Examinando por Autor "Gardiol, Daniela"
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Ítem Acceso Abierto Análisis de la expresión de proteínas de polaridad celular y su incumbencia en los procesos oncogénicos asociados a infecciones virales(Universidad Nacional de Rosario. Facultad de Ciencias Bioquímicas y Farmacéuticas., 2017-03-23) Marziali, Federico Emanuel; Gardiol, DanielaEl mantenimiento de la polaridad celular representa un mecanismo de supresión oncogénica. La interferencia en la expresión de los factores que la regulan es un hecho evidente en la progresión de diferentes tumores. Es por ello que dichos factores constituyen un tema de estudio de gran relevancia. La proteína DLG1 es considerada como un regulador importante de polaridad, siendo capaz de formar complejos multiproteicos en dominios intracelulares específicos. De esta forma, DLG1 contribuye a la formación de las uniones intercelulares adherentes y además regula negativamente la progresión del ciclo celular. La expresión de DLG1 se encuentra afectada en gran medida durante la evolución tumoral, observándose cambios en sus niveles y en su localización subcelular. Al momento, el conocimiento de los mecanismos que regulan sus niveles de expresión es muy pobre e incierto. Dicho conocimiento representaría el punto de partida para la búsqueda de estrategias que permitan revertir los cambios observados. Por ello, parte de este Trabajo de Tesis Doctoral se dedicó al estudio de los mecanismos implicados en la definición de los niveles de DLG1 en contextos biológicos que requieren de una correcta expresión de esta proteína. En este sentido, estudiamos la implicancia de mecanismos transcripcionales y post-transcripcionales, en especial un mecanismo de splicing alternativo descubierto en nuestro laboratorio que tiene lugar en la región 5´ no traducible (5´UTR) del ARN mensajero y es capaz de modular la abundancia de DLG1. Así, aplicando técnicas de cuantificación de transcriptos y de niveles proteicos, exploramos la participación de estos mecanismos bajo diversas circunstancias, como la adhesión celular y la progresión del ciclo celular epitelial, procesos donde DLG1 es particularmente importante. Además, analizamos la existencia del splicing en células provenientes de diversos tejidos pudiendo detectar a su vez la participación de este mecanismo en procesos de diferenciación celular. De este modo, logramos contribuir a la identificación de nuevos mecanismos de regulación para DLG1, los cuales podrían verse afectados en procesos tumorales. Determinados virus oncogénicos pueden tomar ventaja de los reguladores de polaridad para facilitar su ciclo de replicación interfiriendo con la polarización y contribuyendo a la transformación celular. Este es el caso de los virus del papiloma humano de alto riesgo oncogénico (HPV de alto riesgo), asociados estrechamente al desarrollo de carcinomas cervicales y de otros tumores; y del virus linfotrópico de células T del adulto tipo 1 (HTLV-1), considerado como el agente etiológico de la leucemia humana de células T (ATL). Estos virus, con ciclo replicativo diferentes, codifican para oncoproteínas denominadas E6 y Tax1 respectivamente, con actividades similares en cuanto a su capacidad para promover la proliferación celular. En las mismas resalta, sin embargo, la presencia de motivos C-terminales que les permiten interaccionar con reguladores de polaridad, dentro de los cuales se encuentra DLG1, siendo todavía incierta su función como partner de dichas proteínas virales. Por lo tanto, llevamos a cabo una serie de experimentos para profundizar en la significancia biológica de dichas interacciones. En este punto sobresalió la aplicación de la técnica de microscopía de fluorescencia FRET, capaz de detectar interacciones directas entre proteínas. Pudimos observar que la unión a DLG1 por parte de E6 y Tax1 puede implicar consecuencias diferentes, indicando que estos virus oncogénicos pueden hacer un uso distinto de sus partners de polaridad para favorecer su replicación y estimular la transformación celular. En este sentido, detectamos una interacción entre E6 y DLG1 en los bordes celulares y región citoplasmática con posibles consecuencias en la proliferación celular. Además, descubrimos la existencia de una relación dependiente de la abundancia relativa de cada proteína, lo que resulta en diferentes niveles de expresión para cada una de ellas. Estas observaciones contribuyen a comprender el significado biológico de las variaciones detectadas en la expresión de DLG1 