(FBIOyF) Posgrado - Tesis
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Ítem Embargo Valorización de bioaceites y biocarbones obtenidos por pirólisis de material celulósico residual(2025) Pava Gómez, Beatriz Elena; Spanevello, Rolando Ángel; Sarotti, Ariel MarceloLa soja es el principal grano de producción nacional en Argentina. Esta es comúnmente sometida a un proceso de extracción para la producción de harina y aceite, generándose como subproducto cáscara de soja (más de 400 mil toneladas anuales). Este trabajo se centró en el aprovechamiento de este residuo de lignocelulósico, mediante el uso de procesos de pirólisis como una de las tecnologías de transformación química de biomasa en materiales de valor agregado. Para poder ofrecer alternativas bioeconómicas de reciclaje de la cáscara de soja, se identificaron las condiciones óptimas de generación de los productos de gran valor agregado. En el capítulo II, se determinaron las condiciones óptimas de pirólisis para la obtención de un carbón activado (CA) con gran capacidad de adsorción mediante diseños estadísticos de experimentos. La capacidad de adsorción de los distintos carbones preparados fue evaluada a través de la adsorción de azul de metileno, un colorante difícil de remover por las técnicas convencionales de tratamiento de agua y que sirve como indicador en la capacidad de adsorción del mismo. En este capítulo se muestra la caracterización del CA optimizado. Con el fin de poner a prueba la versatilidad de la adsorción del CA optimizado, en el capítulo III se estudió la adsorción de diferentes moléculas orgánicas, como ciprofloxacina, metil éster de ciprofloxacina, tiabendazol y amarillo ácido 17. Se realizó un estudio fisicoquímico, cinético y termodinámico para entender el comportamiento, los tipos de fuerzas intermoleculares que participan y posibles mecanismos del proceso de adsorción. Por otra parte, en el capítulo IV, fueron cuantificados los componentes mayoritarios de la cáscara de soja. Así mismo, se optimizó el proceso de obtención de levoglucosenona (LGO) 1.1 del bioaceite obtenido de la pirólisis convencional de la cáscara de soja con ayuda de estadística. LGO obtenida fue aislada con un grado de pureza adecuada para poder utilizarla en otras aplicaciones. Con el fin de evaluar la viabilidad de generar productos de alto valor agregado como CA y LGO a escala industrial, se realizó un aumento del escalado del proceso de laboratorio a piloto. Se pasó de procesar gramos (ensayos realizados en los capítulos II y IV), a procesar kilogramos en un reactor pirolítico piloto (capítulo V). En este capítulo se muestra un diseño general del reactor, los cambios sobre el equipo necesarios para alcanzar las condiciones de procesamiento óptimas, entre otros. LGO obtenida en capítulo IV fue empleada como material de partida para la generación de compuestos bioactivos. En el capítulo VI, se sintetizaron nuevos selenoderivados de LGO mediante reacciones de adición de tipo Michael sobre la cetona α,β-insaturada de LGO. Con estos compuestos se realizaron estudios de actividad biológica frente a Candida y Criptococcus. De igual manera, se sintetizaron compuestos que habían sido previamente reportados, los derivados halogenados de LGO (capítulo VII), con los cuales también se realizaron ensayos de actividad biológica frente a Candida y Criptococcus.Ítem Embargo Estudio de la función de TcBDF4 y TcBDF5, dos factores de remodelación de la cromatina de Trypanosoma cruzi(2025) Rodríguez Araya, Elvio; Serra, Esteban CarlosLa enfermedad de Chagas, causada por Trypanosoma cruzi, sigue siendo un problema relevante de salud en América Latina. La regulación de la expresión génica en este parásito ocurre a nivel postranscripcional y está influenciada por mecanismos epigenéticos, incluyendo la acetilación de histonas. En este contexto, las proteínas con bromodominio (BDF) son fundamentales en la regulación epigenética, ya que reconocen residuos de lisina acetilados en histonas y otros sustratos. En T. cruzi, se han identificado ocho BDF con estructuras diversas, cuya función aún no está completamente caracterizada. Esta tesis se centra en el estudio de TcBDF4 y TcBDF5, dos miembros de esta familia, y su integración en complejos asociados a la acetilación de histonas (HARC, por sus siglas en inglés). Se implementó una estrategia experimental multidisciplinaria dividida en cuatro capítulos, combinando enfoques proteómicos, bioinformáticos y funcionales. Mediante el uso de TurboID, se identificaron los interactomas de TcBDF4 y TcBDF5, revelando su participación en los complejos TcCRKT y TcNuA4, este último homólogo al complejo NuA4 de eucariotas superiores. Se determinó que TcBDF5 es un regulador central del grado de compactación de la cromatina, actuando a través de su integración en TcCRKT y su asociación con otros factores de remodelación epigenética. Su función es clave para modular los estados de condensación de la cromatina, equilibrando entre conformaciones más abiertas, que favorecerían la transcripción, y estados más compactos, que restringirían el acceso a la maquinaria transcripcional. El análisis estructural mediante AlphaFold2-multimer y dinámica molecular permitió predecir interacciones directas dentro de estos complejos, las cuales fueron validadas experimentalmente mediante ensayos de doble y triple híbrido en levaduras (Y2H/Y3H). A nivel bioinformático, se empleó una estrategia de ensamblado combinatorio para predecir la organización y estequiometría de los complejos identificados, integrando predicciones de dímeros y oligómeros con herramientas como FoldSeek, CombFold y teoría de grafos. Finalmente, se evaluó el impacto funcional de TcBDF5 en el ciclo de vida del parásito mediante la generación de líneas knockout y sobreexpresantes. Se observaron alteraciones significativas en el crecimiento y la morfología nuclear de los mutantes, lo que sugiere un rol esencial de TcBDF5 en la regulación epigenética de T. cruzi. Además, se identificó el dominio MRG de TcBDF5 como un blanco terapéutico clave, dado su papel en la regulación de la compactación de la cromatina. Este dominio participa en interacciones esenciales dentro del complejo TcCRKT, modulando directamente la transición entre estados más abiertos o compactos. Su inhibición podría representar una estrategia innovadora para alterar la estructura de la cromatina en el parásito y afectar su viabilidad. Los hallazgos de esta tesis aportan información clave sobre la función de TcBDF4 y TcBDF5 y sus interacciones dentro de los complejos HARC. Además, identifican potenciales blancos terapéuticos para el desarrollo de nuevas estrategias contra la enfermedad de Chagas.Ítem Embargo Estudio del papel de proteínas Vav en procesos celulares asociados al cáncer(2025-02) Cesatti Laluce, N.; Menacho Márquez, Mauricio; Girardini, JavierEl aumento de la expectativa de vida de las últimas décadas a nivel global ha contribuido a que el cáncer adquiera una mayor relevancia como una de las principales causas de muerte. Entre los distintos tipos de cáncer, aquellos que afectan a la piel han cobrado particular importancia, debido al deterioro progresivo de la capa de ozono y el consecuente aumento de exposición a radiación ultravioleta; principal factor ambiental implicado en el desarrollo de estas patologías. Por su parte, el melanoma es la forma más mortal de cáncer de piel y, tanto su incidencia como su mortalidad han aumentado en las últimas décadas. Las proteínas VAV son factores de intercambio de nucleótidos de guanina (GEF) que catalizan la activación de GTPasas, principalmente de la familia Rho/Rac. Por su actividad catalítica, se ha documentado ampliamente el rol protumoral de esta familia de GEF en diversos tipos de cánceres, entre ellos: de colon, mama, próstata e, incluso, de piel no melanoma, entre otros. En el presente trabajo, se llevó adelante un estudio del rol de VAV3 en el melanoma cutáneo. El papel de VAV3 en este tipo de cáncer no ha sido estudiado hasta el momento de publicación de este trabajo. La caracterización del rol de este GEF en melanoma se llevó adelante mediante abordajes in silico, in vitro e in vivo empleando modelos celulares, murinos y de bases de datos de pacientes. Los resultados obtenidos evidencian que VAV3 es el miembro de esta familia de GEF cuya expresión es más alta tanto en la piel como en el melanocito cutáneo en condiciones fisiológicas. Además, la expresión de este GEF se asocia directamente a la probabilidad de supervivencia de los pacientes, sugiriendo roles específicos de este miembro de la familia VAV. Por otra parte, se observó que la expresión de VAV3 está directamente implicada en procesos biológicos clave de la célula del melanoma, específicamente en la proliferación, la organización del citoesqueleto de actina, la migración y la apoptosis. Al mismo tiempo, en modelos animales de melanoma, la expresión de VAV3 se asoció inversamente a la agresividad de los tumores desarrollados. Finalmente, mediante abordajes bioinformáticos se identificó un amplio transcriptoma cuya expresión está asociada a la expresión de VAV3. Mediante análisis comparativo de modelos celulares y de bases de datos de pacientes, se identificó un reducido subgrupo de genes dependientes de la expresión de VAV3 y cuyas implicancias biológicas estarían relacionadas con la migración celular. El conjunto de resultados in silico, in vitro e in vivo aquí presentados dan evidencias de que la expresión de VAV3 guarda una relación inversa con la agresividad del melanoma cutáneo, sugiriendo que este GEF actúa como un gen supresor de tumores en el contexto de esta enfermedad.