostró que KatE es la principal responsable de la actividad catalasa en Rso bajo condiciones normales de crecimiento y se demostró que dicha enzima se encuentra regulada principalmente a nivel transcripcional por HrpG, un regulador central de Rso inducido por contacto con las células vegetales. También se reveló que las actividades catalasa KatE y KatG se inducen con el tratamiento con peróxido de hidrógeno, y que tienen un efecto importante en la supervivencia bacteriana en condiciones de estrés oxidativo. Mediante la construcción de la cepa mutante de Rso en el gen katE, se pudo demostrar que esta enzima desempeña un papel importante en la protección de Rso contra el estrés oxidativo. Por otro lado, se encontró que KatG parece tener un papel menor en la respuesta adaptativa de la bacteria. Además, se reveló que la disrupción del gen katE no tiene efecto sobre la virulencia o crecimiento bacteriano en los tejidos de su planta hospedante, lo que sugiere un papel menor de KatE en la aptitud bacteriana en la planta. Sin embargo, se observaron cambios en la estructura del biofilm producido en superficies abióticas, aunque la cantidad total de producción de biofilms no se vio afectada. Tanto KatE como KatG se inducen de manera similar en respuesta al estrés oxidativo. Sin embargo, mediante la construcción de la cepa mutante de Rso en el gen katG y ensayos de exposición a H2O2 en medio sólido se sugiere que KatG podría tener un papel más destacado en la desintoxicación del H2O2 exógeno, lo que conllevaría a una mayor resistencia celular contra este compuesto, posiblemente mediante un mecanismo independiente de su función catalasa. En general, este trabajo proporciona una importante caracterización de las enzimas detoxificantes de EROs de Rso y su papel en la supervivencia bacteriana y la infección de las plantas.
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Mecanismos de fijación de carbono en gramíneas C4: Determinantes moleculares implicados en la regulación de la decarboxilación del malato en especies del clado Panicoideae pertenecientes a diferentes subtipos C4
(2023) Calace, Paula; Saigo, Mariana; Gerrard Wheeler, Mariel Claudia
La comprensión del funcionamiento de la fotosíntesis C4 es de vital importancia debido al impacto del cambio climático y la necesidad de mejorar la eficiencia de captura de carbono en las plantas. En el marco de este estudio de tesis, se investigaron dos especies estrechamente relacionadas, Setaria viridis, Setaria italica, Panicum virgatum, las cuales pertenecen a subtipos diferentes de fotosíntesis C4, denominados EM-NAD y EM-NADP. Con el objetivo de comprender mejor la función de las isoformas EM-NAD y EMNADP en la fotosíntesis C4, se realizó un análisis integrativo donde se combinaron estudios cinéticos y regulatorios con proteómica en ambas especies. Se llevó a cabo una comparación de los proteomas de los compartimentos M y VV (células del mesófilo y de vaina vascular, respectivamente) tanto en S. viridis como en P. virgatum, y se relacionaron estos datos con información de transcriptómica de estas especies y otras especies cercanas ampliamente estudiadas, como el maíz. Tanto en S. viridis como en P. virgatum, se encontró evidencia de la participación combinada de ambas enzimas descarboxilasas en el proceso de la fotosíntesis C4. Este hallazgo es de gran relevancia para comprender y optimizar el metabolismo, y plantea la necesidad de investigar más a fondo las condiciones en las que estas vías coexisten en ambas plantas. En resumen, este trabajo de tesis resalta la importancia de estudiar la fotosíntesis C4 en el contexto del cambio climático, centrándose en la relación entre las especies S. viridis y P. virgatum que, a pesar de ser estrechamente relacionadas, pertenecen a subtipos diferentes de fotosíntesis C4 (EM-NADP y EM-NAD). Los hallazgos obtenidos proporcionan información valiosa sobre el metabolismo C4 y abren nuevas perspectivas de investigación en este campo.
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Modulación de los niveles endógenos de bilirrubina como estrategia terapéutica en la colestasis inducida por estrés oxidativo
(2023) Martín, Pamela L.; Basiglio, Cecilia Lorena; Roma, Marcelo Gabriel
La colestasis es una reducción del flujo biliar que produce acumulación de sales biliares y otros compuestos tóxicos, produciendo injuria hepatocelular, fibrosis y, eventualmente, cirrosis. El estrés oxidativo (EO) es un evento altamente frecuente en las enfermedades colestásicas, donde se generan especies reactivas del oxígeno como consecuencia del daño mitocondrial ocasionado por las sales biliares acumuladas. La bilirrubina (BR), producto final del catabolismo del grupo hemo, contribuye en gran medida a las defensas del organismo y nuestro grupo de trabajo ha demostrado que BR es clave en la preservación de la función hepatobiliar durante la injuria colestásica oxidativa in vitro. Se planteó como objetivo general de esta Tesis evaluar el efecto de la modulación de los niveles endógenos de BR sobre la injuria colestásica oxidativa in vivo en la rata, respondiendo a la hipótesis que postula que las patologías colestásicas tendrían más severas manifestaciones en términos de función hepatobiliar en ausencia de BR. Primero, se evaluó el impacto de la modulación de los niveles hepatocelulares de BR mediante inducción de la enzima hemoxigenasa-1 sobre la colestasis aguda inducida por EO. Aquellos animales sometidos a la injuria oxidativa mostraron niveles más elevados en todos los marcadores de EO ensayados en comparación con el grupo control, mientras que, en animales pretratados con el inductor de hemoxigenasa-1 se obtuvieron valores similares a los controles. Además, la alteración en la función secretora biliar y la internalización de los principales transportadores hepatocanaliculares inducidas por EO fue prevenida por el pretratamiento con el inductor. Para indagar en qué proporción la fracción conjugada de BR ejerce protección en la colestasis inducida por EO, se inhibió específicamente la conjugación de BR, y se encontró que esto no altera la eficiente protección conferida por el pigmento frente al desafío oxidativo. Buscando extrapolar nuestros hallazgos a un contexto más cercano a la fisiopatología humana, se evaluó el papel de la BR en un modelo de injuria hepática oxidativa e inflamatoria sostenida en el tiempo. Los animales se sometieron a ligadura del conducto biliar común y se evaluó el efecto de la inhibición de la generación endógena de BR sobre el establecimiento y la progresión de la injuria hepática, utilizando un inhibidor competitivo de hemoxigenasa-1. Mediante el estudio anatomopatológico de cortes de tejido hepático, se constató el establecimiento de la injuria obstructiva, siendo esta más evidente en el grupo que había recibido, además, el pretratamiento con el inhibidor de hemoxigenasa-1, indicando que la inhibición de la generación endógena de nueva BR agrava la lesión hepática obstructiva. En concordancia, se encontraron niveles de marcadores de EO más elevados en los animales en los que se había inhibido hemoxigenasa-1, demostrando que, en condiciones colestásicas, el daño oxidativo es mayor cuando la producción endógena de BR se ve impedida. Por lo expuesto, concluimos que la modulación de los niveles endógenos de BR impacta en el efecto citoprotector que ejerce el pigmento en situaciones de colestasis de corta y larga duración en el animal entero. Estos hallazgos podrían ser, a futuro, extrapolados a una modulación controlada de los niveles de BR como estrategia terapéutica en colestasis.