durante la evolución de las lesiones cervicales asociadas a infecciones por HPV. En tanto, en relación a la asociación entre Tax1 y DLG1, pudimos detectar su ocurrencia en estructuras semejantes a compartimientos subcelulares definidos. En este caso, luego del análisis de una variedad de organelas celulares, evidenciamos que la asociación Tax1-DLG1 tiene lugar principalmente en la región perinuclear, co-localizando con marcadores del aparato de Golgi y del centrosoma. En dicha región Tax1 podría reclutar a DLG1 como mecanismo que impediría su tráfico a los bordes celulares o bien estimular su participación en mecanismos de traducción de señales, teniendo así una significancia oncogénica. Al mismo tiempo, conociéndose la polarización del centrosoma inducida por Tax1 necesaria para la transmisión del genoma de HTLV-1 a una célula no infectada, es posible que DLG1 pueda cumplir alguna función en dicho proceso. En resumen, teniendo en cuenta los datos alcanzados, este trabajo de Tesis Doctoral aporta al conocimiento integral de los mecanismos que regulan la expresión de DLG1 y además contribuye al entendimiento de la forma en que los HPV del alto riesgo y el HTLV-1 pueden utilizar o interferir con esta proteína de polaridad para promover funciones relacionadas a la transformación celular. Este trabajo también robustece la idea de la existencia de mecanismos comunes de patogénesis viral donde la asociación con proteínas de polaridad puede relacionarse con el ciclo de replicación y el desarrollo de patologías.Ítem Acceso Abierto Disc Large 1 expression is altered by Human Papillomavirus E7/E6 proteins in organotypic cultures of human keratinocytes(Microbiology Society, 2016-02) Bugnon Valdano, Marina Paula; Cavatorta, Ana Laura; Morale, Miriam; Marziali, Federico Emanuel; Steenbergen, Renske; Boccardo, Enrique; Gardiol, DanielaÍtem Acceso Abierto DLG1 polarity protein expression associates with the disease progress of low-grade cervical intraepithelial lesions(Elsevier) Cavatorta, Ana Laura; Di Gregorio, Alejandra; Bugnon Valdano, Marina Paula; Marziali, Federico Emanuel; Cabral, Mariela; Bottai, Hebe; Cittadini, Jorge; Nocito, Ana Lía; Gardiol, DanielaÍtem Embargo Estudio de la contribución de factores celulares y virales en los procesos tumorales asociados a infecciones por virus oncogénicos(Universidad Nacional de Rosario. Facultad de Ciencias Bioquímicas y Farmacéuticas., 2016-03-28) Bugnon Valdano, Marina Paula; Gardiol, Daniela; Cavatorta, Ana LauraEn el presente trabajo de Tesis se profundizó el entendimiento de mecanismos involucrados en la regulación de proteínas de polaridad, con especial interés en la alteración de la expresión de dichas proteínas celulares en los procesos de transformación maligna. Particularmente, se analizó la regulación de la expresión de la proteína DLG1, cuya expresión se ve alterada en variedad de tumores y que ha sido propuesta como una proteína clave en el mantenimiento de la polaridad celular a nivel de las uniones adherentes. Inicialmente, se estudió la incumbencia en la regulación de DLG1 durante procesos vinculados a infecciones por HPV. Se optimizaron y desarrollaron, por primera vez en nuestro medio, cultivos organotípicos tipo raft. Se generaron dichos cultivos expresando las proteínas transformantes de HPV-18, lo que permitió analizar la regulación de DLG1 en un contexto mimetizando el ambiente natural de infección viral. Mediante esta estrategia de estudio se pudieron analizar en detalle los efectos de la presencia de las mencionadas proteínas virales en la expresión de DLG1. Así, se demostró que la presencia de las oncoproteínas virales provoca alteraciones en la distribución subcelular de DLG1 en el ambiente epitelial y, a su vez, genera cambios significativos en sus niveles. También se analizó el efecto de proteínas virales del HPV- 11, de bajo riesgo oncogénico, observándose cambios significativos tanto en los niveles como en la distribución de DLG1. Por lo tanto, se profundizó en el entendimiento de los mecanismos subyacentes a infecciones por HPV, tanto asociadas como no a procesos carcinogénicos. Una diferencia importante observada entre ambos tipos viales fue la ausencia de DLG1 en los contactos celulares para HPV-18, efecto no evidenciado en el caso del HPV-11. Estas diferencias entre HPV de alto y bajo riesgo podrían tener relevancia en las patologías asociadas, dado los reportes sobre la función oncosupresora de DLG1 a nivel de los contactos celulares. Además, se analizó y discutió la incumbencia de distintos