Ítem Embargo Relevancia del estado redox cloroplástico en el desarrollo foliar(2025) Demarchi, Mariana; Lodeyro, Anabella F.El objetivo del presente trabajo de Tesis es analizar el impacto del estado redox de los cloroplastos en procesos clave como el desarrollo foliar, la respuesta al estrés oxidativo, y la señalización retrógrada. Con este propósito, se adoptó como estrategia general la introducción de un gen proveniente de cianobacterias, ausente en plantas superiores, en diferentes especies vegetales. En este contexto, se emplearon las especies Arabidopsis (Arabidopsis thaliana), maíz (Zea mays) y tabaco (Nicotiana tabacum) que expresaban una flavodoxina (Fld) de Anabaena en cloroplastos. Estudios previos han demostrado que Fld actúa como un antioxidante general en los cloroplastos de líneas transgénicas, detoxificando las especies reactivas del oxígeno (EROs) generadas a nivel de la cadena fotosintética de transporte de electrones (CFTE), al aceptar electrones a nivel del fotosistema I de modo análogo a ferredoxina. En Arabidopsis, se investigó el efecto de esta flavoproteína en el desarrollo foliar y la respuesta al estrés. Estudios previos evidenciaron que la expresión de Fld confiere una mayor tolerancia a condiciones adversas, aunque este fenotipo conlleva una reducción en el tamaño foliar cuando la flavoproteína es expresada de manera constitutiva. Utilizando promotores inducibles para la expresión de Fld, pudimos demostrar en el presente trabajo de Tesis que Fld induce este fenotipo cuando su expresión ocurre durante la fase de expansión tardía del desarrollo foliar. Adicionalmente, se observó que la mayor tolerancia al estrés podría estar relacionada con la expresión de Fld en la etapa de proliferación celular. Adicionalmente, se investigó la importancia del estado redox de los cloroplastos dimórficos del maíz, una especie C4, en la tolerancia al estrés abiótico. Los resultados indicaron que la introducción de Fld en los cloroplastos de las células del mesófilo confiere una ventaja adaptativa bajo condiciones de sequía y estrés oxidativo. Sin embargo, la expresión de la flavoproteína en los cloroplastos de la vaina vascular no sólo no produjo beneficio alguno, sino que además aumentó la sensibilidad al estrés en estas líneas transgénicas. Por último, se analizó el impacto de los cambios en el estado redox de los cloroplastos sobre la señalización retrógrada durante episodios de estrés biótico en plantas de tabaco. Los resultados mostraron que la luz desempeña un papel fundamental durante la progresión de la infección, y que, bajo estas condiciones la expresión de Fld atenúa las lesiones provocadas por los patógenos. Además, las plantas transgénicas mostraron una reducción en la señalización retrógrada cloroplasto-núcleo, posiblemente debido a la menor presión de estrés percibida por las mismas. En resumen, el uso de flavodoxina como herramienta permitió establecer que el estado redox cloroplástico tiene la capacidad de influir en diversos procesos celulares clave en las plantas. Estos hallazgos no solo aportan valiosa información para la investigación científica, sino que también podrían aplicarse en estrategias de mejoramiento de cultivos con una respuesta optimizada frente a condiciones ambientales adversas.Ítem Embargo Alteración del transporte hepatocanalicular en la colestasis por estrógenos: papel de las especies reactivas del oxígeno(2024) Salas, Gimena; Crocenzi, Fernando A.; Basiglio, Cecilia LorenaEl metabolito endógeno del estradiol, el estradiol 17β-D-glucurónido (E17G), es considerado el principal responsable de la colestasis intrahepática del embarazo. El E17G altera la actividad de transportadores canaliculares, como la proteína asociada a resistencia a multidrogas 2 (Mrp2), a través de una internalización celular dependiente de la activación de distintas vías de señalización. Este fenómeno también se ha atribuido al estrés oxidativo en diferentes condiciones colestásicas experimentales. Sin embargo, aunque se ha avanzado considerablemente en el entendimiento de los mecanismos que participan en la colestasis por estrógenos, aún no existen reportes que involucren al estrés oxidativo en esta patología. Por lo tanto, el objetivo de este trabajo de tesis consiste en analizar la implicancia de las especies reactivas del oxígeno (ROS) en la colestasis por E17G, su origen, y las vías de señalización involucradas en el proceso de endocitosis del transportador Mrp2. Utilizando el modelo in vitro de duplas aisladas de hepatocitos de rata y el cultivo primario de hepatocitos de rata en configuración sándwich demostramos que compuestos antioxidantes previnieron la alteración de la actividad de Mrp2 inducida por E17G, siendo esta alteración igualmente prevenida por el inhibidor de la NADPH oxidasa (NOX) apocinina. En el modelo de hígado aislado y perfundido, el compuesto antioxidante N-acetilcisteína (NAC) previno el deterioro del flujo biliar y de la actividad de Mrp2 inducidos por E17G, confirmando así la participación de ROS en esta colestasis. En conclusión, la colestasis inducida por E17G está parcialmente mediada por ROS generados por NOX a través de la internalización de transportadores canaliculares como Mrp2, siendo ERK1/2 y p38MAPK necesarias para la activación de NOX. Asimismo, se utilizó el cultivo primario de hepatocitos para evidenciar que el pretratamiento con inhibidores específicos de la proteína kinasa regulada por señal extracelular 1/2 (ERK1/2) y de la proteína kinasa activada por mitógenos p38 (p38MAPK) inhibió la producción de ROS inducida por E17G. Mediante western blot, se demostró que la inhibición de NOX no afectó la fosforilación de ERK1/2 y p38MAPK. Ambos hallazgos sugieren que sería necesaria la activación de estas dos quinasas para que ocurra la activación de NOX. Además, tanto el silenciamiento de p47phox (subunidad reguladora citosólica de NOX) mediante ARNi, como la preincubación con apocinina en el cultivo de hepatocitos en configuración sándwich previnieron significativamente la internalización de Mrp2 inducida por E17G, lo que sugiere un papel crucial de NOX en este fenómeno.Ítem Embargo Orf319: un factor anti-virulencia específico de Salmonella que controla la formación de biopelículas(2024) Vitor Horen, Luisina; Soncini, Fernando C.Salmonella enterica es una bacteria patógena responsable de enfermedades como la gastroenteritis y la fiebre entérica, representando un grave desafío para la salud pública global. Un aspecto fundamental de su ciclo de vida es la capacidad de formar biopelículas, comunidades bacterianas adheridas a superficies y rodeadas por una matriz extracelular autoproducida. En Salmonella, la matriz extracelular está compuesta principalmente de la fimbria agregativa curli y el exopolisacárido celulosa. La transición al estilo de vida comunitario y la formación de biopelículas están controladas por el regulador maestro CsgD, cuya expresión es modulada por factores de transcripción que integran diversas señales ambientales. Entre estos reguladores, MlrA y MlrB, dos factores de transcripción de la familia MerR, juegan un papel crucial en la activación de la expresión de CsgD, y también, reprimen el gen orf319, cuya función es desconocida. El objetivo principal de esta tesis fue caracterizar funcionalmente a Orf319, una proteína codificada en la isla de patogenicidad 2 (SPI-2) de Salmonella, para entender su rol en la formación de biopelículas y en la adaptación intracelular. Se evaluó su interacción con otros reguladores y su impacto en la virulencia del patógeno. En el primer capítulo, se analizó la influencia de Orf319 en la formación de biopelículas. Los resultados mostraron que la expresión ectópica de Orf319 activa la producción de componentes de la matriz extracelular al aumentar los niveles de expresión de CsgD. A pesar de que Orf319 estimula la síntesis de biopelículas de manera similar a MlrA, no requiere la presencia de MlrA, MlrB ni otros reguladores ya caracterizados en Salmonella para la activación transcripcional de csgD. Los estudios también revelaron que Orf319 ejerce un efecto negativo sobre su propia transcripción, sugiriendo un mecanismo de retroalimentación controlado, en parte, por MlrB. Orf319 contiene dos dominios conservados, DUF523 y DUF1722. Mutaciones en cisteínas asociadas a la formación de un clúster Fe-S predicho en el dominio DUF523 afectaron la formación de biopelículas y la transcripción de csgD. El segundo capítulo se centró en el papel de Orf319 en la virulencia de Salmonella. La deleción de orf319 no afectó la capacidad de la bacteria para replicarse dentro de macrófagos, pero la sobreexpresión de Orf319 redujo significativamente la replicación intracelular. Esto se debe a su capacidad para promover la formación de biopelículas a través de la regulación de CsgD, ya que el aumento de la producción de celulosa actúa como factor de anti-virulencia en este entorno. Orf319 también se identificó como un regulador negativo de SsrB, el activador de los genes de la SPI-2, aunque su efecto en condiciones intracelulares parece estar contrarrestado por otros mecanismos. Estos hallazgos sugieren que Orf319 podría actuar como un nexo entre la formación de biopelículas y la virulencia en Salmonella.Ítem Embargo Estudio del papel de las proteínas Vav en procesos celulares asociados al desarrollo de melanoma(2025) Mamberto, Macarena; Menacho Márquez, Mauricio; Girardini, JavierLas proteínas de la familia Vav (Vav1, Vav2 y Vav3) son factores de intercambio de nucleótidos de guanosina (GEFs) que regulan la actividad de GTPasa Rho, desempeñando funciones clave en procesos celulares fundamentales como la reorganización del citoesqueleto, la migración celular y la supervivencia celular. Alteraciones en la regulación de estos procesos pueden contribuir a la transformación maligna de las células. Aunque se ha demostrado la implicación de las proteínas Vav en diversos tipos de cáncer, su papel específico en el melanoma sigue siendo poco conocido. A pesar de representar solo el 4-5% de los cánceres cutáneos, el melanoma es la principal causa de muertes asociadas al cáncer de piel. Esta tesis tiene como objetivo investigar el rol de Vav2 en el desarrollo y la progresión del melanoma, con el fin de arrojar nuevas perspectivas sobre su potencial como diana terapéutica en este tipo de cáncer. Mediante un enfoque integral que abarca estudios in silico, in vitro e in vivo, se evaluaron los efectos de la modulación de los niveles de expresión de Vav2 en células de melanoma. Los resultados obtenidos muestran que Vav2 regula procesos fundamentales como la proliferación, remodelación del citoesqueleto, migración, invasión y adhesión celular, todos ellos cruciales en la progresión tumoral. A nivel molecular, se demostró que la modulación de Vav2 impacta significativamente en la vía PI3K/AKT, esencial para la supervivencia y proliferación celular en el contexto del melanoma. Estos hallazgos fueron corroborados en un modelo in vivo, donde la disminución de los niveles de Vav2 redujo significativamente el crecimiento tumoral, mientras que la expresión de una forma activa de Vav2 promovió un mayor crecimiento tumoral y la aparición de metástasis pulmonares. Además, los resultados sugieren un rol de este GEF en el microambiente tumoral. El análisis in silico mostró que los cambios en la expresión de Vav2 inducen una regulación diferencial de genes clave en procesos celulares esenciales, como el control del ciclo celular, el metabolismo, la remodelación de la matriz extracelular y vías asociadas a MITF, un factor de transcripción fundamental en la progresión del melanoma. Aunque se requieren estudios adicionales para comprender completamente los mecanismos moleculares mediante los cuales Vav2 contribuye a la malignidad del melanoma, los hallazgos de esta tesis sugieren que Vav2 juega un papel central en la progresión tumoral y la formación de metástasis, estableciendo un punto de partida para el desarrollo de nuevas estrategias terapéuticas dirigidas a esta proteína.