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Rol de los microARNs durante el desarrollo embrionario de los vertebrados
(2023) Steeman, Tomás José; Calcaterra, Nora B.
El desarrollo embrionario es un proceso altamente complejo y finamente regulado, gobernado por una detallada red de regulación génica (RRG) donde intervienen un gran número de elementos regulatorios como, por ejemplo, los miARNs. Estas moléculas de ARN de aproximadamente 22 nucleótidos de simple cadena, endógenos y no codificantes actúan a nivel de estabilidad de ARNm y de regulación traduccional. Si bien se han descripto numerosos miARNs involucrados en el desarrollo embrionario, aún queda por elucidar los mecanismos que controlan la expresión de estos miARNs. En este trabajo de Tesis se estudió el rol regulatorio de los Cuádruplex de Guanina (G4s), unas estructuras secundarias no-canónicas de los ácidos nucleicos formadas en secuencias ricas en guanina, sobre la biogénesis de miARNs. Para esto, se utilizó como caso de estudio el miR-150, el cual contiene una secuencia putativa de formación de G4 (pG4) en su precursor. Mediante distintas técnicas biofísicas se demostró la formación de un G4 de elevada estabilidad en una sonda de ARN con la secuencia del pG4. Por inhibición de la formación del G4 o mediante su estabilización, se observó in vivo en embriones de pez cebra el efecto inhibitorio del G4 sobre la biogénesis del miR-150, con el consecuente efecto sobre un gen blanco regulatorio del miARN, el protooncogén myb, y sobre el desarrollo embrionario. De esta forma se demostró que los G4s presentes en pre-miARNs puede funcionar como un interruptor estructural en la biogénesis de miARNs. La cresta neural (CN) es una estructura transitoria que se forma durante el desarrollo embrionario y da lugar a un gran número de derivados del organismo adulto. Las células de la CN (CCN) sufren una serie de eventos compartidos con las células que se desarrollan en tumores, como la delaminación, migración e invasión. Es por lo tanto de especial interés el estudio de los mecanismos que regulan estos procesos. Se han identificado miARNs que participan en la tumorigénesis o en el desarrollo de la CN, pero poco se sabe sobre la vinculación entre ambos. Con dos enfoques distintos (partiendo de miARNs que puedan regular genes de la RRG de la CN, o de miARNs que estén sobrerrepresentados en CN) se seleccionaron tres miARNs involucrados en la tumorigénesis para caracterizar su rol en el desarrollo embrionario de Danio rerio. Mediante experimentos de pérdida o ganancia de función en embriones de pez cebra, se observó que los miR-145, miR-133a y miR-338-3p son capaces de regular la diferenciación de melanóforos, iridóforos, condrocitos, la apoptosis y la proliferación celular, así como la expresión de distintos genes de la RRG de la CN. Este trabajo revela el rol regulatorio transcripcional que cumplen miARNs evolutivamente conservados durante el desarrollo de la CN, uno de los procesos más estrictamente regulados de la biología de los vertebrados. Adicionalmente, se suman evidencias acerca del mecanismo de acción de los G4 capaces de interferir con el procesamiento de pre-miARNs, introduciendo nuevos puntos regulatorios dentro de la RRG del desarrollo embrionario y reafirmando la importancia biológica de estas estructuras de los ácidos nucleicos.
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Estudio de la capacidad antitumoral de triazolilpeptidil penicilinas y estructuras relacionadas
(2023) Martiren, Nadia Lorena; Mata, Ernesto Gabino; Cornier, Patricia Griselda
Las triazolilpeptidil penicilinas son una serie de híbridos moleculares sintetizados en fase sólida a partir de la unión de un derivado de penicilina con diferentes péptidos, que mostraron tener una destacada actividad antitumoral y una marcada selectividad. Inspirados en estas estructuras privilegiadas, diseñamos una serie de estrategias con el fin de obtener análogos que nos brinden información acerca de los requerimientos estructurales necesarios para la actividad biológica. El primer enfoque general fue evaluar el impacto en la actividad biológica al sustituir los péptidos por los bioisósteros α-peptoides. Otro planteamiento fue la sustitución del resto triazol con un monómero de glicina, para evaluar el efecto de este heterociclo sobre la actividad biológica. Además, buscamos generar una nueva estrategia para obtener el grupo triazol, con el fin de simplificar la ruta de síntesis. Para lograr esto, sintetizamos una serie de análogos con triazoles “inversos”, donde se cambió la disposición de los sustituyentes del triazol. Por último, se ideó una metodología, denominada “mixta”, donde se unió un monómero de peptoide con un aminoácido, con el fin de evaluar la importancia de contar con dadores de puente de hidrógeno para mejorar la actividad biológica. Los compuestos deseados se prepararon empleando principalmente un enfoque de síntesis en fase sólida, obteniéndose muy bueno resultados. Los análogos fueron evaluados para determinar el efecto citotóxico frente a la línea celular B16-F0 y se comparó con los efectos sobre células de glándula mamaria murina normales (NMuMG). Al comprarar los resultados de los análogos sintetizados, pudimos determinar una serie de criterios sobre las estructuras más activas: determinamos que los ésteres metílicos son más activos que sus contrapartes con amidas primarias; el cambio en la distribución de los sustituyentes del triazol no afecta la actividad, al comparar triazoles con sus análogos “inversos”; la presencia de dadores de puentes de hidrógeno mejoró la actividad, al comparar con los triazoles “mixtos”; interesantemente, los derivados unidos con glicina son los que mejores resultados brindaron. Por otro lado, en la búsqueda de nuevas estrategias de unión para la posible generación de híbridos moleculares, nos interesó aplicar una perspectiva medioambiental y nos propusimos explorar la implementación de solventes eco-amigables en reacciones en fase sólida, tomando como objetivo primario los acoplamientos cruzados catalizados por metales de transición. Este tipo de reacciones son ampliamente empleadas para la generación de enlaces C-C y, en particular, en la formación de estructuras de interés, como los biarilos. Para llevar a cabo esta investigación se tuvieron en cuenta resultados anteriores sobre la síntesis de biarilos en fase sólida bajo las condiciones de Hiyama, donde los solventes usualmente empleados son el tetrahidrofurano y el dimetilformamida. Se seleccionaron los solventes γ-valerolactona y dimetilcarbonato y se emplearon tanto en el paso de acoplamiento cruzado como en el de unión de los ácidos carboxílicos a la resina, obteniéndose resultados comparables a los publicados. De esta manera estamos postulando una alternativa medioambientalmente más amigable para la generación de enlaces C-C que abre un nuevo abanico de posibilidades dentro de las metodologías de síntesis en fase sólida.