mecanismos potencialmente involucrados en los cambios de la expresión de DLG1, estudiando en especial detalle la participación de alteraciones en el ciclo celular por parte de HPV. Por otro lado, se investigó la expresión de otra proteína de polaridad, PAR3, y su alteración en presencia de las proteínas virales. PAR3 es crucial para la formación de las uniones tight y en los últimos años se ha incrementado el conocimiento de sus funciones como supresor de tumores. Notablemente, mediante cultivos organotípicos se observaron cambios importantes en los niveles totales de PAR3 en presencia de proteínas de HPV tanto de alto como de bajo riesgo oncogénico, indicando probables mecanismos comunes sobre la expresión de la mencionada proteína celular durante las infecciones virales. Además, se obtuvieron resultados preliminares en el estudio de la expresión de PAR3 en biopsias cervicales, paso importante en la identificación futura de probables biomarcadores. También, se estudió la expresión génica de HPV en los cultivos raft portando las secuencias que codifican para las proteínas E6 y E7 de HPV-18. Una premisa fundamental para conocer como el virus interfiere con los blancos celulares es analizar la expresión de los genes tempranos de HPV, en especial de las distintas isoformas de E6. Así, a partir de técnicas moleculares específicas optimizadas, se demostró una mayor expresión de la isoforma E6* en las capas Inferiores del epitelio. Además, se encontró a lo largo del tejido epitelial una transcripción diferencial de DLG1, en relación directa a los niveles de transcriptos virales. Estos datos constituyen un avance en el entendimiento de los cambios en la abundancia de DLG1 en presencia de HPV. Dado que cambios en los patrones de la expresión de DLG1 se observan también en tumores no asociados a HPV, se analizó la incumbencia de factores independientes de tales infecciones. Se investigó la injerencia de mecanismos epigenéticos y, en particular, del estado de metilación de su promotor. Así, se establecieron las bases para el análisis de dichos mecanismos en la regulación de DLG1, no estudiado hasta el momento. Estos ensayos no mostraron una relación directa entre la regulación de los niveles de DLG1 y los mecanismos epigenéticos propuestos, tanto en una variedad de células como en tumores asociados a HPV. No obstante, en base a los resultados obtenidos, dichos mecanismos podrían tener un rol interesante en la regulación de DLG1 en otros tipos tumorales, particularmente durante la progresión maligna en colon. Por lo tanto, en total los resultados del presente trabajo indican mecanismos de alteración de proteínas de polaridad por parte de las proteínas de HPV que podrían ser de gran importancia durante las infecciones naturales. Algunas diferencias fundamentales observadas entre HPV de alto y bajo riesgo podrían resultar relevantes al relacionarse con las patologías asociadas a cada tipo viral. Conjuntamente, los datos presentados constituyen un paso fundamental para comprender la biología del cáncer en general, considerando que la disrupción de la polaridad celular es un evento clave de los procesos tumorales. Por último, la extrapolación a la clínica de los conocimientos generados desde estudios de patobiología básica, como el presente trabajo, es fundamental para la identificación de biomarcadores que contribuyan al diagnóstico y al tratamiento en enfermedades oncológicas.Ítem Acceso Abierto HPV E6 and E7 oncoproteins cooperatively alter the expression of Disc Large 1 polarity protein in epithelial cells(BMC, 2020-04-07) Dizanzo, María Paula; Marziali, Federico Emanuel; Brunet Avalos, Clarise; Bugnon Valdano, Marina Paula; Leiva, Santiago Gabriel; Cavatorta, Ana Laura; Gardiol, DanielaBackground: Persistent infection with high-risk Human Papillomavirus (HPVs) is associated with the development of cervical cancer. The transforming capacity of these viruses relies on the cooperative action of the E6 and E7 viral oncoproteins. Among the oncogenic activities of E6, the interaction and interference with cell polarity PDZ proteins have been well established. One of the most characterized PDZ targets of HPV E6 is human Disc large 1 (DLG1), a scaffolding protein involved in the control of cell polarity and proliferation. Interestingly, in cervical squamous intraepithelial lesions, alterations in DLG1 expression were observed in association to tumour progression. Moreover, the expression of both HPV E6 and E7 proteins may be responsible for the changes in DLG1 abundance and cell