Ítem Embargo Regulación del desarrollo por el microARN miR396 en Arabidopsis thaliana(2011-08-11) Mecchia, Martín Alejandro; Palatnik, Javier F.Junto con la expansión celular, la proliferación celular es un importante determinante del tamaño y la forma final de la planta. Sin embargo, poco se sabe acerca de cómo los programas de desarrollo controlan el número final de células. El microARN miR396 está altamente conservado en plantas. Regula siete factores de transcripción de la familia de los Growth Regulating Factors (GRFs) que están implicados en el control del tamaño de las hojas. En esta Tesis se aporta evidencia de que el balance entre el microARN miR396 y los GRFS controla la proliferación celular durante el desarrollo de varios órganos en Arabidopsis thaliana. Altos niveles del miR396 reducen la expresión de genes implicados en la proliferación celular, causando una reducción del número de células en las hojas. Altos niveles de miR396 reducen la duración de la fase proliferativa de la hoja y desencadenan prematuramente el proceso de expansión y diferenciación celular. En definitiva, encontramos evidencia de que el microARN miR396 sería un modulador importante del desarrollo de la hoja, afectando desde la proliferación celular en las fases temprana de la hoja hasta los últimos estadios de la vida de la hoja y la senescencia. A su vez, elevados niveles de actividad de GRF producen un aumento en la duración de la fase de proliferación celular tanto en hojas como en tallos. En consecuencia, las plantas con altos niveles de GRF son de mayor tamaño y con una mayor acumulación de biomasa que las silvestres. Además, hemos encontrado que el sistema del miR396 es importante para el establecimiento de las caras abaxial (inferior) y adaxial (superior) de las hojas. Altos niveles del miR396 acrecientan los fenotipos de mutantes individuales determinantes de la cara adaxial de la hoja. Esto sugeriria que una temprana diferenciación de las células abaxiales y un insuficiente número de células en el dominio adaxial en líneas con altos niveles de miR396, desencadenarían un prematuro establecimiento del dominio abaxial. También aportamos evidencia de que el microARN miR396 y los GRFs podrían actuar por debajo de las cascadas regulatorias controladas por el microARN miR319 y los genes KNOX. Estos dos sistemas participan a su vez en la generación de hojas compuestas y en el diseño de la forma de estos órganos en distintas especies de plantas. Por último, en esta Tesis se evalúa la participación del miR396 durante el desarrollo reproductivo de Arabidopsis. El miR396 controla la expresión de marcadores de proliferación celular en tallos y el tamaño final del mismo. Además, se ha mostrado que durante el desarrollo de la flor, el miR396 cumple un rol importante en la determinación de los órganos florales.Ítem Embargo Caracterización de las vías de ensamblado de complejos ferrosulfurados en algas(2024) Marchetti Acosta, Noelia Soledad; Busi, María Victoria; Barchiesi, JulietaEl hierro y el azufre son esenciales para todos los organismos. Estos elementos forman los clusters Fe-S que están presentes como cofactores en numerosas proteínas y complejos proteicos relacionados con procesos clave en las células. Se ha descripto que en las mitocondrias de levaduras, humanos y plantas es la proteína frataxina (FH) quien cede los átomos de Fe en el proceso de biosíntesis de los clusters Fe-S. Esta proteína también ha sido asociada con el control celular redox, la desintoxicación de Fe y la protección contra el estrés oxidativo. Frataxina es una proteína ampliamente distribuida y conservada en la naturaleza. Aunque se han realizado muchos estudios en humanos y levaduras, hay pocos informes sobre la caracterización de frataxina en organismos fotosintéticos. El mecanismo de ensamblado de los complejos Fe-S está relacionado con el metabolismo de lípidos. Las rutas metabólicas de carbohidratos y lípidos están también relacionadas ya que existe una competencia entre la síntesis de lípidos y almidón. En condiciones de estrés, el principal precursor de la síntesis de TAGs es el glicerol-3-fosfato (G3P), que se produce por catabolismo de la glucosa en el citosol (glucólisis). La degradación del almidón provee metabolitos para la producción de acetil-CoA, el cual es el precursor para la síntesis de ácidos grasos. Así en algunos casos una disminución de la degradación de almidón, podría bloquear la síntesis de lípidos. Otros autores informan que, en la mayoría de las microalgas, el almidón se acumula como fuente primaria de energía y reserva de carbono (C), mientras los lípidos sirven como un almacenamiento secundario. Teniendo esto en consideración nos planteamos estudiar si la modificación en las vías de ensamblaje de los complejos Fe-S afecta la producción de lípidos y otros componentes de las células. El conocimiento generado podría aplicarse al diseño de biomasa con fines energéticos y/o alimenticios. El primer objetivo de esta tesis fue realizar un análisis bioinformático e identificación de proteínas implicadas en la síntesis de grupos Fe-S en clorófitas. La búsqueda reveló una alta conservación de genes y proteínas involucrados en la síntesis de complejos Fe-S en las mitocondrias de algas. Muchas especies mostraron la presencia de múltiples genes y/o proteínas homólogas que pertenecerían a la vía ISC. En cambio, se observó una sola isoforma de las proteínas de la vía CIA en la mayoría de las algas analizadas, a excepción de Chlamydomonas reinhardtii. Como segundo objetivo de este trabajo se caracterizaron cepas de C. reinhardtii sobreexpresantes en frataxina. Para ello se obtuvieron cepas transformantes mediante electroporación y las mismas fueron denominadas CrFH1 (C. reinhardtii sobreexpresante de FH en citoplasma) y CrCOXFH15 (C. reinhardtii sobreexpresante de FH en mitocondria). Se observó que las algas que sobreexpresan frataxina presentan mayor crecimiento que las algas WT en presencia de Fe3+ y H2O2 agregados al medio. Estos resultados muestran que los mayores niveles de frataxina disminuyen la sensibilidad al estrés generado por la presencia de agentes oxidantes, evidenciando que frataxina cumple un rol protector frente al estrés oxidativo en algas. Además se observó que la línea transformante CrCoxFH15 acumula mayor cantidad de clorofila a, clorofila b y proteínas durante la fase exponencial con respecto a las líneas CrWT y CrFH1. Durante la fase estacionaria, se observó también un marcado aumento en la producción de triglicéridos en la línea sobreexpresante CrCoxFH15, demostrando que la sobreexpresión de frataxina dirigida a mitocondria incrementa la acumulación de lípidos en C. reinhardtii, reforzando la evidencia de la participación de frataxina en el metabolismo lipídico. El análisis de metabolitos intracelulares realizados por CG EM mostró un aumento significativo en el contenido alanina glicina, serina, prolina y de los aminoácidos esenciales isoleucina y leucina en las lineas CrCoxFH15 y CrFH1 respecto a la línea CrWT. Los valores son mayores cuando frataxina es expresada en mitocondria. Esto convierte a la línea CrCoxFH15 en una candidata para la obtención de productos utilizados como suplementos nutricionales para alimentación tanto animal como humana y bioestimulantes. Posteriormente, se evaluó el efecto de las líneas CrWT, CrFH1 y CrCoxFH15 sobre la germinación de semillas de soja. Los resultados mostraron que las semillas preincubadas en los extractos de algas transformantes presentaron brotes de mayor grosor y longitud, lo cual nos permite suponer que el mayor contenido de aminoácidos en las líneas transformantes aportaría una cantidad extra de nitrógeno que podría ser utilizada durante el desarrollo de la planta. Por otro lado, se evaluó también la transformación de algas las algas modelo N. gaditana y Chlorella sp. mediante electroporación y transformación mediada por Agrobacterium tumefaciens, pero no se logró la obtención de algas transformantes por ninguno de los métodos aplicados. Los estudios in silico realizados para llevar a cabo el tercer objetivo de este trabajo mostraron que las frataxinas de Ectocarpus siliculosus (EctsiFH), Nannochloropsis gaditana (NangaFH) y Chlorella vulgaris (ChlspFH) contienen un dominio frataxina conservado, confirmando así la gran similitud estructural que contienen los homólogos de frataxina entre sí. En los modelados obtenidos, se pudo observar que EctsiFH, NangaFH y ChlspFH poseen el dominio característico αβ sandwich de la familia de frataxinas. El análisis de homología de residuos involucrados en la unión a hierro muestra que existe un alto porcentaje de residuos conservados (62,5% para EctsiFH, 37,5% para NangaFH y 43,75% para ChlspFH) respecto a la CyaY de E.coli. Estas observaciones permiten suponer que estas proteínas son capaces de unir Fe. Al expresar EctsiFH en células de E. coli se observó que las mismas tenían una mayor capacidad de crecimiento en presencia de H2O2 Cd, Zn y Ni que el observado para las células wt. Este mismo comportamiento fue mostrado por células de E. coli que fueron suplementadas con NangaFH en presencia de H2O2 Cu, Zn, Cr. A diferencia de las otras dos, ChlspFH expresada en E. coli no aportó ninguna ventaja en presencia de H2O2, pero sí con Cu, Zn y Ni. Además, los experimentos in vitro demostraron que ChlspFH atenúa la reacción de Fenton en un 23% respecto al control (ausencia de ChlspFH), mientras que EctsiFH y NangaFH atenúan en menor proporción la reacción oxidativa. Estos resultados permiten suponer un rol protector de frataxina contra agentes oxidantes y de esta forma, su presencia podría atenuar los efectos del daño oxidativo.