Modulación de transportadores ABC hepáticos por prolactina en un modelo murino de obesidad e insulino-resistencia

El hígado es el órgano más importante en la metabolización de compuestos endógenos y exógenos. Los mismos son captados por los transportadores de la membrana basolateral del hepatocito, sufren luego reacciones de óxido-reducción e hidroxilaciones (reacciones de fase I) y reacciones de conjugación (reacciones de fase II) para aumentar su polaridad, facilitar su excreción y eventualmente disminuir su toxicidad. Los metabolitos son eliminados del hepatocito por vía apical a través de proteínas transportadoras específicas, pertenecientes a la familia de los ATP Binding Cassette (ABC), que incluye a la Glicoproteína P (PGP), Proteína asociada a resistencia a multidrogas 2 (MRP2) y la Proteína de resistencia al cáncer de mama (BCRP). La prolactina (PRL) es una hormona polipeptídica sintetizada principalmente por las células lactotropas de la adenohipófisis y está involucrada en múltiples funciones en el organismo, tanto fisiológicas (lactancia, reproducción, crecimiento y desarrollo, metabolismo) como patológicas (alteraciones en inmunidad y carcinogénesis). Las acciones de la PRL están mediadas por su receptor transmembrana, PRLR, el cual pertenece a la superfamilia de receptores de citoquinas y se encuentra expresado en diferentes tejidos: hígado, hipotálamo, pulmones, corazón, adipocitos, páncreas, estómago, intestino, riñón, bazo, ovario, glándula mamaria, etc. La vía clásica de señalización por PRL implica la unión de la hormona a su receptor predimerizado induciendo un cambio conformacional que conduce a la activación de Janus quinasa-2 (JAK-2) que fosforila residuos de tirosina en el dominio citoplasmático del receptor, seguido por el reclutamiento y fosforilación del factor de transcripción STAT5, un miembro de la familia de factores de transcripción Signal Transducers and activator of transcription. Este factor fosforilado se disocia del receptor, se dimeriza y se transloca al núcleo, activando la transcripción de genes diana. Vías alternativas que involucran la activación de proteínas quinasas (PI3K/AKT y MAPK) también han sido descritas. Generalmente, estas vías median la respuesta proliferativa y la diferenciación celular inducida por PRL. La obesidad resulta de la pérdida progresiva de la homeostasis entre el control de la ingesta de alimentos y el gasto de energía; la misma está altamente asociada con la resistencia a la insulina y constituye un factor de riesgo para el desarrollo de patologías como la diabetes mellitus tipo 2. El alto consumo de hidratos de carbono y/o grasas es uno de los principales factores ambientales que contribuyen a la actual epidemia mundial de obesidad. La obesidad y la resistencia a la insulina se encuentran generalmente acompañadas por un estado inflamatorio, caracterizado por un aumento en los niveles de citoquinas proinflamatorias tanto en la circulación como en los tejidos, así como por variaciones en los niveles séricos de distintas hormonas, entre ellas la PRL y la leptina. El hecho de que los niveles plasmáticos de PRL, entre los de otras hormonas, se encuentren alterados en diferentes modelos de obesidad e insulino-resistencia, sumado al aumento de interleuquinas pro-inflamatorias, sugieren la posible existencia de alteraciones en los sistemas de biotransformación y transportadores ABC en dichos modelos, con la consiguiente alteración del metabolismo y/o excreción biliar de compuestos que son sustratos, lo que conlleva a potenciales consecuencias sobre su eficacia y/o toxicidad. Se ha reportado que los niveles de PRL pueden encontrarse disminuidos o sin cambios en diferentes modelos de obesidad. Debido a esta discrepancia, nos propusimos evaluar los niveles de esta hormona en nuestro modelo de obesidad e insulino-resistencia inducido por una dieta rica en grasas (High Fat Diet, HFD) y evaluar cómo se encuentran los transportadores ABC hepáticos. Luego de 16 semanas de HFD los niveles plasmáticos de PRL en ratones C57BL/6 se encontraron aumentados significativamente, al igual que la expresión proteica de los transportadores PGP y BCRP en fracciones hepáticas enriquecidas en membrana canalicular. Además, para BCRP, también se evidenció un aumento a nivel de expresión de su mensajero (Abcg2). Asimismo, evaluamos el nivel de expresión del ARN mensajero para el receptor de PRL (Prlr), encontrándose aumentado significativamente en el grupo alimentado con HFD. Para evaluar si esos cambios en los transportadores se debían a la PRL, utilizamos bromocriptina (Brc), un agonista D2 dopaminérgico, que actúa sobre los receptores D2 de la hipófisis inhibiendo la secreción de PRL. En estos experimentos de inhibición corroboramos que los niveles plasmáticos de PRL en el grupo HFD se vieron disminuidos luego del tratamiento con Brc, observándose también una concomitante disminución en la expresión de los transportadores BCRP y PGP, sugiriendo que la PRL sería responsable, al menos en parte, del aumento de los niveles de expresión de dichos transportadores en el modelo de HFD. Se sabe que la expresión del gen Abcg2, que codifica para el transportador BCRP, es regulado transcripcionalmente por PRL a través de la vía que involucra a STAT5 en diferentes tipos celulares, pero se desconoce qué sucede en hígado. Por esta razón continuamos profundizando el estudio para conocer más sobre el mecanismo de acción de PRL sobre este transportador en hígado. Realizamos un análisis in silico para determinar la