Alteración del transporte hepatocanalicular en la colestasis por estrógenos: papel de las especies reactivas del oxígeno

El metabolito endógeno del estradiol, el estradiol 17β-D-glucurónido (E17G), es considerado el principal responsable de la colestasis intrahepática del embarazo. El E17G altera la actividad de transportadores canaliculares, como la proteína asociada a resistencia a multidrogas 2 (Mrp2), a través de una internalización celular dependiente de la activación de distintas vías de señalización. Este fenómeno también se ha atribuido al estrés oxidativo en diferentes condiciones colestásicas experimentales. Sin embargo, aunque se ha avanzado considerablemente en el entendimiento de los mecanismos que participan en la colestasis por estrógenos, aún no existen reportes que involucren al estrés oxidativo en esta patología. Por lo tanto, el objetivo de este trabajo de tesis consiste en analizar la implicancia de las especies reactivas del oxígeno (ROS) en la colestasis por E17G, su origen, y las vías de señalización involucradas en el proceso de endocitosis del transportador Mrp2. Utilizando el modelo in vitro de duplas aisladas de hepatocitos de rata y el cultivo primario de hepatocitos de rata en configuración sándwich demostramos que compuestos antioxidantes previnieron la alteración de la actividad de Mrp2 inducida por E17G, siendo esta alteración igualmente prevenida por el inhibidor de la NADPH oxidasa (NOX) apocinina. En el modelo de hígado aislado y perfundido, el compuesto antioxidante N-acetilcisteína (NAC) previno el deterioro del flujo biliar y de la actividad de Mrp2 inducidos por E17G, confirmando así la participación de ROS en esta colestasis. En conclusión, la colestasis inducida por E17G está parcialmente mediada por ROS generados por NOX a través de la internalización de transportadores canaliculares como Mrp2, siendo ERK1/2 y p38MAPK necesarias para la activación de NOX. Asimismo, se utilizó el cultivo primario de hepatocitos para evidenciar que el pretratamiento con inhibidores específicos de la proteína kinasa regulada por señal extracelular 1/2 (ERK1/2) y de la proteína kinasa activada por mitógenos p38 (p38MAPK) inhibió la producción de ROS inducida por E17G. Mediante western blot, se demostró que la inhibición de NOX no afectó la fosforilación de ERK1/2 y p38MAPK. Ambos hallazgos sugieren que sería necesaria la activación de estas dos quinasas para que ocurra la activación de NOX. Además, tanto el silenciamiento de p47phox (subunidad reguladora citosólica de NOX) mediante ARNi, como la preincubación con apocinina en el cultivo de hepatocitos en configuración sándwich previnieron significativamente la internalización de Mrp2 inducida por E17G, lo que sugiere un papel crucial de NOX en este fenómeno.