Ítem Embargo Articulación entre el procesamiento y la actividad de los microARNs(2024) Rosatti, Santiago; Palatnik, Javier F.; https://orcid.org/0000-0002-2526-1990Los miARNs son ARN pequeños de 20-22 nt, de codificación endógena. Son transcriptos por la ARN Polimerasa II en forma de transcriptos largos que se pliegan sobre sí mismos formando una estructura intracatenaria de tallo-burbuja de apareamiento imperfecto. Esta estructura contiene los determinantes necesarios para su reconocimiento y procesamiento por parte de DICER-LIKE1 (DCL1). El dúplex miARN/miARN* es liberado y una de estas hebras es seleccionada y cargada en ARGONAUTA1 (AGO1). El complejo AGO1-miARN es exportado al citoplasma donde es capaz de detectar al ARN blanco, al cual reconoce por complementariedad de bases. Este complejo puede regular post-transcripcionalmente la expresión génica bloqueando la transcripción o bien empleando la actividad endonucleolítica de AGO1, que corta al transcripto blanco entre las posiciones 10 y 11 del miARN. El procesamiento de los miARNs en plantas es diverso debido a las diferencias en la estructura de sus precursores (pri-miARN). El complejo DCL1 puede procesar estos pri-miARN de dos maneras: base-to-loop, cuando un tallo de 15-17 nucleótidos está por debajo del dúplex miARN/miARN*, o loop-to-base, cuando el tallo está por encima. Tras un primer corte, DCL1 realiza un segundo a 21 nucleótidos para liberar el dúplex miARN/miARN*. Este proceso puede completarse en dos cortes (procesamiento en dos pasos) o en varios cortes sucesivos (procesamiento secuencial) generando varios dúplex hasta liberar el ARN funcional con actividad biológica. En esta Tesis, en primer lugar, nos enfocamos en las estructuras de los dúplex miARN/miARN*, haciendo un análisis exhaustivo de la posición, identidad y cantidad de mismatches, y cómo la modificación de estos impactaba sobre la acumulación del miARN maduro. Además, comparamos este efecto teniendo en cuenta el mecanismo de procesamiento, y en última instancia la función biológica y la conservación evolutiva de los MIARNs. Nuestros hallazgos indican que la estructura del dúplex miARN/miARN* tiene un rol crucial para la acumulación del miARN maduro, dependiendo del mecanismo de procesamiento del precursor. Además, encontramos que la mayoría de los precursores de miARNs sufren un procesamiento sub-óptimo in vivo, que puede ser mejorado al ajustar los niveles de energía del miARN/miARN* en los MIARNs procesados en dos pasos. Sin embargo, los MIARNs secuenciales tienen diferentes requerimientos. Encontramos que el miARN/miARN*, que se genera en los dos últimos cortes de DCL1 es el dúplex más estable de todos los que se generan cuando estos precursores son procesados. En contraste, los otros ARN pequeños tienen varias bases desapareadas en su región central, lo que origina dúplex con bajas energías de interacción y niveles finales reducidos. Además, encontramos que los distintos roles regulatorios de los dúplex de miARN/miARN* en el procesamiento de los MIARNs se correlaciona con su conservación de secuencia a lo largo de la evolución. Luego, usando la información disponible en bibliotecas de ARN pequeños publicadas, analizamos cómo diferentes mutantes de la ruta de biogénesis de siARNs heterocromáticos afectan la acumulación de miARNs. Estos siARNs están involucrados en el silenciamiento génico transcripcional, ya que regulan la metilación del ADN genómico. Observamos que la supresión de la biogénesis de siARNs en mutantes como rdr2 y dcl234 provoca un desbalance en la acumulación de ciertos miARNs. Los miARNs con un 5’A terminal se acumulaban en mutantes de la ruta de los siARN heterocromáticos. En estas mutantes además se favorecía el aumento de la relación miARN/miARN* cuando el miARN* tenía un 5’A. Esta especificidad en la acumulación sugiere una competencia entre diferentes ARN pequeños por las proteínas AGO, que en ausencia de sus sustratos naturales, cargan otros ARN pequeños, como los miARNs con 5’A Un descubrimiento clave es la acumulación diferencial del miR319.2, derivado del precursor de MIR319, en las mutantes rdr2 y dcl234. Encontramos que el locus de MIR319a experimenta un aumento en la metilación en estas mutantes, lo que sugiere que el miR319.2 podría guiar a la maquinaria de metilación del ADN, vinculando así la regulación post-transcripcional y transcripcional. Complementariamente, el enriquecimiento de la proteína AGO4 en el locus de MIR319a refuerza la hipótesis de que este miARN podría desempeñar un papel importante en el silenciamiento génico dependiente de ARN. Proponemos que el miR319 tiene una función dual, actuando tanto en la regulación post-transcripcional como en la regulación transcripcional a través de la metilación del ADN en condiciones específicas de desarrollo o estrés. Finalmente, los conocimientos obtenidos en esta tesis no solo aportan nueva información sobre los mecanismos de procesamiento de miARNs, sino que también abren la puerta a aplicaciones biotecnológicas prometedoras. La posibilidad de ajustar los niveles específicos de miARN maduro modificando su estructura secundaria, así como el uso del precursor de miR319 como una herramienta para el silenciamiento génico transcripcional y post-transcripcional, permiten su aplicación en el diseño de miARNs artificiales destinados a regular la expresión de genes específicos, tanto en contextos de desarrollo como en respuesta al estrés, con un gran potencial para la mejora de cultivos.Ítem Embargo Roles biológicos de proteínas asociadas a neurodegeneración en células tumorales(2024) Zanotti, Lucía Camila; Menacho Márquez, Mauricio; Pérez, Ana R.El cáncer y las enfermedades neurodegenerativas representan una grave problemática sanitaria a nivel mundial ya que afectan a un gran número de personas en todo el planeta. Ambos grupos de enfermedades son el resultado de la interacción entre genes y factores ambientales. Sin embargo, la diferencia clave entre ambas radica en que los procesos biológicos característicos que conducen a estas patologías ocurren en sentido opuesto: en el cáncer se produce una división celular descontrolada mientras que, en las enfermedades neurodegenerativas, la principal manifestación es la muerte celular. Numerosos estudios han demostrado una relación directa entre la Enfermedad de Parkinson (EP), el segundo trastorno neurodegenerativo más frecuente a nivel mundial, y el desarrollo de melanoma; en particular, estudios epidemiológicos han evidenciado un mayor riesgo de desarrollar melanoma en personas con EP, y sorprendentemente, esta relación también se da en sentido inverso. Una posible conexión entre estas patologías radica en la alteración de las funciones de las sinucleínas, un grupo de proteínas neuronales que incluye alfa-, beta- y gamma-sinucleína (αS, βS y ɣS, respectivamente), implicadas tanto en cáncer como en neurodegeneración. En particular, ɣS ha mostrado estar asociada con el desarrollo de varios tipos de tumores, como el de mama, pulmón y próstata promoviendo la proliferación y la resistencia a la apoptosis, además de influir en la capacidad de las células tumorales para migrar e invadir otros tejidos. Esto sugiere que ɣS podría ser relevante en la progresión del cáncer por lo que está siendo investigada como un posible biomarcador para la detección temprana de la enfermedad. Sin embargo, hasta la fecha, no se ha investigado su papel en melanoma. Por ello, la presente tesis tiene como objetivo estudiar la función de ɣS en el desarrollo del melanoma, el cáncer de piel más mortal. A través de un enfoque integral que incluye estudios in silico, in vitro e in vivo, observamos que ɣS participa en procesos de proliferación, migración y adhesión celular, fundamentales en la progresión del melanoma. Modulando sus niveles endógenos en células de melanoma observamos que las vías de MAPK y PI3K/AKT se veían afectadas al cambiar su expresión. A su vez, demostramos que ɣS es capaz de formar fibrillas in vitro y que las células son capaces de incorporar la proteína cuando se le adiciona a su medio de cultivo. Estos resultados fueron corroborados en un modelo in vivo donde vimos que la disminución de los niveles de ɣS conducen a un menor crecimiento tumoral y a un menor número de metástasis mientras que, el pretratamiento con ɣS, aumentó el tamaño tumoral sin afectar el desarrollo de metástasis. Por último, mediante un abordaje in silico confirmamos que vías de señalización y procesos relacionados con la matriz extracelular, adhesión y migración celular están sobrerrepresentadas cuando cambian los niveles de ɣS en tumores de pacientes. Aunque estudios adicionales son necesarios para entender el mecanismo de acción de ɣS en melanoma, esta tesis sugiere su implicación activa en la progresión y malignidad del melanoma, estableciendo un fundamento para futuras investigaciones.Ítem Embargo Revalorización de descartes agroindustriales: producción de fructooligosacáridos (prebióticos) a partir de descartes de zanahoria(2024) Guerra, Laureana; Clementz, Adriana; Romanini, DianaEn Argentina se desecha un volumen de 80 a 100 toneladas diarias de zanahorias durante la época de cosecha (junio a diciembre), debido a que las mismas no cumplen con los estándares de calidad, forma y tamaño impuestos por el mercado consumidor. Sólo un 10-20% del descarte se aprovecha para la alimentación del ganado, mientras que el resto se vierte en campos cercanos donde se descompone a cielo abierto, generando proliferación de plagas, malos olores y gases de efecto invernadero. Al impacto negativo que esto tiene sobre el ambiente, se suman las graves pérdidas económicas para los productores y las consecuencias éticas y sociales asociadas al descarte de alimentos. Esta situación se repite en otras áreas productoras a nivel mundial. Las zanahorias descartadas poseen las mismas condiciones de madurez, frescura y características nutricionales que aquellas comercializadas. Además, son fuente de azúcares, carotenoides, pectinas, fibras, vitaminas y minerales, lo cual les otorga un enorme potencial de revalorización. Por otro lado, la creciente preferencia de los consumidores por alimentos más saludables ha estimulado el desarrollo de nuevos ingredientes que proporcionen mayores beneficios para la salud humana. En este contexto, en los últimos años ha tomado relevancia un grupo de prebióticos conocidos como fructooligosacáridos (FOS), capaces de estimular el crecimiento de la microbiota intestinal saludable (lactobacilos y bifidobacterias) y promover múltiples beneficios para la salud al ser consumidos regularmente. Los FOS pueden ser usados, además, como endulzantes de bajas calorías y reemplazantes de grasas y azúcares, por lo que son incorporados a una amplia gama de alimentos funcionales como bebidas, yogurts, barras de cereal y fórmulas infantiles. Estos prebióticos pueden sintetizarse a partir de la sacarosa mediante enzimas con actividad transfructosilasa (At) tales como β-fructofuranosidasa (FFasa. EC. 3.2.1.26) y fructosiltransferasa (FTasa. EC. 2.4.1.9). Dichas enzimas pueden producirse mediante fermentación en estado sólido (FES) utilizando descartes agroindustriales y microorganismos tales como hongos filamentosos, bacterias o levaduras. Este trabajo de tesis tuvo como objetivo principal la revalorización de descartes de zanahoria generados en la región para la obtención de una bebida prebiótica de zanahorias, con FOS sintetizados in situ mediante síntesis enzimática. Para cumplir con el objetivo general del proyecto, en primer lugar, se estudió la producción de enzimas con actividad FFasa mediante FES utilizando hongos filamentosos (A. niger y A. oryzae) y bagazo de zanahorias como sustrato. La máxima producción de FFasa (118 U/mL) se alcanzó utilizando A. niger como productor y suplementando el bagazo con un medio enriquecido en fuentes de nitrógeno tales como (NH4)2SO4, extracto de levadura y urea (MNtz). La enzima obtenida fue parcialmente purificada 12,5 veces, obteniéndose una fracción (FP1) con At específica de 59 Ut/mg. La misma fue identificada como βfructofuranosidasa, con un PM de 63,6 KDa y PI de 5,06. La enzima FFasa presente en (FP1) fue capaz de catalizar eficientemente la síntesis de FOS in situ en jugo de zanahorias, permitiendo la obtención de un jugo prebiótico con 50,4 g/L FOS. Finalmente, se evaluó la deshidratación del jugo prebiótico obtenido mediante secado spray. El máximo rendimiento (54%) se obtuvo utilizando maltodextrina como carrier en proporción 1:1 y jugo de 15°Bx. Los polvos obtenidos en estas condiciones mostraron características fisicoquímicas adecuadas y superaron las pruebas de aceptabilidad en el análisis sensorial cuantitativo descriptivo (QDA) y análisis sensorial hedónico. Se determinó que la temperatura de secado óptima para obtener el máximo rendimiento y conservación de compuestos de interés (FOS y β-carotenos), así como características fisicoquímicas adecuadas en el polvo era 140°C. Este trabajo aporta un conocimiento valioso para la revalorización de residuos de zanahoria mediante su transformación en un producto con alto valor nutricional y comercial. También abre las puertas para ampliar el estudio de la producción de FOS en el país, utilizando diversos descartes agroindustriales.