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Participación de AKAP350 en la sinapsis inmune en células Natural Killer
(2022) Pariani, Alejandro Pedro; Larocca, María Cecilia
Las células Natural Killer (NK) son células efectoras del sistema inmune innato que poseen la capacidad de eliminar células infectadas con virus y células tumorales. La citotoxicidad de las células NK requiere una remodelación extensa del citoesqueleto y una reorganización de los receptores de membrana en la sinapsis inmune (SI) establecida entre las células NK y las células blanco. Uno de estos receptores es la integrina αLβ2 (CD11a/CD18) o Leucocyte function associated antigen (LFA)-1, la cual es esencial para la formación y maduración de la SI. Al unirse a su ligando ICAM-1, LFA-1 no sólo actúa como una molécula de adhesión que permite una unión más fuerte con la célula blanco, sino que también transmite señales tempranas que promueven la activación de la célula NK. Los mecanismos por los cuales LFA-1 se acumula y organiza en el sitio de sinapsis en estas células no han sido totalmente clarificados hasta el momento. AKAP350 es una proteína de anclaje de proteína-quinasa A que nuclea complejos proteicos en el centrosoma y en el aparato de Golgi (AG). AKAP350 está implicada en procesos de generación de asimetría celular, a través de su capacidad de facilitar la transmisión de señales, como así también a través de su rol en la regulación de la dinámica de los microtúbulos. Respecto a su función en los linfocitos, la proteína AKAP350 es necesaria para la activación de LFA-1 en células T, asociada tanto a procesos de migración, como a la activación por reconocimiento de un antígeno. Los mecanismos involucrados aún no fueron determinados. En esta Tesis se analizó la participación de AKAP350 en los mecanismos involucrados en la actividad citotóxica y formación de la SI citolítica en células Natural Killer. Para esto utilizamos un sistema lentiviral de expresión de shRNA específicos para disminuir la expresión de AKAP350 (AKAP350KD) en una línea celular derivada de NK humanas, YTS, y en células NK aisladas de sangre periférica humana. Nuestros resultados mostraron que la disminución de la expresión de AKAP350 inhibió la capacidad efectora lítica de las células YTS. Esto se correlacionó con una alteración en la polarización del centrosoma y los gránulos líticos al sitio de sinapsis, y con un descenso en la acumulación de LFA-1 en la SI en células AKAP350KD, tanto al ser activadas por una célula blanco, como al ser activadas selectivamente a través de LFA-1. En experimentos realizados en células YTS y en cultivos ex vivo de células NK, se observó la presencia de un pool intracelular de vesículas que contienen LFA-1, asociadas parcialmente al AG, que polarizó hacía la SI mediante un mecanismo dependiente de AKAP350. Nuestros resultados demostraron que, así como sucede en células no inmunes, AKAP350 participa en la nucleación de microtúbulos en el AG. La disrupción del AG o la alteración de la dinámica de microtúbulos afectó la organización de LFA-1 en la SI. Este efecto también se observó cuando AKAP350 fue desplazada del AG en células YTS. Por lo tanto, el presente trabajo caracteriza la participación de AKAP350 en la actividad citotóxica de las células NK y revela un nuevo mecanismo mediante el cual el AG y, específicamente, la AKAP350 asociada al mismo, facilita el tráfico intracelular de LFA-1, el cual es de suma relevancia para la organización de LFA-1 en el sitio de sinapsis.