localization observed in the HPV-associated lesions. Methods: Due to the relevance of DLG1 deregulation in tumour development, we have performed an in-depth investigation of the expression of DLG1 in the presence of the HPV oncoproteins in epithelial cultured cells. The effects of HPV E6 and E7 proteins on DLG1 abundance and subcellular localization were assessed by western blot and confocal fluorescence microscopy, respectively. Results: We demonstrated that the relative abundance of HPV-18 E6 and DLG1 is a key factor that contributes to defining the expression abundance of both proteins. We also show here that a high expression level of DLG1 may negatively affect HPV-18 E6 nuclear expression. Moreover, the co-expression of HPV-18 E6 and E7 produces a striking effect on DLG1 subcellular localization and a co-distribution in the cytoplasmic region. Interestingly, HPV-18 E7 is also able to increase DLG1 levels, likely by rescuing it from the E6-mediated proteasomal degradation. Conclusions: In general, the data suggest that HPV-18 E6 and E7 may have opposing activities in regards to the regulation of DLG1 levels and may cooperatively contribute to its subcellular redistribution in the HPV context. These findings constitute a step forward in understanding the differential expression of DLG1 during tumour progression in an HPV-associated model.Ítem Acceso Abierto Human papillomavirus (HPV)-18 E6 oncoprotein interferes with the epithelial cell polarity Par3 protein(Federation of European Biochemical Societies, 2014-01-14) Facciuto, Florencia Natalia; Bugnon Valdano, Marina Paula; Marziali, Federico Emanuel; Massimi, Paola; Banks, Lawrence; Cavatorta, Ana Laura; Gardiol, DanielaÍtem Acceso Abierto Interacción de proteínas de adhesión celular con la proteína E6 derivada de Papilomavirus humanos de alto riesgo y su relación con la oncogénesis(Universidad Nacional de Rosario. Facultad de Ciencias Bioquímicas y Farmacéuticas., 2014-06-13) Facciuto, Florencia Natalia; Gardiol, DanielaLos VPH de alto riesgo, como VPH 16 y 18, se asocian con el desarrollo de carcinomas de cuello de útero y de las lesiones neoplásicas precursoras. Dado que el cáncer cervical representa, después del de mama, el segundo cáncer más frecuente entre mujeres de todo el mundo, VPH es considerado un importante agente carcinogénico (http://www.msal.gov.ar). Las funciones oncogénicas de VPH residen en las proteínas virales E6 y E7 que interfieren con proteínas celulares regulatorias. Entre los blancos celulares de E6 se encuentran proteínas con dominios proteicos específicos denominados PDZ (PSD‐95, DLG1, ZO‐1) (Thomas et al., 2008b). Los dominios PDZ son motivos conservados y específicos de reconocimiento proteína‐proteína que permiten el reclutamiento de péptidos y la formación de complejos multiproteicos en sitios especializados de la membrana, con función en la transmisión de señales (Javier and Rice, 2011). Muchas de estas proteínas son componentes de las uniones intercelulares y participan del mantenimiento de la polaridad celular. La interacción entre E6 y proteínas PDZ involucra la región C‐terminal (T/SXV/L) altamente conservada de E6, que constituye un sitio de unión consenso a dominios PDZ (PBM), y se ha demostrado que en algunos casos esta interacción resulta en la degradación de las proteínas PDZ (Gardiol et al., 1999; Thomas et al., 2002). Por otro lado, la pérdida de polaridad celular es un evento clave en el desarrollo de carcinogénesis y su regulación depende, en parte, de la integridad de las UT (Aranda et al., 2008). Basados en esta información y con el objetivo de analizar la interferencia de la proteína E6 de VPH sobre con la estructura de las UT, en el Capítulo 1 analizamos la expresión de uno de los componentes del complejo de polaridad celular PAR, la proteína PAR 3. Dicha proteína contiene tres dominios PDZ con las cuales potencialmente las proteínas E6 de VPH de alto riesgo podrían interaccionar; además, otros autores señalaron una interacción débil en ensayos in vitro de PAR 3 con E6 18 (Tomaic et al., 2008). PAR 3 es un elemento clave para la conformación de las UT, por lo tanto el estudio de la interferencia de E6 sobre ella podría explicar la pérdida de la arquitectura celular observada en carcinomas asociados a VPH. Mediante ensayos de IF observamos que la expresión de E6 16 o de E6 18 altera la localización de PAR 3, tanto utilizando cultivos convencionales como en cultivos histotípicos, los cuales fueron optimizados por primera vez en el Laboratorio. Asimismo, pudimos