presencia de sitios putativos capaces de unir a STAT5 en el promotor de BCRP en hígado de ratón adulto, encontrando uno para STAT5b. Esto, sumado al hecho de que la dieta aumenta la translocación de STAT5 al núcleo, efecto que es contrarrestado por el uso de bromocriptina, nos sugiere que este factor de transcripción podría estar actuando en la modulación de BCRP hepático por PRL. Para confirmar la activación de STAT5 analizamos la expresión de algunos targets del mismo, como BCL-2 y BCL-xL, obteniendo una expresión proteica significativamente aumentada luego de la dieta, corrigiéndose este aumento con el uso de bromocriptina. Además, se observó el mismo comportamiento para el nivel de expresión del mensajero para el receptor de PRL, otro blanco de este factor de transcripción. Estos resultados en conjunto nos sugieren que la PRL modula la expresión de BCRP a través de una de sus vías canónicas mediadas por STAT5. El cuadro de obesidad e insulino-resistencia se caracteriza por un estado inflamatorio, donde los niveles de citoquinas pro-inflamatorias circulantes y en tejidos se encuentran aumentados y donde el tejido adiposo juega un papel central. En otros modelos de alteraciones inflamatorias, como el inducido por LPS que conduce al aumento de citoquinas como IL-1, IL-6 y TNF-, las cuales se sabe que son capaces de modular la expresión y actividad de transportadores hepáticos, particularmente IL-1 y TNF- up regulan la expresión de PGP, mientras que IL-6 la disminuye. Dado que en nuestro modelo no sólo está aumentada la PRL sino también el nivel de las citoquinas proinflamatorias IL-1 IL-6 y TNF- circulante y además como se ha descripto un efecto hipoglucemiante de la bromocriptina, evaluamos si los cambios observados en estos transportadores se deben a la modulación por PRL del componente hormonal e inflamatorio, o si esta hormona tiene un efecto directo sobre el hepatocito, teniendo en cuenta que su receptor se encuentra aumentado en hígado. Utilizando un modelo in vitro observamos el efecto directo de PRL sobre el hepatocito, encontrando un aumento tanto de proteína como ARNm de BCRP luego del tratamiento con la hormona, corroborando el efecto observado in vivo. El efecto de los altos de niveles de PRL sobre los transportadores se observó incluso luego del aislamiento en hepatocitos de ratones que recibieron la HFD. En distintos modelos de obesidad, la expresión del transportador canalicular BCRP se encuentra aumentada y la de otros transportadores hepáticos están modificadas, afectando a la disponibilidad y excreción biliar de sus sustratos. Para atenuar o contrarrestar los efectos que trae consigo la obesidad (hiperglicemia, hiperinsulinemia, hipertensión, dislipidemia, entre otros) los pacientes obesos reciben múltiples fármacos. La problemática reside en que la dosificación de los mismos basada en el peso o volumen corporal de los pacientes, puede no ser satisfactoria en términos de seguridad o eficacia para este grupo de pacientes. Para estimar in vivo la relevancia de las alteraciones de BCRP por PRL en nuestro modelo, realizamos un estudio de la depuración de glibenclamida, sustrato modelo del transportador y que además es un hipoglucemiante utilizado en pacientes con obesidad y diabetes mellitus tipo 2. Los resultados arrojaron que, en ratones alimentados con una HFD, la desaparición plasmática de glibenclamida está acelerada y la misma se correspondió con un aumento de metabolitos de este sustrato en bilis, confirmando la alteración en el manejo de sustratos de BCRP. Para poder determinar si el mayor decaimiento plasmático se debe (en humanos, CYP3a4) del cual se ha reportado que su nivel de expresión disminuye en un modelo de obesidad inducido por una HFD. Es por ello que resulta sumamente importante poder restablecer los niveles de PRL para normalizar la expresión de BCRP y de esa manera lograr que la droga logre el efecto deseado. Estos resultados, además, nos hablan de la necesidad de incluir a pacientes obesos en los estudios de farmacocinética para lograr su éxito terapéutico. sólo a la modificación del valor proteico de BCRP y no a una mayor captación de sustrato por el hepatocito, evaluamos la expresión de algunos transportadores localizados en la membrana basolateral del hepatocito, responsables del transporte de sulfonilureas al interior del mismo, puesto que también su expresión puede verse afectada con la dieta. Dado que se han reportado cambios en los niveles de expresión del mensajero de OATPs en distintos modelos de obesidad, analizamos en nuestro modelo el nivel de expresión del mensajero para los transportadores OATPs (1a1; 1b2) observando que los mismos no se modifican con la dieta, pero sí disminuye el mensajero que codifica para Oatp1a4, lo que nos sugiere que la mayor depuración del sustrato se debe principalmente al aumento de BCRP inducido por PRL y no a un mayor ingreso del mismo al hepatocito. También descartamos que se deba a una mayor actividad de los sistemas de biotransformación debido a que la glibenclamida es metabolizada por el citocromo 3a11 (en humanos, CYP3a4) del cual se ha reportado que su nivel de expresión disminuye en un modelo de obesidad inducido por una HFD. Es por ello que resulta sumamente importante poder restablecer los niveles de PRL para normalizar la expresión de BCRP y de esa manera lograr que la droga logre el efecto deseado. Estos resultados, además, nos hablan de la necesidad de incluir a pacientes obesos en los estudios de farmacocinética para lograr su éxito terapéutico.