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Determinación del mecanismo de acción de los endocannabinoides en Caenorhabditis elegans
(2023) Hernández Cravero, Bruno; De Mendoza, Diego; Binolfi, Andrés
El colesterol es un lípido esencial constituyente de las membranas de las células eucariotas. Su función principal es estructural pero también lleva a cabo funciones como molécula de señalización. Por ello, la regulación del metabolismo colesterol es crucial para el normal funcionamiento de las células. En el nematodo Caernohabditis elegans (C. elegans), existe un grupo de hormonas esteroideas derivadas del colesterol denominadas ácidos dafacrónicos (ADs). Dichas hormonas son esenciales para la regulación del desarrollo. En los últimos años, se ha propuesto que un conjunto de lípidos denominados N-aciletanolaminas (NAEs), antagonizan la detención del desarrollo de los nematodos [1]. Más recientemente, nuestro grupo de laboratorio demostró que otra clase de lípidos, los endocannabinoides (eCBs), regulan el ciclo de vida de C. elegans mediante la promoción de la movilización de colesterol [2]. Sin embargo, el mecanismo y las vías de señalización activadas por los eCBs para movilizar colesterol no son conocidas. Adicionalmente, numerosos trabajos sugieren un rol directo de los ácidos grasos poliinsaturados (PUFAs) en el desarrollo de enfermedades neurodegenerativas [3] y cardiovasculares [4], sugiriendo que algunos ácidos grasos (AGs) regulan el desarrollo de diversas enfermedades. A pesar de que se ha avanzado mucho en el entendimiento del rol que juegan los lípidos para el mantenimiento de la homeostasis celular, su funcionalidad como moléculas de señalización esta superficialmente estudiada. Por este motivo, en este trabajo de tesis tratamos de elucidar como los eCBs actúan como moléculas de señalización promoviendo el transporte del colesterol en C. elegans. Pudimos identificar diferentes proteínas involucradas en la vía de señalización activada por 2-O-araquidonoil glicerol (2-AG), eCB derivado de ácido araquidónico (20:4 ω-6) [5], que estimula el transporte de colesterol. Nuestros experimentos sugieren que el 2-AG estimula la movilización de colesterol por un mecanismo dependiente de los receptores del tipo TRPV (de sus siglas en inglés: Transient Receptor Potential Vainoillid), la liberación de vesículas de núcleo denso como también de la vía de señalización de la insulina Por otra parte, desarrollamos metodologías de Resonancia Magnética Nuclear (RMN) como metodología para el estudio del metabolismo de AGs in vivo en C. elegans. Este procedimiento nos permitió estudiar cómo se modifican los AGs y otros metabolitos en diferentes cepas mutantes y así identificar nuevos componentes involucrados en la vía de señalización desencadenada por el ortólogo a los receptores de adiponectina (AdipoR1 y AdipoR2), PAQR-2, en condiciones de baja temperatura [6–8]. Estos descubrimientos demuestran, por un lado, de forma precisa que vías de señalización son activadas por 2-AG en la regulación del tráfico de colesterol y, por el otro, aportan, claridad para el estudio del rol de los AGs como moléculas de señalización.
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Variantes genéticas en secuencias formadoras de cuádruplex de guanina: consecuencias sobre la expresión de genes asociados a patologías humanas
(2023) Piga, Ernesto José; Armas, Pablo
Los cuádruplex de guanina (G4) son estructuras no canónicas de los ácidos nucleicos formadas por secuencias simple hebra ricas en guanina. Han sido descriptos como reguladores de múltiples procesos celulares del metabolismo de los ácidos nucleicos entre los que se destaca la transcripción génica. En particular, existe gran cantidad de evidencia sobre la regulación de genes asociados al desarrollo de patologías humanas mediada por G4, principalmente de proto-oncogenes. Hasta el inicio de este trabajo de Tesis, eran escasas las evidencias acerca de la existencia de las variantes genéticas presentes en las secuencias con capacidad de formar G4 (sG4), y el efecto que las mismas generaban sobre los G4. Por este motivo decidimos investigar si las SNV (de las siglas del término en inglés single nucleotide variants) presentes en los G4 podrían contribuir a la expresión génica diferencial entre individuos que pueda conducir a la predisposición o al desarrollo de fenotipos patológicos. Para esto se realizó una búsqueda y selección bioinformática de SNV en secuencias formadoras de G4 (SNV-sG4) localizadas en regiones reguladoras de la transcripción de genes asociados con patologías humanas. Realizamos una búsqueda bibliográfica orientada en dos ejes. El primero fue buscar SNV-sG4 asociadas a variaciones transcripcionales reportadas en la literatura, y el segundo eje se enfocó en la búsqueda de sG4 en regiones promotoras proximales y con funciones en la regulación de la transcripción de proto-oncogenes reportados en la bibliografía y la posterior identificación de SNV presentes en esas sG4. Los resultados de la búsqueda rindieron 14 genes con 88 SNV-sG4 presentes en ellos. Luego se analizaron las secuencias de las sG4 utilizando predictores bioinformáticos de G4 para comparar y seleccionar 43 SNV-sG4 de 14 genes que podrían generar mayores cambios en la capacidad de formación de G4. Para caracterizar el efecto de las SNV-sG4 seleccionados en la formación y/o estabilidad de los G4 realizamos diversas técnicas bioquímicas y espectroscópicas in vitro, utilizando oligonucleótidos sintéticos. Esto nos permitió restringir la selección a 12 SNV-sG4 de 4 genes, que fueron los que evidenciaron cambios significativos en la formación y estabilidad del G4. Por último, evaluamos las consecuencias de las SNV-sG4 que afecten la formación y/o estabilidad de los G4 sobre la expresión génica transcripcional en el contexto celular. Para ello se clonaron las sG4 en un sistema de gen reportero, corriente arriba del promotor básico (SV40) que regula el gen que codifica a la luciferasa de luciérnaga en el plasmídico pGL3- Promoter Vector (pGL3-PV, Promega). Estas construcciones fueron transfectadas en la línea celular humana Human Embrionic Kidney o HEK-293 y se evaluaron los niveles de actividad luciferasa a las 48 horas luego de la transfección. Pudimos observar variaciones significativas en los niveles de actividad del reportero regulado por el promotor SV40 en presencia de las SNV en comparación con las sG4. También, utilizando la regulación transcripcional del proto-oncogen c-MYC mediada por G4 como modelo de estudio, se analizó el efecto de las SNV-sG4 en el contexto del promotor mediante el clonado de un fragmento 850 pb (pares de bases), (-337/+513 respecto del sitio de inicio de la transcripción o TSS) del promotor del gen, el cual contiene a la sG4, y la generación de las SNV-sG4 en estudio para esa sG4. Las construcciones fueron transfectadas en HEK293 evaluando los niveles de actividad luciferasa a las 48 horas luego de la transfección. Como resultado de la transfecciones pudimos observar variaciones significativas de la actividad del reportero para algunas de las SNV-sG4, respecto a la versión WT (wild type). Estas evidencias nos permitieron inferir que la presencia de ciertas variantes estaría influyendo en los niveles de expresión del gen reportero regulado por el promotor de c-MYC en las construcciones plasmídicas. Colectivamente, los resultados obtenidos en esta tesis aportan nuevas evidencias sobre el efecto de las SNV presentes en las sG4 sobre la formación de G4, tanto de manera bioinformática como in vitro, y su influencia en la regulación de los niveles de transcripción en un contexto celular. Los resultados recogidos en este trabajo sugieren que las SNV-sG4 que alteran el plegamiento de G4 pueden ser la causa de la expresión diferencial de genes y podrían considerarse como un nuevo mecanismo de etiología molecular para la predisposición o el establecimiento de patologías humanas, como el cáncer en el caso de los oncogenes.