Ítem Embargo Estudio de la respuesta a patógenos en cultivares de Solanum tuberosum L. de interés agronómico. Empleo de biocontroladores como estrategia de protección a la enfermedad(2023) Martínez, María Florencia; Martin, Ana Paula; Marano, María RosaEn esta Tesis, se aborda exhaustivamente la problemática de las enfermedades virales que impactan en cultivos agronómicos, resultando en pérdidas significativas en rendimiento y en calidad fitosanitaria. Se destaca la intrincada red de señalización que las plantas activan en respuesta a los patógenos, siendo determinante para establecer su resistencia o susceptibilidad. La resistencia, caracterizada por la inhibición de la replicación y el movimiento intercelular del patógeno viral, con frecuencia se acompaña de una respuesta hipersensible (HR) que implica la muerte celular programada en el sitio de la infección. En plantas susceptibles, los síntomas de la enfermedad no están restringidos espacialmente. La activación del sistema inmunitario en las plantas se configura como una tarea fundamental para salvaguardar los cultivos frente al ataque del patógeno. Previamente, se determinó que la proteína de movimiento de 25 kDa del virus X de la papa (PVX) cepa ROTH1 (25K1) actúa como efector viral en la HR mediada por Nb en las hojas de S. tuberosum cv. Pentland (genotipo Nb), y su regulación está bajo la influencia del ácido salicílico (AS). En este trabajo se profundizó el estudio de esta interacción mediante la evaluación integral del papel de los microARNs y sus secuencias blanco, identificando los principales procesos biológicos involucrados. Además, se caracterizó la respuesta de defensa de cultivares de papa locales frente a PVX y Phytophthora infestans, siendo este último también un patógeno importante de la papa, mediante el uso de herramientas moleculares. Se resalta la importancia de comprender y mejorar la resistencia de las plantas a través de estudios integrales. Asimismo, se exploró la actividad bioprotectora del extracto acuoso de romero (EAR). Los resultados demostraron que el EAR reduce los síntomas, la multiplicación y diseminación del patógeno cuando se aplica antes de la inoculación. En conclusión, este trabajo integral aborda la respuesta de las plantas, en especial ante patógenos virales, desde la perspectiva molecular hasta la implementación práctica de medidas bioprotectoras, como el uso de extractos naturales, ofreciendo así una contribución valiosa para la protección de los cultivos agrícolas.Ítem Embargo Desarrollo de una plataforma para la producción de enzimas recombinantes de interés industrial en gram-positivos(2024) Lacava, Franco Emanuel; Aguirre, Andrés; Cerminati, SebastiánEl aceite crudo de soja requiere de un tratamiento exhaustivo para alcanzar los estándares exigidos tanto para el consumo humano como para la producción de biodiesel. Durante este tratamiento, el aceite se somete a un proceso de desgomado con el objetivo de reducir el contenido de fosfolípidos presentes. Existen tres métodos principales de desgomado: desgomado acuoso, desgomado ácido y desgomado enzimático. Este último se caracteriza por el uso de fosfolipasas del tipo C (PLC) para hidrolizar los fosfolípidos presentes, generando diacilglicéridos y productos solubles en agua. Este proceso tiene como principal ventaja que permite hidrolizar cerca del 90 % de los fosfolípidos presentes. Además, supone un aumento en el rendimiento del proceso, ya que los diacilglicéridos generados se reparten en la fase oleosa, incrementando su volumen. Finalmente, si se compara con el desgomado acuoso, el volumen de las gomas es menor y, por consiguiente, el contenido de aceite atrapado en ellas también lo es. El presente trabajo de Tesis se llevó a cabo en un laboratorio especializado en la producción de enzimas recombinantes destinadas al tratamiento de aceites y subproductos de la industria oleoquímica. Previo al inicio de esta investigación, en dicho laboratorio se había logrado desarrollar un cóctel enzimático conformado por dos fosfolipasas de tipo C y una glicerofosfolípido-colesterol acil transferasa, que permitía la hidrólisis eficaz de los fosfolípidos presentes en el aceite crudo de soja. Sin embargo, a pesar de la eficacia del cóctel, su principal desventaja era la manufactura de dos de sus tres enzimas en Escherichia coli, un microorganismo no secretor. Esto elevaba significativamente los costos de producción y presentaba un obstáculo para la viabilidad comercial del producto. Por lo tanto, surgió la necesidad de buscar un microorganismo gram-positivo secretor que permita la expresión de las fosfolipasas presentes en el cóctel enzimático. Empleando el microorganismo gram-positivo secretor Corynebacterium glutamicum, se evaluaron siete secuencias que codifican para enzimas con actividad PIPLC. Dos de las siete enzimas fueron producidas exitosamente en el medio extracelular y su expresión se evaluó posteriormente en cultivos de alta densidad celular. Debido a la concentración obtenida, se decidió seguir trabajando con la PI-PLC de Streptomyces antibioticus (PI-PLCSa1). Dicha enzima se caracterizó en aceite, donde se optimizó tiempo de reacción, temperatura de reacción y dosis mínima. La misma presentó una actividad especifica 33 veces superior a la PI-PLC que formaba parte del cóctel enzimático desarrollado previamente en el laboratorio. Paralelamente, se llevó a cabo la producción de la enzima PC-PLCBc en C. glutamicum y se comprobó que el cóctel enzimático así conformado permite la hidrólisis completa de los fosfolípidos PC, PE y PI, sin la necesidad del agregado de la glicerofosfolípido-colesterol acil transferasa. A pesar de estos muy buenos resultados, surgió la necesidad de la búsqueda de otro microorganismo grampositivo secretor debido a que las fermentaciones de C. glutamicum carecían de reproducibilidad y presentaban el inconveniente de la constante formación de espuma cuando se alcanzaban altas densidades celulares. Para superar dicho inconveniente, se optó por evaluar a Bacillus licheniformis como microorganismo productor. Se llevaron a cabo una serie de mutaciones en el genoma con el objetivo de obtener una cepa chasis para la producción de proteínas heterólogas. Para ello, se realizaron deleciones en genes que codifican para proteasas extracelulares, factores de transcripción que regulan el proceso de esporulación, genes involucrados en la síntesis de pigmentos, autolisinas, profagos y genes que codifican para proteínas abundantes en el secretoma de B. licheniformis. Utilizando un promotor constitutivo doble, se evaluaron distintos sitios de integración para el gen que codifica para la enzima PI-PLCSa1 y se construyeron cepas productoras con tres copias en el genoma del gen que codifica para la enzima PI-PLCSa1 y dos copias del gen que codifica para la enzima PC-PLCBc. Dichas cepas se evaluaron posteriormente en cultivos de alta densidad celular, consiguiendo rendimientos similares o superiores a los obtenidos con C. glutamicum utilizando un plásmido con alto número de copias. Finalmente, se llevó a cabo el escalado del proceso de producción de la enzima PI-PLCSa1 en la planta de la empresa Keclon SA ubicada en la ciudad de San Lorenzo. Se llevó a cabo una fermentación de 15.000 litros iniciales, obteniéndose 3,4 g/L de la enzima de interés al final del proceso y 2.065 litros de una formulación con una concentración final de 11,6 g/L de PI-PLCSa1.Ítem Embargo Obtención, identificación y caracterización del mecanismo de acción de compuestos bioactivos con acción antibacteriana(2024) Casal, Alejo; García Véscovi, Eleonora; Furlán, Ricardo Luis EugenioSalmonella es un género de bacilos gramnegativos y anaerobios facultativos perteneciente a la familia Enterobacteriaceae. Estas bacterias son responsables de diversas enfermedades en humanos y animales, que van desde gastroenteritis y fiebre entérica hasta bacteriemia e infecciones localizadas, además de poder estar presentes en estado de portador asintomático. El tipo de infección varía según el serotipo de Salmonella y las características del hospedador. En este proyecto, se trabajó con Salmonella enterica serovar Typhimurium, un serotipo que puede infectar a una variedad de hospedadores y causar gastroenteritis en humanos, ganado, caballos y otros animales. La infección por Salmonella generalmente ocurre a través de la ingesta de agua o alimentos contaminados. Las bacterias que logran sobrevivir al ambiente ácido del estómago y competir exitosamente con la microbiota intestinal, pueden colonizar el intestino delgado. En casos de gastroenteritis, las bacterias suelen permanecer en el tracto intestinal, gracias a la acción de células del sistema inmunológico, como los neutrófilos, lo que permite que la enfermedad sea autolimitada en adultos inmunocompetentes. Sin embargo, cuando la infección se vuelve sistémica, las bacterias son fagocitadas por los macrófagos intestinales y posteriormente diseminadas a través del sistema retículo-endotelial. Las bacterias tienen una notable capacidad de adaptarse a una amplia gama de condiciones ambientales, lo que se debe en gran medida a la regulación flexible de su vasto reservorio genético. Los sistemas de dos componentes (TCS) juegan un papel crucial en la transducción de señales, conectando estímulos externos con respuestas adaptativas específicas. Un TCS típico consta de dos proteínas conservadas: una histidina quinasa (HQ) y una proteína reguladora de respuesta (RR). La HQ actúa como sensor de cambios ambientales, como variaciones en la concentración de iones, pH o la presencia de moléculas específicas. Al detectar estos estímulos, la HQ se autofosforila en un residuo de histidina y transfiere el grupo fosfato a un residuo de aspartato en la RR. La RR, una vez fosforilada, regula la expresión de genes específicos, permitiendo que la bacteria ajuste