Obtención, identificación y caracterización del mecanismo de acción de compuestos bioactivos con acción antibacteriana

Salmonella es un género de bacilos gramnegativos y anaerobios facultativos perteneciente a la familia Enterobacteriaceae. Estas bacterias son responsables de diversas enfermedades en humanos y animales, que van desde gastroenteritis y fiebre entérica hasta bacteriemia e infecciones localizadas, además de poder estar presentes en estado de portador asintomático. El tipo de infección varía según el serotipo de Salmonella y las características del hospedador. En este proyecto, se trabajó con Salmonella enterica serovar Typhimurium, un serotipo que puede infectar a una variedad de hospedadores y causar gastroenteritis en humanos, ganado, caballos y otros animales. La infección por Salmonella generalmente ocurre a través de la ingesta de agua o alimentos contaminados. Las bacterias que logran sobrevivir al ambiente ácido del estómago y competir exitosamente con la microbiota intestinal, pueden colonizar el intestino delgado. En casos de gastroenteritis, las bacterias suelen permanecer en el tracto intestinal, gracias a la acción de células del sistema inmunológico, como los neutrófilos, lo que permite que la enfermedad sea autolimitada en adultos inmunocompetentes. Sin embargo, cuando la infección se vuelve sistémica, las bacterias son fagocitadas por los macrófagos intestinales y posteriormente diseminadas a través del sistema retículo-endotelial. Las bacterias tienen una notable capacidad de adaptarse a una amplia gama de condiciones ambientales, lo que se debe en gran medida a la regulación flexible de su vasto reservorio genético. Los sistemas de dos componentes (TCS) juegan un papel crucial en la transducción de señales, conectando estímulos externos con respuestas adaptativas específicas. Un TCS típico consta de dos proteínas conservadas: una histidina quinasa (HQ) y una proteína reguladora de respuesta (RR). La HQ actúa como sensor de cambios ambientales, como variaciones en la concentración de iones, pH o la presencia de moléculas específicas. Al detectar estos estímulos, la HQ se autofosforila en un residuo de histidina y transfiere el grupo fosfato a un residuo de aspartato en la RR. La RR, una vez fosforilada, regula la expresión de genes específicos, permitiendo que la bacteria ajuste su comportamiento y sobreviva en condiciones cambiantes. El sistema de dos componentes PhoP/PhoQ en Salmonella Typhimurium está compuesto por la histidina quinasa PhoQ y el regulador de respuesta PhoP. Este sistema responde a diversas señales ambientales a las que la bacteria se enfrenta durante su ciclo de vida dentro del hospedador, como la disponibilidad de Mg²⁺, la presencia de péptidos catiónicos antimicrobianos (CAMPs), ácidos grasos insaturados de cadena larga, y un pH ácido. Como mecanismo de adaptación, PhoP/PhoQ regula la expresión de genes que participan en la homeostasis de magnesio, la modificación del lipopolisacárido (LPS) para resistir a los CAMPs y la tolerancia al pH ácido. Además, controla la expresión de dos sistemas de secreción tipo III codificados en las islas de patogenicidad I y II, necesarios para el ingreso, supervivencia y proliferación dentro de células fagocíticas y no fagocíticas. La Organización Mundial de la Salud ha identificado a las bacterias resistentes a antibióticos como una de las mayores amenazas para la salud mundial. Estas bacterias causan infecciones difíciles de tratar debido a la disminución de la eficacia de los tratamientos disponibles, lo que prolonga las hospitalizaciones, incrementa los costos médicos y aumenta las tasas de mortalidad. Entre las principales causas del desarrollo de resistencias se encuentran el mal uso generalizado y el uso excesivo de antibióticos en la medicina y la industria alimentaria. En este contexto, las cepas de Salmonella resistentes a fluoroquinolonas se encuentran entre las bacterias prioritarias para el desarrollo de nuevas terapias. Los genes de virulencia en Salmonella son esenciales para causar infección, pero no son indispensables para la viabilidad de la bacteria. Por tanto, los fármacos que puedan inhibir la patogenicidad sin afectar los genes esenciales podrían reducir la aparición de mecanismos de resistencia. Dado que PhoP/PhoQ es un regulador clave de la virulencia en Salmonella, y que los sistemas de dos componentes no están presentes en mamíferos, este sistema se presenta como un objetivo prometedor para el desarrollo de nuevos antimicrobianos. La colistina, un antibiótico reservado para tratar infecciones graves causadas por bacterias gramnegativas resistentes, se utiliza en situaciones críticas debido a su eficacia contra patógenos como Pseudomonas aeruginosa y Klebsiella pneumoniae. Sin embargo, su uso está restringido debido al aumento de la resistencia, lo que ha impulsado la investigación de combinaciones con otros antibióticos, como rifampicina y carbapenemes, para mejorar la eficacia y reducir la resistencia. Las codrogas o adyuvantes de antibióticos pueden potenciar la actividad de los antibióticos y prevenir el desarrollo de resistencia, aprovechando sinergias entre fármacos para obtener una eficacia superior a la suma de sus efectos individuales. Esto resulta en una muerte celular más rápida y una menor probabilidad de aparición de resistencia. En este contexto, el desarrollo de fármacos que potencien el efecto antibacteriano de la colistina es especialmente valioso. En la primera parte de este trabajo, se implementó una estrategia para identificar compuestos producidos por bacterias del género Streptomyces que pudieran dirigirse selectivamente a la actividad del sistema de transducción de señales de dos componentes PhoP/PhoQ, clave en la