Caracterización del rol fisiológico de la enzima FabH en micobacterias: impacto en la síntesis de lípidos y viabilidad

La tuberculosis continúa siendo una de las enfermedades infecciosas que provoca la mayor cantidad de muertes entre los adultos a nivel mundial. Mycobacterium tuberculosis es el agente etiológico de la tuberculosis y el éxito de este patógeno se debe en gran medida a su notable capacidad para sobrevivir en el huésped infectado, donde puede persistir durante varias décadas; siendo su inusual pared celular un factor clave en esta supervivencia. Los ácidos micólicos son los componentes mayoritarios de su envoltura celular y aportan a las características distintivas de esta bacteria, como son, su patogenicidad y su alta resistencia a los antibióticos comúnmente utilizados en la clínica. La biosíntesis de los ácidos micólicos involucra dos sintasas de ácidos grasos (FAS) diferentes, denominadas FAS I y FAS II. FAS I realiza la síntesis de novo de ácidos grasos, mientras que el sistema FAS II elonga los productos de FAS I. El producto del sistema FAS II es el meromicolil-ACP, uno de los sustratos utilizados para la síntesis de ácidos micólicos. Mediante una reacción de condensación entre el meromicolil-ACP y un acil-CoA producido por el sistema FAS I se forman los ácidos micólicos. Los componentes de esta vía han sido estudiados en profundidad no sólo por su relevancia para la síntesis de los ácidos micólicos, ácidos grasos de membrana, lípidos de reserva y lípidos complejos, sino también por ser el blanco de las principales drogas antituberculosas utilizadas para combatir la enfermedad. Sin embargo, aún hay componentes de esta vía que no han sido descriptos en profundidad. Este es el caso del paso metabólico que conecta a ambos sistemas FAS, es decir, la introducción de los productos del sistema FAS I en la vía FAS II. Es por esto que en esta tesis nos centramos en el estudio del rol fisiológico de la enzima FabH. Esta enzima es la única postulada hasta el momento con el rol de interconectar a los sistemas FAS. FabH cataliza una reacción de condensación entre un acil-CoA, producido por el sistema FAS I, con malonil-ACP para dar lugar a un βcetoacil-ACP. El producto de reacción de la enzima FabH inicia la síntesis en el sistema FAS II, por lo tanto, el rol postulado para FabH sería tomar los productos de FAS I para introducirlos e iniciar la síntesis en el sistema FAS II. Luego de varios ciclos de elongación en el sistema FAS II se da lugar a la cadena meromicolato, que junto con un acil-CoA proveniente del sistema FAS I, dan lugar a los ácidos micólicos. Por lo tanto, la enzima FabH tiene un rol clave en la síntesis de los ácidos micólicos, siendo un punto de unión entre ambos sistemas FAS. La función de la enzima FabH fue estudiada previamente por otros grupos de investigación mediante ensayos in vitro y también mediante la obtención de la estructura cristalográfica de la proteína unida a su sustrato. Sin embargo, hasta el momento no se ha estudiado in vivo el rol de FabH en la síntesis de ácidos micólicos. Por esta razón, en esta tesis construimos una cepa mutante ΔfabH en la cepa avirulenta Mycobacterium tuberculosis H37Ra. Confirmamos que la enzima FabH tiene un rol en la síntesis de ácidos micólicos, que se evidenció como una leve disminución en la síntesis de ácidos micólicos en la cepa ΔfabH. Además, la cepa ΔfabH es más sensible que la cepa salvaje al estrés ácido en medio sólido y líquido y a los compuestos isoniacida y cerulenina en medio sólido. No obstante, el gen no resultó ser esencial para el crecimiento de M. tuberculosis H37Ra in vitro y a pesar de la leve disminución observada en la síntesis de ácidos micólicos, la cepa mutante fue capaz de sintetizar estos componentes clave de la