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Modelización físico-biológica del efecto hemorreológico in vitro de anestésicos. Implicancias en la diabetes mellitus
(2023) Batista da Silva, Marcus V.; Alet, Analía I.; Riquelme, Bibiana Doris
La diabetes es un grupo de trastornos metabólicos que se caracteriza por hiperglucemia y por el aumento de otros parámetros sanguíneos dependiendo del tipo de diabetes. Debido a esta condición, los glóbulos rojos (GR) son modificados químicamente por efecto de la glicación, la cual produce una disminución de la carga eléctrica superficial negativa, reduciendo la repulsión electrostática, lo cual favorece la agregación eritrocitaria y altera los parámetros hemorreológicos. Por otra parte, se ha observado que las diferentes drogas empleadas en anestesia pueden afectar los parámetros hemorreológicos y hemostáticos. Los anestésicos aplicados por vía intravenosa más usuales consisten en una combinación de propofol (P), remifentanilo (R) y bromuro de vecuronio (V). El propofol es un agente hipnótico de corta duración y rápida recuperación anestésica. El remifentanilo es un analgésico, y se emplea para la inducción y mantenimiento de la anestesia general. El bromuro de vecuronio es un bloqueador neuromuscular no despolarizante que se usa para la relajación muscular. Dado que los pacientes diabéticos presentan alteraciones hemorreológicas de base, el uso de anestésicos podría agravarlas. Por este motivo la detección y cuantificación de dichas alteraciones antes de una cirugía sería de gran importancia para tomar medidas preventivas y obtener el máximo beneficio para el paciente. En esta Tesis, mediante un estudio hemorreológico in vitro, se propuso modelizar cómo los compuestos anestésicos pueden modificar la capacidad de agregación y la viscoelasticidad de los GR humanos glicados in vitro, a concentraciones cercanas a las alcanzadas en plasma y sangre durante una cirugía (steady-state). Para ello, a fin de modelizar in vitro el proceso de glicación debido a la hiperglucemia, se incubaron GR de dadores sanos con una solución de glucosa a una concentración final de 0,5% p/v (correspondiente a una glucemia de 0,5 g/dl). Para modelizar in vitro el efecto de los anestésicos sobre los GR glicados (g) y sin glicar (C) (suspendidos al 40% en plasma autólogo), estos fueron incubados con soluciones de los distintos anestésicos en PBS, siendo la concentración final de incubación la presentada en steady-state durante una cirugía. La incubación se realizó tanto con cada anestésico por separado (P, R y V) como con sus combinaciones (PR, PV, RV y PRV). Al analizar la morfología de los agregados de los GR por microscopía óptica, se observó que en el tratamiento con los anestésicos P, V, PV y PRV presentó un incremento significativo en el porcentaje de los agregados de 5 o más células con respecto al control (C), indicando que estos anestésicos influirían en el comportamiento de la agregación eritrocitaria. También se encontró un aumento significativo para el porcentaje de AMAS en el tratamiento con PRV, indicando que la combinación de los tres anestésicos aumentaría la agregación. En concordancia con esto, hubo un aumento significativo para el porcentaje de AMAS entre g y PRVg revelando que el tratamiento conjunto de anestesia y glicación también aumentaría significativamente la agregación. Al analizar la cinética de agregación de los GR con un agregámetro de chip óptico (basado en la técnica de transmisión láser), se pudo observar que el tiempo mitad (t1/2) presentó una disminución significativa para PRV, indicando que la mezcla de los tres anestésicos aceleraría el proceso de agregación. Además, se observó un aumento significativo de la amplitud de agregación (Amp/2) para la muestra g al comparar con el C. Se analizaron los parámetros hemorreológicos empleando el Reómetro Eritrocitario, basado en la técnica de difractometría láser. Se pudo observar que el módulo elástico de la membrana del GR () disminuyó significativamente para el tratamiento con PRV respecto a C, revelando una posible alteración de la elasticidad de la membrana eritrocitaria por la acción de esta combinación de anestésicos. Al analizar los efectos debido a la glicación, se observó que los valores de la viscosidad superficial de membrana () y el  presentaron diferencia significativa para los GR glicados, sugiriendo alteraciones en la viscoelasticidad por este tratamiento. Asimismo, se observó que el valor de μ disminuyó significativamente en las muestras Rg, PRg, RVg y PRVg respecto al g. Finalmente, los resultados de las determinaciones viscoelásticas y de agregación eritrocitaria indican que las propiedades hemorreológicas de los GR podrían estar afectadas en diferente grado por la acción de los anestésicos propofol, remifentanilo y vecuronio, solos o en combinación. Además, los resultados obtenidos aplicando la modelización in vitro de la glicación por hiperglucemia, muestran que las alteraciones hemorreológicas podrían ser mayores por el uso de estos anestésicos. Particularmente, se observó que los GR formarían agregados anómalos (clusters) y de mayor tamaño por efecto de los anestésicos y la concentración de glucosa. Los resultados de esta tesis son de gran importancia para la evaluación de la prevención de complicaciones en procedimientos quirúrgicos, y también para evitar posibles complicaciones microvasculares postoperatorias en pacientes diabéticos.