su comportamiento y sobreviva en condiciones cambiantes. El sistema de dos componentes PhoP/PhoQ en Salmonella Typhimurium está compuesto por la histidina quinasa PhoQ y el regulador de respuesta PhoP. Este sistema responde a diversas señales ambientales a las que la bacteria se enfrenta durante su ciclo de vida dentro del hospedador, como la disponibilidad de Mg²⁺, la presencia de péptidos catiónicos antimicrobianos (CAMPs), ácidos grasos insaturados de cadena larga, y un pH ácido. Como mecanismo de adaptación, PhoP/PhoQ regula la expresión de genes que participan en la homeostasis de magnesio, la modificación del lipopolisacárido (LPS) para resistir a los CAMPs y la tolerancia al pH ácido. Además, controla la expresión de dos sistemas de secreción tipo III codificados en las islas de patogenicidad I y II, necesarios para el ingreso, supervivencia y proliferación dentro de células fagocíticas y no fagocíticas. La Organización Mundial de la Salud ha identificado a las bacterias resistentes a antibióticos como una de las mayores amenazas para la salud mundial. Estas bacterias causan infecciones difíciles de tratar debido a la disminución de la eficacia de los tratamientos disponibles, lo que prolonga las hospitalizaciones, incrementa los costos médicos y aumenta las tasas de mortalidad. Entre las principales causas del desarrollo de resistencias se encuentran el mal uso generalizado y el uso excesivo de antibióticos en la medicina y la industria alimentaria. En este contexto, las cepas de Salmonella resistentes a fluoroquinolonas se encuentran entre las bacterias prioritarias para el desarrollo de nuevas terapias. Los genes de virulencia en Salmonella son esenciales para causar infección, pero no son indispensables para la viabilidad de la bacteria. Por tanto, los fármacos que puedan inhibir la patogenicidad sin afectar los genes esenciales podrían reducir la aparición de mecanismos de resistencia. Dado que PhoP/PhoQ es un regulador clave de la virulencia en Salmonella, y que los sistemas de dos componentes no están presentes en mamíferos, este sistema se presenta como un objetivo prometedor para el desarrollo de nuevos antimicrobianos. La colistina, un antibiótico reservado para tratar infecciones graves causadas por bacterias gramnegativas resistentes, se utiliza en situaciones críticas debido a su eficacia contra patógenos como Pseudomonas aeruginosa y Klebsiella pneumoniae. Sin embargo, su uso está restringido debido al aumento de la resistencia, lo que ha impulsado la investigación de combinaciones con otros antibióticos, como rifampicina y carbapenemes, para mejorar la eficacia y reducir la resistencia. Las codrogas o adyuvantes de antibióticos pueden potenciar la actividad de los antibióticos y prevenir el desarrollo de resistencia, aprovechando sinergias entre fármacos para obtener una eficacia superior a la suma de sus efectos individuales. Esto resulta en una muerte celular más rápida y una menor probabilidad de aparición de resistencia. En este contexto, el desarrollo de fármacos que potencien el efecto antibacteriano de la colistina es especialmente valioso. En la primera parte de este trabajo, se implementó una estrategia para identificar compuestos producidos por bacterias del género Streptomyces que pudieran dirigirse selectivamente a la actividad del sistema de transducción de señales de dos componentes PhoP/PhoQ, clave en la patogenicidad de Salmonella. Las bacterias del género Streptomyces son conocidas por ser una fuente importante de compuestos con actividad antibiótica. Tras realizar el screening, se descubrió que la azomicina, un nitroimidazol secretado naturalmente por S. eurocidicus, inhibe específicamente la actividad del sistema PhoP/PhoQ tanto en medios ricos como mínimos, y además reprime in vivo la replicación intramacrofágica de Salmonella. Aunque los nitroimidazoles ya son conocidos por su actividad antimicrobiana frente a bacterias y parásitos, este estudio reporta por primera vez una actividad antivirulenta de la azomicina a concentraciones subletales. La azomicina no interfirió con el efecto inhibidor del Mg2+ cuando se añadieron simultáneamente al medio de crecimiento de Salmonella, lo que sugiere un mecanismo de acción distinto. Además, estos resultados indican que su acción es reversible e independiente de PhoQ, apuntando a que el regulador de respuesta PhoP podría ser el blanco principal de la azomicina. A pesar de que el mecanismo de acción antibacteriano de los nitroimidazoles no está completamente dilucidado, se cree que estos fármacos se activan por la reducción de su grupo nitro, un proceso favorecido en condiciones anaeróbicas. En este estudio, se demostró que el grupo nitro es indispensable para que la azomicina ejerza su acción inhibitoria sobre PhoP, aunque se descartó que actúe como un agente inductor de estrés oxidativo. El valor de IC50 estimado fue de 3,59 µg/ml (31,79 μM), lo cual es consistente con la concentración necesaria para superar las barreras impuestas por la envoltura bacteriana y alcanzar PhoP en el citoplasma. Además, se evaluó el efecto de la azomicina en la reducción de la letalidad de la infección por Salmonella en el organismo modelo Galleria mellonella. Los resultados mostraron que la administración de azomicina logró reducir la mortalidad en un 48% en comparación con el grupo control, lo que sugiere un potencial terapéutico significativo en la mitigación de la virulencia de Salmonella. Es destacable que la azomicina inhibiera la expresión génica regulada por PhoP en S. Typhimurium, S. Dublin y S. Enteritidis, mientras que concentraciones equivalentes no tuvieron efecto sobre el sistema PhoP/PhoQ en S. marcescens o E. coli. Esto sugiere que la azomicina no alteraría este sistema de señalización en otras enterobacterias, lo cual representa una ventaja significativa, ya que su acción se limitaría al patógeno objetivo sin afectar la microbiota del huésped. En resumen, esta primera parte de la tesis revela el potencial de la azomicina para ser reposicionada como una novedosa terapia antivirulenta contra infecciones por Salmonella. Asimismo, nuestros resultados destacan la eficacia de un enfoque de detección para identificar compuestos antivirulentos derivados de fuentes naturales. En la segunda parte de esta tesis, se evaluó una serie de compuestos sintéticos, que consistía en 1,2,3-ditiazoles y benzenosulfonamidas. Los ditiazoles APM007 y APM014 sobresalieron por su capacidad para inhibir la virulencia de Salmonella Typhimurium al interferir con el sistema de dos componentes PhoP/PhoQ, sin comprometer la viabilidad celular del patógeno, lo que los posiciona como inhibidores potenciales de la virulencia de este organismo. Estos compuestos se seleccionaron tras un riguroso proceso de selección en tres etapas, donde se evaluó su efecto sobre genes reporteros dependientes de PhoP/PhoQ y su selectividad hacia este sistema. Los resultados obtenidos indican que, aunque estos ditiazoles parecen dirigirse a la proteína sensora PhoQ, lo hacen mediante un mecanismo de acción diferente a los cationes divalentes, especialmente el Mg2+. Además, se observó que su efecto inhibidor es menos pronunciado en condiciones reductoras del periplasma, a través de un mecanismo dependiente de la proteína de membrana MgrB, reguladora del sistema PhoP/PhoQ. Es importante destacar que, en los ensayos realizados, los ditiazoles no mostraron citotoxicidad sobre macrófagos y lograron alcanzar las bacterias intracelulares, inhibiendo la proliferación intramacrofágica de Salmonella de manera dependiente de PhoP/PhoQ. Esto sugiere que estos compuestos podrían bloquear un paso clave en la infección sistémica, confiriéndoles un considerable potencial terapéutico. Además, se demostró que los ditiazoles actúan como potenciadores de la colistina, lo que sugiere su utilidad como coadyuvantes en el tratamiento de infecciones por Salmonella, incluidas aquellas provocadas por cepas resistentes de relevancia clínica. En conjunto, los resultados de esta segunda parte sugieren que los ditiazoles pueden inhibir selectivamente la virulencia de Salmonella sin afectar su viabilidad celular, lo que representa una alternativa prometedora para el desarrollo de nuevos fármacos que retrasen el surgimiento de la resistencia bacteriana. Además, su uso como adyuvantes de colistina posiciona a los ditiazoles APM007 y APM014 como compuestos de gran interés para el desarrollo de nuevas estrategias terapéuticas contra infecciones bacterianas. En resumen, se identificaron y caracterizaron tres compuestos relevantes: la azomicina de origen natural y los ditiazoles sintéticos APM007 y APM014. Estos resultados subrayan la importancia de mantener una perspectiva amplia en la búsqueda de compuestos activos con potencial uso terapéutico. En un contexto donde la resistencia bacteriana es creciente, se vuelve esencial adoptar enfoques innovadores que amplíen el abanico de búsqueda, considerando tanto fuentes naturales como sintéticas y explorando diferentes mecanismos de acción. Este enfoque integrado puede abrir nuevas vías para el desarrollo de terapias efectivas contra patógenos multirresistentes.Ítem Embargo Caracterización del rol fisiológico de la enzima FabH en micobacterias: impacto en la síntesis de lípidos y viabilidad(2024) Savoretti, Franco; Gago, GabrielaLa tuberculosis continúa siendo una de las enfermedades infecciosas que provoca la mayor cantidad de muertes entre los adultos a nivel mundial. Mycobacterium tuberculosis es el agente etiológico de la tuberculosis y el éxito de este patógeno se debe en gran medida a su notable capacidad para sobrevivir en el huésped infectado, donde puede persistir durante varias décadas; siendo su inusual pared celular un factor clave en esta supervivencia. Los ácidos micólicos son los componentes mayoritarios de su envoltura celular y aportan a las características distintivas de esta bacteria, como son, su patogenicidad y su alta resistencia a los antibióticos comúnmente utilizados en la clínica. La biosíntesis de los ácidos micólicos involucra dos sintasas de ácidos grasos (FAS) diferentes, denominadas FAS I y FAS II. FAS I realiza la síntesis de novo de ácidos grasos, mientras que el sistema FAS II elonga los productos de FAS I. El producto del sistema FAS II es el meromicolil-ACP, uno de los sustratos utilizados para la síntesis de ácidos micólicos. Mediante una reacción de condensación entre el meromicolil-ACP y un acil-CoA producido por el sistema FAS I se forman los ácidos micólicos. Los componentes de esta vía han sido estudiados en profundidad no sólo por su relevancia para la síntesis de los ácidos micólicos, ácidos grasos de membrana, lípidos de reserva y lípidos complejos, sino también por ser el blanco de las principales drogas antituberculosas utilizadas para combatir la enfermedad. Sin embargo, aún hay componentes de esta vía que no han sido