envoltura. Este resultado indicaría que existiría una vía o proteína alternativa a FabH capaz de iniciar la síntesis de la cadena meromicolato en el sistema FAS II que permite sostener la síntesis de ácidos micólicos. Para responder a esta hipótesis, realizamos un experimento de proteómica cuantitativa mediante LC-MS/MS, con el objetivo de identificar alguna proteína o vía cuya expresión se viera alterada en la cepa ΔfabH. En este ensayo encontramos que los niveles de la proteína EchA6 estaban aumentados 3.6 veces en la cepa ΔfabH. En un reporte previo realizado por otro grupo de investigación, se demostró que una cepa mutante en echA6 resultó ser deficiente en la síntesis de ácidos micólicos. Además, mediante doble híbrido se vio que EchA6 interacciona con KasA, una enzima del sistema FAS II, y que es capaz de unir acil-CoAs de cadena larga, el mismo sustrato que utiliza la enzima FabH. La combinación de nuestros resultados con este reporte nos condujo a hipotetizar que la enzima KasA podría tomar acil-CoAs de EchA6, de manera alternativa a su sustrato natural los acilAcpM, y de esta manera iniciar la síntesis en el sistema FAS II. En el análisis proteómico también encontramos que varias enzimas relevantes para la síntesis de lípidos complejos y triacilglicéridos se encontraron disminuidas en la cepa ΔfabH, sugiriendo un reordenamiento en el metabolismo de lípidos más global. Entre estas se encuentran cuatro enzimas triacilglicérido sintasa y cinco enzimas (MbtC, FadD26, FadD29, FadD21, y Ag85B) involucradas en la síntesis de distintos lípidos complejos, importantes tanto para la composición de la envoltura como para la patogenicidad de M. tuberculosis. La cepa ΔfabH posee alteraciones fenotípicas, como son la mayor sensibilidad al estrés ácido y la leve disminución en la síntesis de ácidos micólicos. Además, en el análisis proteómico se vio una disminución en la abundancia de enzimas implicadas en la síntesis de lípidos importantes para la patogenicidad. Por todo esto, creemos que una cepa mutante ΔfabH en M. tuberculosis H37Rv es una excelente candidata para la obtención de una cepa atenuada para la virulencia. Para evaluar si la proteína EchA6 tiene un rol en la síntesis de ácidos micólicos, utilizando la herramienta CRISPRi construimos las cepas echA6KD y ΔfabH-echA6KD, en las cuales los niveles de expresión de echA6 son reprimidos ante el agregado de anhidrotetraciclina. En primer lugar, observamos que EchA6 no es esencial para la viabilidad de M. tuberculosis H37Ra, a diferencia de lo reportado para la proteína de M. bovis BCG. Además, al analizar la síntesis de ácidos micólicos en ambas cepas mediante cromatografía en capa delgada, pudimos concluir que la proteína EchA6 no estaría implicada en la síntesis de ácidos micólicos en M. tuberculosis H37Ra en las condiciones estudiadas. Por lo tanto, a pesar de los esfuerzos realizados en este trabajo de tesis por buscar algún mecanismo alternativo a FabH por el cual se inicie la síntesis de la cadena meromicolato en el sistema FAS II, esta pregunta aún continúa abierta. A pesar de que los componentes de los sistemas FAS I y FAS II están ampliamente estudiados, la interconexión entre estos dos sistemas aún no está totalmente descripta. Además, la leve disminución observada para la síntesis de ácidos micólicos en la cepa ΔfabH no corresponde con el rol que se le asigna a FabH, como la única enzima que interconecta a los sistemas FAS I y FAS II. A partir de los resultados de esta tesis podemos concluir entonces que aún existen componentes no identificados en el modelo de síntesis de ácidos micólicos y, por lo tanto, es necesario profundizar los estudios respecto al mecanismo que interconecta ambos sistemas FAS para coordinar la síntesis de ácidos grasos y ácidos micólicos.