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Desarrollo de trampas cebadas para la captura de Triatoma infestans, vector de la Enfermedad de Chagas, estudios neurofisiológicos y comportamentales
(2023) Ibarra Bouzada, Lucía María Esther; Guerenstein, Pablo Gustavo; Cecere, María Carla
En Sudamérica, Triatoma infestans es el principal vector del protozoo Trypanosoma cruzi, agente etiológico de la enfermedad de Chagas. Actualmente existen diversos problemas en cuanto al control vectorial de triatominos: reinsfestación desde peridomicilio a domicilio luego del rociado con insecticidas, triatominos con hábitos silvestres migrando al peridomicilio, creciente infestación en zonas urbanas, aparición de resistencia a piretroides. Para optimizar la toma de decisiones para el control resulta necesario el desarrollo de herramientas de monitoreo y detección temprana de la presencia de vinchucas. Por tal motivo, nos propusimos desarrollar trampas cebadas que induzcan un alto nivel de captura de T. infestans, a través de estudios neurofisiológicos y comportamentales. En cuanto al estudio neurofisiológico, a través de registros extracelulares multicanal en cerebro se profundizó el conocimiento sobre el sistema olfativo de T. infestans. Se evaluaron olores de hospedador, tanto sintéticos (ej. α-pineno) como naturales (ej. pluma de gallina) con el fin de determinar las respuestas de neuronas olfativas del lóbulo antenal. Dichas neuronas respondieron a olores de vertebrados mostrando respuestas de excitación e inhibición. En cuanto a estudios comportamentales, para evaluar trampas se empleó un diseño sumamente práctico de cajas experimentales que simulan un ambiente natural bajo condiciones de laboratorio. Se desarrollaron 2 tipos de trampas cebadas con una mezcla de olores de hospedador, que demostraron ser eficientes en la captura de triatominos. También se evaluó la emisión de los componentes del cebo de olor, concluyéndose que estos aún están presentes a los 4 días de preparado el cebo. Posteriormente se diseñó y evaluó una trampa con un cebo sintético multimodal que consistió en la fuente de olores, una fuente de calor (cera de parafina) y una de CO2 (levadura seca + sacarosa + agua). Esta demostró capturar tantos individuos como una trampa con hospedador vivo como cebo, aumentando la captura de la trampa con cebo de olor solo. A partir de ello, se decidió evaluar el papel que desempeñan los componentes del cebo multimodal en la captura, encontrando que una trampa cebada con olores + CO2 captura tanto como una trampa cebada con olores + calor + CO2, y que una trampa cebada con olor + calor anula la captura de triatominos. También se observó que una trampa cebada con olores + CO2 tiende a capturar más que una trampa cebada solo con CO2, o solo con olor, aunque no se encontraron diferencias significativas entre las capturas de las trampas cebadas con estos tres tratamientos. Se midió la temperatura de la fuente de calor desde que la cera de parafina fue derretida hasta los 90 minutos, obteniéndose una temperatura de 46.2°C a los 15 minutos (momento en que se comenzaba el ensayo), descendiendo hasta los 90 minutos (25.9°C – temperatura ambiental). También se cuantificó la temperatura sobre la trampa, la cual se mantuvo por encima de la temperatura ambiental durante 100 minutos desde que se colocó en la trampa. Se cuantificó la concentración de CO2 emitido por la trampa durante las primeras horas del ensayo (270 min). Este gas alcanzó su máxima concentración (717ppm) a los 60 minutos; luego disminuyó progresivamente hasta los 110 minutos alcanzando la concentración del ambiente (ca. 570 ppm). Ante la necesidad de contar con nuevas herramientas que permitan monitorear la presencia de triatominos, principalmente T. infestans, el desarrollo de trampas cebadas con olores y CO2 (cultivo de levadura) resulta útil. Si bien la trampa cebada resultó ser eficiente en la captura de triatominos en los ensayos en cajas experimentales, aún es necesario que sea ensayada en condiciones de campo para evaluar su desempeño bajo condiciones naturales.
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Estudio del mecanismo de activación del sistema VraSRT de Staphylococcus aureus y búsqueda de inhibidores producidos por actinomicetos
(2023) Antinori, Melisa Belén; Llarrull, Leticia Irene
Staphylococcus aureus es una de las amenazas clínicas multirresistentes más importantes a nivel mundial. El sistema VraSRT detecta daños en el peptidoglicano de la pared celular y coordina una respuesta que conduce a la resistencia a los antibióticos. Presenta un mecanismo de activación aún no esclarecido y está formado por 3 proteínas: una histidin quinasa de membrana (VraS), un regulador de respuesta citoplasmático (VraR) y otra proteína de membrana esencial, cuya función se desconoce (VraT). En este trabajo de tesis se realizaron experimentos in vitro e in vivo para investigar la activación del sistema VraSRT y los acontecimientos moleculares implicados en la transducción de señal que conducen a la resistencia. Se construyó y validó una cepa reportera que permite la expresión de GFP bajo el control del sistema VraSRT. Se confirmó que el sistema VraSRT sólo responde a la presencia de antibióticos que dañan la pared celular y se descubrió que el sistema VraSRT no se activa en respuesta a fragmentos del peptidoglicano generados por la acción de las enzimas lisostafina y mutanolisina, involucradas en el remodelado de la pared celular. También se evaluó la interacción entre VraS, VraT y diferentes fotosondas de afinidad derivadas del antibiótico β-lactámico ampicilina (FS-Amp) y del antibiótico glicopéptido vancomicina (VPP). Se verificó que las modificaciones químicas introducidas en los antibióticos para generar las fotosondas de afinidad no afectaron su capacidad de inducir al sistema VraSRT. Se logró sobre-expresar y localizar correctamente en membrana las proteínas VraS y VraT en células E. coli BL21 StarTM (DE3). Se observó un retraso en la movilidad electroforética tras la incubación e irradiación de VraS con las fotosondas de ampicilina, lo que sugiere la presencia de un aducto VraS-FS-Amp. Fue posible purificar dicho aducto pero no se pudo corroborar la formación del mismo. Se confirmó la existencia de un aducto VraS-VPP, lo que demostró una interacción directa entre VraS y la vancomicina. Si bien no fue posible confirmar el lugar exacto de la interacción, ensayos preliminares sugieren que la interacción se daría a través del péptido T 41QIF. La proteína VraS purificada no conservó la actividad auto-quinasa. Sin embargo, la proteína en membranas de E. coli y reconstituida en liposomas luego de ser purificada mostró actividad auto-quinasa constitutiva. Con respecto a VraT, los ensayos con las fotosondas derivadas de antibióticos permitieron descartar una interacción directa con esta proteína. Además, se examinó una mezcla de compuestos secretados por 40 cepas diferentes de actinomicetos utilizando la cepa reportera y se identificaron varias que impedían la activación del sistema de resistencia. También se observó que algunos de estos extractos restablecían la eficacia de los antibióticos frente a cepas clínicas resistentes. En conclusión, el sistema VraSRT es una importante vía de señalización que desempeña un papel clave en la resistencia de S. aureus a los antibióticos. Esta tesis permitió dilucidar nuevos aspectos del mecanismo de activación del sistema VraSRT; específicamente, se demostró la existencia de una interacción directa de la proteína VraS con el antibiótico glicopéptido vancomicina sin que esta interacción modifique notoriamente la actividad auto-quinasa basal de VraS. Además, se identificaron extractos de actinomicetos con compuestos con potencial terapéutico, abriéndose así una nueva línea de investigación para la determinación de la estructura de estos compuestos y del mecanismo de acción.