descriptos en profundidad. Este es el caso del paso metabólico que conecta a ambos sistemas FAS, es decir, la introducción de los productos del sistema FAS I en la vía FAS II. Es por esto que en esta tesis nos centramos en el estudio del rol fisiológico de la enzima FabH. Esta enzima es la única postulada hasta el momento con el rol de interconectar a los sistemas FAS. FabH cataliza una reacción de condensación entre un acil-CoA, producido por el sistema FAS I, con malonil-ACP para dar lugar a un βcetoacil-ACP. El producto de reacción de la enzima FabH inicia la síntesis en el sistema FAS II, por lo tanto, el rol postulado para FabH sería tomar los productos de FAS I para introducirlos e iniciar la síntesis en el sistema FAS II. Luego de varios ciclos de elongación en el sistema FAS II se da lugar a la cadena meromicolato, que junto con un acil-CoA proveniente del sistema FAS I, dan lugar a los ácidos micólicos. Por lo tanto, la enzima FabH tiene un rol clave en la síntesis de los ácidos micólicos, siendo un punto de unión entre ambos sistemas FAS. La función de la enzima FabH fue estudiada previamente por otros grupos de investigación mediante ensayos in vitro y también mediante la obtención de la estructura cristalográfica de la proteína unida a su sustrato. Sin embargo, hasta el momento no se ha estudiado in vivo el rol de FabH en la síntesis de ácidos micólicos. Por esta razón, en esta tesis construimos una cepa mutante ΔfabH en la cepa avirulenta Mycobacterium tuberculosis H37Ra. Confirmamos que la enzima FabH tiene un rol en la síntesis de ácidos micólicos, que se evidenció como una leve disminución en la síntesis de ácidos micólicos en la cepa ΔfabH. Además, la cepa ΔfabH es más sensible que la cepa salvaje al estrés ácido en medio sólido y líquido y a los compuestos isoniacida y cerulenina en medio sólido. No obstante, el gen no resultó ser esencial para el crecimiento de M. tuberculosis H37Ra in vitro y a pesar de la leve disminución observada en la síntesis de ácidos micólicos, la cepa mutante fue capaz de sintetizar estos componentes clave de la envoltura. Este resultado indicaría que existiría una vía o proteína alternativa a FabH capaz de iniciar la síntesis de la cadena meromicolato en el sistema FAS II que permite sostener la síntesis de ácidos micólicos. Para responder a esta hipótesis, realizamos un experimento de proteómica cuantitativa mediante LC-MS/MS, con el objetivo de identificar alguna proteína o vía cuya expresión se viera alterada en la cepa ΔfabH. En este ensayo encontramos que los niveles de la proteína EchA6 estaban aumentados 3.6 veces en la cepa ΔfabH. En un reporte previo realizado por otro grupo de investigación, se demostró que una cepa mutante en echA6 resultó ser deficiente en la síntesis de ácidos micólicos. Además, mediante doble híbrido se vio que EchA6 interacciona con KasA, una enzima del sistema FAS II, y que es capaz de unir acil-CoAs de cadena larga, el mismo sustrato que utiliza la enzima FabH. La combinación de nuestros resultados con este reporte nos condujo a hipotetizar que la enzima KasA podría tomar acil-CoAs de EchA6, de manera alternativa a su sustrato natural los acilAcpM, y de esta manera iniciar la síntesis en el sistema FAS II. En el análisis proteómico también encontramos que varias enzimas relevantes para la síntesis de lípidos complejos y triacilglicéridos se encontraron disminuidas en la cepa ΔfabH, sugiriendo un reordenamiento en el metabolismo de lípidos más global. Entre estas se encuentran cuatro enzimas triacilglicérido sintasa y cinco enzimas (MbtC, FadD26, FadD29, FadD21, y Ag85B) involucradas en la síntesis de distintos lípidos complejos, importantes tanto para la composición de la envoltura como para la patogenicidad de M. tuberculosis. La cepa ΔfabH posee alteraciones fenotípicas, como son la mayor sensibilidad al estrés ácido y la leve disminución en la síntesis de ácidos micólicos. Además, en el análisis proteómico se vio una disminución en la abundancia de enzimas implicadas en la síntesis de lípidos importantes para la patogenicidad. Por todo esto, creemos que una cepa mutante ΔfabH en M. tuberculosis H37Rv es una excelente candidata para la obtención de una cepa atenuada para la virulencia. Para evaluar si la proteína EchA6 tiene un rol en la síntesis de ácidos micólicos, utilizando la herramienta CRISPRi construimos las cepas echA6KD y ΔfabH-echA6KD, en las cuales los niveles de expresión de echA6 son reprimidos ante el agregado de anhidrotetraciclina. En primer lugar, observamos que EchA6 no es esencial para la viabilidad de M. tuberculosis H37Ra, a diferencia de lo reportado para la proteína de M. bovis BCG. Además, al analizar la síntesis de ácidos micólicos en ambas cepas mediante cromatografía en capa delgada, pudimos concluir que la proteína EchA6 no estaría implicada en la síntesis de ácidos micólicos en M. tuberculosis H37Ra en las condiciones estudiadas. Por lo tanto, a pesar de los esfuerzos realizados en este trabajo de tesis por buscar algún mecanismo alternativo a FabH por el cual se inicie la síntesis de la cadena meromicolato en el sistema FAS II, esta pregunta aún continúa abierta. A pesar de que los componentes de los sistemas FAS I y FAS II están ampliamente estudiados, la interconexión entre estos dos sistemas aún no está totalmente descripta. Además, la leve disminución observada para la síntesis de ácidos micólicos en la cepa ΔfabH no corresponde con el rol que se le asigna a FabH, como la única enzima que interconecta a los sistemas FAS I y FAS II. A partir de los resultados de esta tesis podemos concluir entonces que aún existen componentes no identificados en el modelo de síntesis de ácidos micólicos y, por lo tanto, es necesario profundizar los estudios respecto al mecanismo que interconecta ambos sistemas FAS para coordinar la síntesis de ácidos grasos y ácidos micólicos.Ítem Embargo Desarrollo de novedosas metodologías de elucidación estructural basadas en cálculos computacionales de RMN(2024) Marcarino, Maribel Oriana; Sarotti, Ariel Marcelo; Zanardi, María MartaLa necesidad de descubrir nuevas moléculas con valiosas propiedades ha motorizado el avance de diferentes ramas de la química, desde la tradicional exploración de productos naturales hasta los enfoques más recientes de síntesis orientada a la diversidad. El descubrimiento de fármacos, productos naturales, agroquímicos, catalizadores u otros compuestos de interés es un proceso complejo y costoso en el cual convergen diferentes áreas del conocimiento, que dependen de cada caso particular. Si bien tradicionalmente estas etapas se realizan de forma experimental, en años recientes los métodos computacionales se han ido integrando a este esfuerzo multidisciplinario posibilitando no sólo un mejor entendimiento del sistema en estudio sino también una considerable reducción de tiempos y costos. Tan grande ha sido el impacto logrado que en la actualidad muchas de estas herramientas se han transformado en indispensables para ciertos campos disciplinares. Sin embargo, quedan muchos retos que afrontar, los mismos que estimulan la innovación y el mejoramiento de métodos que permitan combinar de forma sinérgica y multidisciplinar las fortalezas que ofrecen diferentes áreas del conocimiento. Así surge la química cuántica como una disciplina que se extiende más allá de los límites tradicionales que separan la química, la física, la biología y la ciencia de la computación; permitiendo la investigación del comportamiento de la materia a nivel molecular mediante un sistema de ordenadores, cuando la investigación de laboratorio sea inapropiada, poco práctica o imposible. La gran capacidad predictiva de la química cuántica podría transformarse en una herramienta de pronóstico y evaluación extraordinariamente más poderosa al incorporar elementos de inteligencia artificial o aprendizaje autónomo (machine learning). El empleo de estas técnicas disruptivas permite analizar bases de datos y detectar patrones de comportamiento entre variables calculables o medibles con propiedades o actividades químicas o biológicas de interés, y en base a ellos poder realizar predicciones sobre nuevos casos. En la presente Tesis Doctoral propone abordar el estudio y desarrollo de herramientas que faciliten el descubrimiento de nuevas moléculas orgánicas valiosas mediante una combinación de métodos experimentales con simulaciones cuánticas de bajo costo computacional y sofisticados métodos estadísticos y de inteligencia artificial. La incorporación de estas técnicas a menudo desconectadas entre sí permitirá brindar nuevas estrategias para aportar soluciones innovadoras a problemas desafiantes y complejos.Ítem Embargo Estudio y aplicación de lodos biológicos de origen industrial para la biorremediación de hidrocarburos: análisis de las comunidades microbianas y de los bioprocesos degradativos involucrados en la eliminación del diésel(2024) Olivera, Camila; Salvatierra, Lucas Matías; Pérez, Leonardo MartínA pesar del crecimiento de las energías renovables, el petróleo y el gas natural continúan siendo las principales fuentes de energía a nivel global, representando cerca del 80% del consumo total. Las actividades asociadas a su extracción, refinación y transporte generan grandes volúmenes de residuos contaminantes, siendo los hidrocarburos (HC) una de las principales causas de contaminación de suelos y aguas. En particular, el diésel representa un contaminante frecuente debido a su uso extendido en múltiples sectores. Frente a esta problemática, la biorremediación —un proceso basado en el uso del metabolismo microbiano para degradar contaminantes— se posiciona como una alternativa eficiente, económica y sustentable frente a los métodos físico-químicos tradicionales. Esta puede implementarse mediante bioestimulación o bioaumentación, siendo esta última especialmente útil cuando las comunidades microbianas nativas no presentan capacidad degradadora suficiente. En esta Tesis se estudió la aplicabilidad de lodos residuales de alta carga bacteriológica, provenientes de digestores anaeróbicos, para la biorremediación de hidrocarburos del diésel. Precedidos por una detallada explicación de la metodología experimental, los resultados obtenidos permitieron analizar cambios en la eficiencia de biodegradación, como así también de la actividad metabólica y estructura de la comunidad microbiana bajo distintas condiciones operativas, origen del inóculo y sistema de escalado. Durante los años de trabajo de doctorado se destinó un gran esfuerzo al diseño y mejora de los sistemas experimentales, al mismo tiempo que a la incorporación de herramientas de química analítica, microbiología, biología molecular y bioinformática. Con un primer estudio que buscó evaluar la capacidad del consorcio microbiano del lodo para degradar diésel comercial en medio líquido. Los resultados fueron satisfactorios, respaldando