comprobar que el PBM de E6 18 es fundamental para dicha función, ya que la expresión de una mutante en el PBM de E6 18 no altera la localización de PAR 3. Por otro lado, pudimos comprobar interacción in vivo entre PAR 3 y E6 18, de una manera PDZ-dependiente. Comprobamos que dicha interacción no tiene como consecuencia la degradación proteica de PAR 3, como ocurre con otras proteínas blanco de E6 conteniendo dominios PDZ, como Scribble y DLG1 (Gardiol et al., 1999; Nakagawa and Huibregtse, 2000). Por ensayos de fraccionamiento celular, demostramos la relocalización citoplasmática y nuclear de PAR 3 en aquellas células que expresan E6 18. Estos datos sugieren que los cambios en la ubicación subcelular de PAR 3, y su ausencia en el contacto célula-célula podrían contribuir con la transformación maligna y los procesos carcinogénicos en general, ya que para llevar a cabo sus funciones regulatorias, PAR 3 necesita adquirir una localización asociada a membrana en la región apical (Pieczynski and Margolis, 2011). Para explicar las diferencias de localización de PAR 3 observadas, investigamos los probables mecanismos celulares que puedan mediar dicho cambio. Para lo cual analizamos en primera instancia, la interferencia que pudiera tener E6 sobre otros componentes del complejo PAR, como aPKC (Joberty et al., 2000). Los resultados indicaron que la proteína aPKC se encuentra activada en líneas celulares derivadas de carcinoma cervical, como HeLa o CaSki, lo que podría tener consecuencias sobre las proteínas que aPKC fosforila. Sin embargo, E6 no contribuye a dicha activación siendo desconocidos los mecanismos implicados. Asimismo, la polaridad celular también requiere la correcta distribución de lípidos de membrana de tipo PIs, que a su vez están involucrados en los mecanismos de traducción de señales importantes para el control de la proliferación celular (Martin-Belmonte and Mostov, 2007). La proteínas celulares PDZ presentes en las UT interaccionan con este tipo de lípidos y esta interacción es relevante para la correcta distribución de PIs (Ivarsson et al., 2013). Por ello, investigamos si la unión PDZ-E6 podría interferir con la localización y función de tales lípidos. Con este propósito, analizamos las diferencias en la distribución de PIs en presencia o ausencia de las proteínas E6 usando un biosensor fluorescente de PI(4,5)P2, el dominio pleckstrina de la fosfolipasa C conjugado a GFP (Varnai and Balla, 2006). Demostramos que la expresión de la proteína E6 induce una redistribución de PI(4,5)P2, reduciendo su presencia en los bordes celulares. Más aún, esta alteración no se observó para el caso de la proteína E6 derivada de un tipo de VPH no oncogénico el cual carece de la capacidad de interaccionar con dominios PDZ. Además, células derivadas de carcinomas asociados a VPH mostraron un patrón totalmente alterado respecto a la localización de PI(4,5)P2, con una distribución tipo puntillado en el citoplasma. Para analizar si E6 interfiere en la interacción PDZ-PIs optimizamos análisis de interacción lípidos-proteínas in vitro utilizando tiras comerciales conteniendo PIs (Echelon, EE.UU.). Luego de poner a punto la técnica, pudimos demostrar que la presencia del PBM de E6 18, o de la proteína completa, interfiere en el patrón de unión PIs-PAR 3. Esto último podría implicar cambios en la localización en membrana de dicha proteína, así como también podría explicar los cambios en la localización subcelular de distintas proteínas PDZ en células VPH-positivas, que dependen de la interacción con PIs para su correcta distribución. También es importante destacar que es posible que dichos cambios en la localización de PAR 3 se deban a interferencias de E6 sobre otros blancos celulares que forman parte de otros complejos de polaridad. Esto último considerando que existe una interdependencia entre los distintos elementos que conforman el network de proteínas que regulan la polaridad en células epiteliales (Coradini et al., 2011). Es por ese motivo que en el presente trabajo de Tesis analizamos la intercomunicación que existe entre los componentes del complejo de polaridad SCRIB [proteínas Scribble y DLG1, blancos PDZ de E6 (Pim et al., 2012)] y PAR·3. Por técnicas de silenciamiento pudimos corroborar que la ablación de DLG1 o de Scribble afecta de manera significativa la distribución subcelular de PAR 3 en la línea celular HaCaT. Por lo tanto, los cambios observados en la localización en células que expresan E6 derivado de VPH de alto riesgo podrían deberse, en parte, a la