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Caracterización molecular de haplotipos Rh variantes. Implicancia en medicina transfusional
(2023) Principi, Cintia Soledad; Cotorruelo, Carlos; Trucco Boggione, Carolina
El sistema Rh posee gran importancia clínica debido a la inmunogenicidad de sus antígenos, y a la participación de sus anticuerpos en la patogénesis de la enfermedad hemolítica fetoneonatal, de reacciones hemolíticas transfusionales y de algunas anemias hemolíticas autoinmunes (8, 73). El locus RH está compuesto por dos genes homólogos denominados RHD y RHCE, que codifican las proteínas transmembranales eritrocitarias RhD y RhCE, respectivamente (180). Este sistema presenta gran variabilidad alélica, que se traduce en fenotipos con expresión parcial o débil de los antígenos y en deleciones parciales o totales de las proteínas (15). El gran número de variantes fenotípicas descriptas y la elevada variabilidad en los patrones de reactividad que éstas muestran con los antisueros monoclonales restringe la aplicación de métodos serológicos para su correcta determinación. La caracterización molecular de las variantes alélicas resulta un recurso apropiado para resolver los problemas en aquellas situaciones clínicas donde la serología presenta limitaciones. El conocimiento de las bases genéticas del sistema Rh permitirá implementar estrategias moleculares útiles para identificar inequívocamente el alelo responsable del fenotipo Rh. En este trabajo de Tesis hemos investigado los eventos genéticos responsables de la variabilidad en la expresión de los antígenos Rh y analizado la asociación entre variantes alélicas RHD y RHCE. Además, hemos validado una estrategia molecular para la detección de sustituciones, insersiones y deleciones nucleotidicas, presencia/ausencia y variación del número de copias de exones de los genes RH para la identificación de fenotipos con genotipo desconocido. En este trabajo de Tesis se analizaron las bases moleculares responsables de alteraciones en la expresión de los antígenos D y E encontradas en un donante de sangre y su familia. Mediante diferentes estrategias de biología molecular se han elucidado las bases genéticas que subyacen en la expresión aberrante de estos antígenos. Los resultados obtenidos mostraron que el donante y sus dos hijos son portadores del haplotipo RHD*DEL43-RHCE*ce.37. La baja frecuencia poblacional de las variantes alélicas RHD y RHCE halladas en este estudio sugiere un desequilibrio de ligamiento entre las mismas. Para confirmar este hallazgo, se estudiaron posteriormente 17 muestras de ADN de donantes portadores del alelo RHD*DEL43 y su asociación con la variante alélica RHCE*ce.37. Este estudio permitió identificar el haplotipo RHD*DEL43-RHCE*ce.37 en el 64,71% de las muestras estudiadas, demostrando una fuerte asociación entre ambas variantes RH. Posteriormente, se estudió la asociación entre los alelos RHD*D débil tipo 1 en R0 y RHD*D débil tipo 4, hallados con alta prevalencia en individuos con fenotipo D variante de nuestra población (104, 164), con los polimorfismos más frecuentemente encontrados en variantes alélicas RHCE (c.48C en el exón 1 y c.733G en el exón 5). Se estudiaron 32 muestras de ADN provenientes de individuos con genotipo RHD*D débil tipo 1 en R0 (n=15) y de individuos con fenotipo Dccee (n=17 como grupo control) y su asociación con los polimorfismos c.48C y c.733G en RHCE. Los resultados obtenidos mostraron que en el 100% de las muestras portadoras del alelo RHD*D débil tipo 1 en R0 y en el 76,47% de las muestras con fenotipo Dccee se identificaron los polimorfismos c.48C y c.48G. Estos estudios moleculares sugieren un desequilibrio de ligamiento entre los alelos RHD*D débil tipo 1 y el alelo RHD normal cuando se encuentran en haplotipo R0 con la variante alélica RHCE*ce (48C). En cuanto al estudio llevado a cabo para la detección del polimorfismo c.733G, los resultados moleculares sugieren que no existe asociación entre las variantes RHD analizadas y el alelo RHCE*ce (733G). En una etapa posterior, se estudiaron 61 muestras RHD*D débil tipo 4 y su asociación con los polimorfismos c.48C y c.733G en RHCE. Los resultados de este análisis permitieron determinar que hay una asociación del 86,89% entre el alelo RHD*D débil tipo 4 y los polimorfismos c.48C, c.733G. Con el objetivo de establecer si los polimorfismos c.48C y c.733G presentes en el 86,89% de las muestras RHD*D débil tipo 4 se encuentran en cis, formando parte de un alelo RHCE*ce(c.48C, c.733G) (haplotipo RHD*D débil tipo 4- RHCE*ce(c.48C, c.733G)) o formando parte de los haplotipos RHD*D débil tipo 4-RHCE*ce(c.48C) o RHD*D débil tipo 4-RHCE*ce(c.733G) en trans con los haplotipos RHD*01N.01 -RHCE*ce(c.733G) o RHD*01N.01 -RHCE*ce(c.48C), respectivamente, se analizó la presencia de los SNVs c.48C y c.733G en 304 muestras de ADN con una deleción homocigota del gen RHD. Este estudio mostró una baja asociación entre el alelo RHD*01N.01 con los polimorfismos c.48C y c.733G. El 2,30% de las muestras resultaron portadoras del polimorfismo c.733G y el 2,96% de las muestras resultaron portadoras del polimorfismo c.48C. Ninguna de las muestras analizadas fue portadora de ambos polimorfismos concomitantemente. Estos hallazgos sugieren que en el 86,89% de las muestras RHD*D débil tipo 4 los polimorfismos c.48C y c.733G se encuentran en cis formando el haplotipo RHD*D débil tipo 4- RHCE*ce(c.48C, c.733G). Para evaluar la presencia de otros polimorfismos en el exón 5 del gen RHCE, se realizaron estudios de secuenciación en muestras portadoras del haplotipo RHD*01N.01-RHCE*ce(733G). Los