la formulación de las hipótesis y la presentación del plan de Tesis doctoral. La separación entre la fase acuosa (medio con microorganismos) y orgánica (diésel comercial en fase libre) obligó a un replanteo experimental. Para sortear este efecto, se comenzaron a realizar ensayos en peceras de unos 3 litros, llenas de arena saturada de humedad por el agregado del lodo, pero sin líquido libre en la superficie. Estos cambios incrementaron notablemente la eficiencia de degradación. El resultado de estas modificaciones, luego de varios intentos e iteraciones, fueron plasmados en la construcción de sistemas a escala piloto de aproximadamente 200 litros. Paralelamente, y para poder estudiar simultáneamente múltiples variables, se procedió a reducir la escala, llevándola nuevamente al laboratorio. Se emplearon así tubos estériles de polipropileno de 50 ml, rellenos de arena sin saturación de fase líquida libre. El uso de arena permitió resultados semejantes con una manipulación mucho más simple. Para poder llevar adelante mediciones periódicas, cada determinación se llevó a cabo a partir del contenido total de un tubo reactor. De esta forma, una misma condición bajo estudio involucró muchas unidades individuales preparadas de idéntica manera. Al momento de realizar un análisis, un tubo del set era retirado al azar y utilizado para tal fin, mientras sus idénticos continuaban el ensayo hasta que les tocase su turno. Todo este recorrido, permitió obtener un sistema experimental robusto y óptimo para el seguimiento de la degradación de los hidrocarburos bajo distintas condiciones y en forma simultánea, resolviendo la complejidad del muestreo estadístico de un gran reactor voluminoso. Estos sistemas permitieron, entre otras cosas, verificar la capacidad de degradación de diésel de 5 inóculos provenientes de diversos biodigestores. La caracterización de la estructura de la comunidad bacteriana y sus modificaciones brindaron un remarcable fortalecimiento de las discusiones y conclusiones obtenidas.Ítem Embargo Aislamiento e identificación de biocontroladores autóctonos de cepas fitopatógenas(2024) Santone, Antonella; Campos Bermúdez, Valeria Alina; Spampinato, Claudia P.El uso de los microorganismos como agentes de control biológico (ACBs) para prevenir o controlar enfermedades causadas por la infección de patógenos en las plantas cultivadas es una alternativa sustentable que ha mostrado ser efectiva en un amplio número de especies vegetales. Los mecanismos de acción de dichos microorganismos se basan en la competencia por los nutrientes o el espacio, la producción de antibióticos o la activación de mecanismos de resistencia en la planta. Ampliar el conocimiento de los modos de acción de diferentes hongos y bacterias que presentan efecto antagónico sobre otros microorganismos permitiría generar productos de control biológico (CB) más eficientes para proteger a las especies de interés agronómico contra las enfermedades producidas por los fitopatógenos. Asimismo, existen ACBs que poseen la capacidad de aumentar la biodisponibilidad de nutrientes del suelo, conduciendo a un incremento en la biomasa de la planta y en el rendimiento del cultivo. Por lo tanto, la aplicación de microorganismos con capacidad para actuar como biocontroladores y al mismo tiempo, para promover el crecimiento vegetal (PGP, del inglés, plant growth promotor) representaría una alternativa eficiente al uso de agroquímicos. Las especies del género Trichoderma se han estudiado ampliamente como microorganismos beneficiosos para las plantas y representan las especies de hongos más utilizadas para el CB y para la PGP. Considerando la diversidad de los mecanismos de acción de Trichoderma y sus diferentes roles ecológicos, es de interés en este trabajo de tesis evaluar el efecto protector inducido por distintas cepas y especies de Trichoderma frente a fitopatógenos con diferentes estrategias de ataque y estudiar la capacidad de PGP y los compuestos involucrados. El presente trabajo se enfoca, por un lado, al estudio de la respuesta de defensa desencadenada en Arabidopsis thaliana a partir de la colonización de las raíces por Trichoderma. Para ello, se evaluó la protección contra el ataque de un patógeno biotrófico como es Pseudomonas syringae y contra uno de tipo necrotrófico como es Botrytis cinerea, mediante el análisis de la expresión diferencial de genes de defensa durante el priming en Arabidopsis thaliana. Los resultados obtenidos demuestran que Trichoderma activaría tanto las vías del ácido salicílico (SA) como del ácido jasmónico (JA) y del etileno (ET), desencadenando así una respuesta de defensa en A. thaliana contra patógenos con diferentes estilos de vida. Por otro lado, se llevó a cabo una selección de cepas nativas mediante distintos ensayos de CB y de PGP y se evaluó la interacción de dichas cepas con dos especies vegetales de interés agrícola: soja (Glycine max (L.) Merrill) y tomate (Solanum lycopersicum) a través de ensayos in planta. Se encontró una cepa nativa de Trichoderma con capacidad de proteger al cultivo de soja contra el cancro del tallo, enfermedad causada por el hongo Diaporthe phaseolorum y de promover el crecimiento y el rendimiento del tomate. Estos resultados comprenden las bases para el desarrollo futuro de productos bioactivos o bioinoculantes a partir de esta cepa de Trichoderma, lo que representaría una alternativa sustentable a la aplicación de agroquímicos.Ítem Embargo Sistemas micelares biocompatibles formados por surfactantes sintéticos y biológicos: formulación, análisis y aplicaciones(2024) Martini, Georgina; Pellegrini Malpiedi, Luciana; Bustillo, SoledadEl presente trabajo de tesis se centró en el desarrollo y caracterización fisicoquímica de nuevas formulaciones de micelas mixtas biocompatibles, formadas por biosurfactantes (BS) y surfactantes (SF) sintéticos no iónicos. Inicialmente, se estudiaron las propiedades fisicoquímicas y aplicaciones de un extracto de BS del tipo lipopéptidos (LP) producido por Pseudomonas syringae pv. tabaci (PTA) en un biorreactor con columna de fraccionamiento de espumas. Tras 14 h de fermentación, se obtuvo un índice de emulsificación (IE) del 63% y una concentración de BS de 550 mg/L. La concentración micelar crítica (CMC) fue de 1.844,68 mg/L, reduciendo la tensión superficial a 30,07 mN/m. Al estudiar el efecto del pH en soluciones acuosas de citrato de sodio (NaCit), se observó una disminución significativa en la CMC, la cual disminuyó hasta 863,20 mg/L en pH 5,00 y hasta 341,98 mg/L en pH 7,00. El diámetro hidrodinámico (Dh) de los autoensamblados formados fue de 87,63 nm en agua, incrementando su valor hasta 173 nm en presencia de NaCit. Las emulsiones formadas con hidrocarburos mostraron una estabilidad superior al 90% después de 24 horas. Posteriormente, se abordó la formulación y caracterización fisicoquímica de sistemas micelares mixtos combinando surfactantes sintéticos (SF) como Tergitol 15-S-7 (Tg7) y Genapol X-080 (GX) con biosurfactantes (BS) como ramnolípidos (RL) comerciales y extracto de LP producido en nuestro laboratorio. Se encontró que la CMC de Tg7 y GX en agua fue de 18,23 mg/L y 21,14 mg/L, respectivamente. Ambos valores disminuyeron en presencia de aniones comsmotrópicos como el NaCit. Al combinar los SF con BS, se observó sinergia en los sistemas con LP, mientras que los sistemas con RL mostraron interacciones desfavorables. Se determinó la concentración necesaria para reducir la tensión superficial en 20 mN/m (C20), con valores de 13,75 mg/L para Tg7 y 10,55 mg/L para GX en agua, mejorando en medios con NaCit y en sistemas con LP. El análisis hidrodinámico mostró un aumento en el Dh de las micelas con el pH y la presencia de NaCit, indicando la formación de estructuras más asimétricas en ambientes de alta fuerza iónica. En cuanto al potencial zeta (ζ), la adición de RL aumentó la carga negativa en pH 7,00. En cambio, los LP no modificaron significativamente el ζ. Finalmente, las curvas de coexistencia para la separación de fases revelaron que los sistemas en NaCit a pH 7,00 alcanzaron las temperaturas de separación de fase más bajas, lo que, junto con la presencia de LP, favoreció la separación de fases a menores temperaturas, lo que puede ser útil en procesos de extracción de biomoléculas y aplicaciones industriales sostenibles. En una tercera etapa, se exploró el uso de sistemas micelares de dos fases acuosas (SMDFA) para la extracción de biomoléculas, específicamente tocoferoles (TF) y el colorante azul cibacron (AC), empleando combinaciones de SF sintéticos (Tg7 y GX) y BS (RL y LP). Los resultados mostraron que los valores de coeficiente de reparto (Kr) para AC en SMDFA sin BS fueron mayores a 5, con preferencia por la fase superior rica en micelas. La adición de RL y LP mostró efectos distintos en la extracción de AC, siendo el extracto de LP el que presentó menor eficacia, probablemente debido a su composición química. Un diseño factorial 2³ identificó las mejores condiciones extractivas para los TF, que consistieron en utilizar Tg7 al 9% p/p y RL al 0,25% p/p en NaCit 100 mM a pH 5,00 y 56°C, logrando una recuperación casi completa de TF en la fase superior, con alta actividad antioxidante. Además, se compararon dos metodologías de recuperación de TF de desodorizado de soja: saponificación modificada seguida de extracción con SMDFA y saponificación convencional seguida de extracción con solventes. La saponificación modificada seguida de extracción con SMDFA superó al método convencional, alcanzando un índice de acidez de 1,44% y una recuperación de γ-tocoferol del 91,98% en la fase superior micelar. Además, se obtuvo una alta eficiencia de asociación (94% para α-tocoferol), sugiriendo que los SMDFA también pueden mejorar la estabilidad y biodisponibilidad de los TF. Finalmente, se evaluó la citotoxicidad y actividad antimicrobiana de los SF Tg7, GX y el extracto de LP de PTA en células eucariotas y bacterianas. En células C2C12, Tg7 y GX demostraron baja citotoxicidad a concentraciones menores de 0,05 mg/mL, mientras que el extracto LP no fue citotóxico hasta 5 mg/mL. En mezclas de surfactantes, el efecto citotóxico se atribuyó a las mayores concentraciones de Tg7 y GX. Además, se observó que el extracto LP indujo necrosis celular, confirmado mediante pruebas de morfología y liberación de LDH. En cuanto a su potencial antitumoral, el LP inhibió en un 58% la adhesión de células tumorales LM3 y en un 37% su migración, sugiriendo que puede obstaculizar la propagación de células cancerígenas. Los ensayos antimicrobianos mostraron inhibición significativa de Staphylococcus aureus con el extracto LP y otros surfactantes, mientras que no hubo actividad inhibitoria contra Escherichia coli. Estos resultados evidencian la baja citotoxicidad y el potencial del extracto LP como agente antimicrobiano y antitumoral en distintas aplicaciones biotecnológicas.