patogenicidad de Salmonella. Las bacterias del género Streptomyces son conocidas por ser una fuente importante de compuestos con actividad antibiótica. Tras realizar el screening, se descubrió que la azomicina, un nitroimidazol secretado naturalmente por S. eurocidicus, inhibe específicamente la actividad del sistema PhoP/PhoQ tanto en medios ricos como mínimos, y además reprime in vivo la replicación intramacrofágica de Salmonella. Aunque los nitroimidazoles ya son conocidos por su actividad antimicrobiana frente a bacterias y parásitos, este estudio reporta por primera vez una actividad antivirulenta de la azomicina a concentraciones subletales. La azomicina no interfirió con el efecto inhibidor del Mg2+ cuando se añadieron simultáneamente al medio de crecimiento de Salmonella, lo que sugiere un mecanismo de acción distinto. Además, estos resultados indican que su acción es reversible e independiente de PhoQ, apuntando a que el regulador de respuesta PhoP podría ser el blanco principal de la azomicina. A pesar de que el mecanismo de acción antibacteriano de los nitroimidazoles no está completamente dilucidado, se cree que estos fármacos se activan por la reducción de su grupo nitro, un proceso favorecido en condiciones anaeróbicas. En este estudio, se demostró que el grupo nitro es indispensable para que la azomicina ejerza su acción inhibitoria sobre PhoP, aunque se descartó que actúe como un agente inductor de estrés oxidativo. El valor de IC50 estimado fue de 3,59 µg/ml (31,79 μM), lo cual es consistente con la concentración necesaria para superar las barreras impuestas por la envoltura bacteriana y alcanzar PhoP en el citoplasma. Además, se evaluó el efecto de la azomicina en la reducción de la letalidad de la infección por Salmonella en el organismo modelo Galleria mellonella. Los resultados mostraron que la administración de azomicina logró reducir la mortalidad en un 48% en comparación con el grupo control, lo que sugiere un potencial terapéutico significativo en la mitigación de la virulencia de Salmonella. Es destacable que la azomicina inhibiera la expresión génica regulada por PhoP en S. Typhimurium, S. Dublin y S. Enteritidis, mientras que concentraciones equivalentes no tuvieron efecto sobre el sistema PhoP/PhoQ en S. marcescens o E. coli. Esto sugiere que la azomicina no alteraría este sistema de señalización en otras enterobacterias, lo cual representa una ventaja significativa, ya que su acción se limitaría al patógeno objetivo sin afectar la microbiota del huésped. En resumen, esta primera parte de la tesis revela el potencial de la azomicina para ser reposicionada como una novedosa terapia antivirulenta contra infecciones por Salmonella. Asimismo, nuestros resultados destacan la eficacia de un enfoque de detección para identificar compuestos antivirulentos derivados de fuentes naturales. En la segunda parte de esta tesis, se evaluó una serie de compuestos sintéticos, que consistía en 1,2,3-ditiazoles y benzenosulfonamidas. Los ditiazoles APM007 y APM014 sobresalieron por su capacidad para inhibir la virulencia de Salmonella Typhimurium al interferir con el sistema de dos componentes PhoP/PhoQ, sin comprometer la viabilidad celular del patógeno, lo que los posiciona como inhibidores potenciales de la virulencia de este organismo. Estos compuestos se seleccionaron tras un riguroso proceso de selección en tres etapas, donde se evaluó su efecto sobre genes reporteros dependientes de PhoP/PhoQ y su selectividad hacia este sistema. Los resultados obtenidos indican que, aunque estos ditiazoles parecen dirigirse a la proteína sensora PhoQ, lo hacen mediante un mecanismo de acción diferente a los cationes divalentes, especialmente el Mg2+. Además, se observó que su efecto inhibidor es menos pronunciado en condiciones reductoras del periplasma, a través de un mecanismo dependiente de la proteína de membrana MgrB, reguladora del sistema PhoP/PhoQ. Es importante destacar que, en los ensayos realizados, los ditiazoles no mostraron citotoxicidad sobre macrófagos y lograron alcanzar las bacterias intracelulares, inhibiendo la proliferación intramacrofágica de Salmonella de manera dependiente de PhoP/PhoQ. Esto sugiere que estos compuestos podrían bloquear un paso clave en la infección sistémica, confiriéndoles un considerable potencial terapéutico. Además, se demostró que los ditiazoles actúan como potenciadores de la colistina, lo que sugiere su utilidad como coadyuvantes en el tratamiento de infecciones por Salmonella, incluidas aquellas provocadas por cepas resistentes de relevancia clínica. En conjunto, los resultados de esta segunda parte sugieren que los ditiazoles pueden inhibir selectivamente la virulencia de Salmonella sin afectar su viabilidad celular, lo que representa una alternativa prometedora para el desarrollo de nuevos fármacos que retrasen el surgimiento de la resistencia bacteriana. Además, su uso como adyuvantes de colistina posiciona a los ditiazoles APM007 y APM014 como compuestos de gran interés para el desarrollo de nuevas estrategias terapéuticas contra infecciones bacterianas. En resumen, se identificaron y caracterizaron tres compuestos relevantes: la azomicina de origen natural y los ditiazoles sintéticos APM007 y APM014. Estos resultados subrayan la importancia de mantener una perspectiva amplia en la búsqueda de compuestos activos con potencial uso terapéutico. En un contexto donde la resistencia bacteriana es creciente, se vuelve esencial adoptar enfoques innovadores que amplíen el abanico de búsqueda, considerando tanto fuentes naturales como sintéticas y explorando diferentes mecanismos de acción. Este enfoque integrado puede abrir nuevas vías para el desarrollo de terapias efectivas contra patógenos multirresistentes.