resultados mostraron que este polimorfismo fue detectado en estado heterocigota en todas las muestras analizadas, sugiriendo que el alelo RHCE hallado es RHCE*ceVS.01. Los resultados obtenidos en los estudios de asociación entre variantes alélicas RHD y RHCE permitieron detectar desequilibrios de ligamiento que involucran a las variantes RHD*DEL43, RHD*D débil tipo 1 y RHD*D débil tipo 4 con alelos RHCE responsables de expresiones alteradas de los antígenos c, E y e. La identificación de variantes RHCE por métodos moleculares permite superar las limitaciones de las técnicas serológicas convencionales que no detectan expresiones aberrantes de los antígenos c, E y e en muestras que portan una copia normal del gen RHCE en trans. La detección de estos polimorfismos del gen RHCE por métodos moleculares permite prevenir eventos de aloinmunización cuando las variantes RHCE*ce.37 y RHCE*ce (48C, 733G) se encuentran en trans con los alelos normales RHCE*Ce, RHCE*Ce o RHCE*CE. En este trabajo de Tesis se validó una nueva estrategia molecular (PCR multiplex cuantitativa de fragmentos cortos fluorescentes: PCR-QMPSF) para investigar el número de copias de todos los exones, tanto del gen RHD como RHCE. Inicialmente se estudió un grupo de muestras portadoras de genes normales y genes híbridos D-CE con genotipos conocidos para validar su utilidad y robustez. A través de esta estrategia logramos caracterizar 4 variantes alélicas RHD, identificando 3 alelos nulos, RHD-RHCE(3-9)-D (n=2), RHD*01N.07 y un alelo D parcial RHD*DVI tipo 4, de una forma mucho más rápida, menos laboriosa y disminuyendo el error asociado al operador. Sin embargo, se trata de una metodología costosa que debe ser empleada criteriosamente. Esta estrategia presenta muchas ventajas, incluido el hecho de que la reacción se lleva a cabo en un formato de tubo cerrado, reduciendo así la exposición química de los operadores a compuestos potencialmente nocivos. El método aprovecha el etiquetado fluorescente universal, que utiliza un solo cebador conjugado con marcación fluorescente para etiquetar todos productos de PCR, contribuyendo así a reducir el coste de los reactivos. Finalmente hemos investigado las bases moleculares responsables de la expresión alterada de los antígenos RhCE en 4 donantes de sangre, logrando caracterizar la estructura molecular de los alelos responsables. Se estudió un grupo familiar donde se observó una discrepancia en la herencia de los antígenos RhCE. Los resultados moleculares obtenidos han permitido demostrar la presencia de un nuevo haplotipo nulo RHD*08N.01- RHCE*01.16(807G). Cabe señalar que tanto los alelos RHD como RHCE en este haplotipo son silenciados por el mismo SNV c.807T>G, posiblemente como consecuencia de la recombinación homóloga entre las secuencias RHD y RHCE. Esta sustitución nucleotídica es responsable de la generación de un codón de terminación prematuro y proteínas Rh truncas que no se integran en la membrana del eritrocito. Estudios previos (118, 107, 178, 179) han reportado que el mismo codón de terminación generado por la mutación en la posición nucleotídica 807 es responsable de 9 alelos RH silentes (8 RHD y un alelo RHCE). Teniendo en cuenta todos estos hallazgos resulta lógico suponer que esta posición en la secuencia de ADN presenta una inestabilidad inherente susceptible a adquirir mutaciones debido a una alta tendencia a la conversión génica o a sustituciones de nucleótidos simples. El análisis de segregación familiar mostró que este haplotipo se heredó por vía materna. Por otro lado, se investigó la presencia de la inserción de 4 pb en el exón 8 del gen RHD en muestras portadoras del gen RHD*08N.01, previamente genotipificadas en nuestro laboratorio. La estrategia QMPSF permitió demostrar que en nuestra población todas las variantes RHD*08N.01 halladas muestran un desplazamiento de 4pb en el exón 8 del gen RHD, lo cual constituye un nuevo polimorfismo que podría ser utilizado para la caracterización del pseudogen RHDΨ. Finalmente, se identificaron los mecanismos moleculares responsables de fenotipos con deleción parcial de los antígenos RhCE en 3 donantes. En una muestra se halló una mutación puntual (c.659G > A) que genera un codón de terminación prematuro y una proteína trunca RhCE incapaz de integrarse en la membrana del eritrocito (fenotipo D--). En las otras dos muestras estudiadas se detectaron nuevos alelos híbridos RHCE-D-CE responsables no solo de los fenotipos D- - y Dc- sino también de la sobreexpresión de antígeno D y de la expresión de un antígeno c variante, respectivamente. En este trabajo de Tesis evidenció que distintos mecanismos moleculares pueden ser responsables de un mismo fenotipo con deleción parcial de los antígenos RhCE (D--). En todos los casos estudiados se brindó asesoramiento genético a los donantes en caso de requerir transfusiones o cursar embarazos a lo largo de su vida. Las estrategias moleculares diseñadas en este trabajo de Tesis permitieron profundizar los conocimientos sobre los eventos genéticos responsables de la expresión variante de los antígenos del sistema Rh. Hemos demostrado que los estudios serológicos no son suficientes para identificar todas las variantes antigénicas. Los resultados obtenidos en este trabajo de Tesis establecen la importancia del estudio del polimorfismo molecular del locus RH, para desarrollar estrategias de tipificación de ADN confiables, que permitan realizar la genotipificación RH y optimizar la selección de unidades hemocompatibles en los servicios de medicina transfusional.

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