interferencia de E6 sobre componentes del complejo SCRIB. Es importante destacar también, que es la primera vez que se describe una dependencia en la localización de PAR 3 mediada por DLG1 y/o Scribble. Por último, teniendo en cuenta que mucho de los blancos de E6 son proteínas que pertenecen a complejos de polaridad y a las uniones intercelulares, decidimos analizar la interferencia de E6 sobre la formación de las UT y la polarización. Para tal fin utilizamos ensayos de cambio en la concentración de calcio (McNeil et al., 2006). En primer lugar, optimizamos por primera vez la técnica en el laboratorio, y analizamos la relocalización celular de ZO1 en células que expresaban o no E6 18. Los resultados indicaron que la presencia de E6 produce un retardo en la localización de ZO1, proteína clave para las UT. Por lo tanto, un retardo en la reformación de las uniones intercelulares indicaría una disfunción de los mecanismos que regulan la polaridad celular en células que expresan E6 18. El retardo observado en la repolarización celular puede deberse a la interacción de E6 con algunos de los blancos que regulan la polaridad celular, los cuales fueron descriptos anteriormente. Es importante mencionar que el retardo en la repolarización se observa en estadios tempranos de la formación de las uniones celulares. Se ha descripto recientemente que PAR 3 es una de las proteínas que participa en la formación temprana de tales uniones (Iden et al., 2012); por lo tanto, la alteración en su localización podría considerarse un mecanismo probable que explique lo observado en los ensayos de cambios de la concentración de calcio. Los datos obtenidos sugieren que los VPH oncogénicos tienen la capacidad de interferir con elementos claves de las UT, con probables implicancias en el mantenimiento de la polaridad celular. En resumen hemos demostrado que E6 es capaz de alterar la localización subcelular de PAR 3, sin producir cambios en los niveles de dicha proteína. Los cambios de localización pueden tener efectos dramáticos en la polaridad apicobasal que es regulada por PAR 3, entre otras proteínas. Es importante destacar que la expresión de PAR 3 se encuentra alterada en una amplia variedad de tumores (Facciuto et al., 2012) y que se ha demostrado su función como un inhibidor de metástasis en modelos de cáncer de mama (Iden et al., 2012; McCaffrey et al., 2012). De esto se desprende que los hallazgos presentados aportan significativamente al conocimiento de los mecanismos relacionados a las transformaciones malignas asociadas a las infecciones con VPH, ya que alteraciones en los patrones de expresión de PAR 3, como los descriptos en esta Tesis podrían contribuir a la progresión maligna de las lesiones cervicales.Ítem Embargo Interacción entre proteínas de polaridad celular y oncoproteínas virales: Aplicación de técnicas de microscopía de fluorescencia de avanzada(2017) Brunet Avalos, Clarise; Gardiol, Daniela; Marziali, Federico EmanuelEl establecimiento y mantenimiento de la polaridad celular son procesos que aseguran la correcta división, crecimiento y proliferación celular. Debido a su naturaleza, estos mecanismos poseen características oncosupresoras y son regulados por proteínas de polaridad celular. Estas, y en particular DLG1, se ven afectadas en los procesos oncogénicos, incluyendo a aquellos que se desarrollan en el marco de una infección por virus oncogénicos; tal es el caso de los virus del papiloma humano de los tipos de alto riesgo oncogénico (HPV), asociados al desarrollo de cáncer cervical. Determinadas proteínas virales aprovechan su capacidad de interacción con reguladores de polaridad, para facilitar su replicación, interfiriendo con la polarización y contribuyendo a la transformación celular. Así, la oncoproteína viral E6, presenta motivos C-terminales que pueden interactuar con DLG1. No obstante, poco se conoce sobre los efectos de dicha interacción sobre los procesos carcinogénicos, por tanto realizamos experimentos que nos permitieran conocer sus implicancias biológicas, atendiendo principalmente a la distribución subcelular y los niveles de expresión de las proteínas involucradas. En este punto, recurrimos a la aplicación de novedosas técnicas de microscopía de fluorescencia. En resumen, nuestras observaciones contribuyeron a comprender mejor la evolución de las lesiones cervicales asociadas a infecciones por HPV.Ítem Acceso Abierto Interference of HTLV-1 Tax Protein with Cell Polarity Regulators: Defining the Subcellular Localization of the Tax-DLG1 Interaction(MDPI, 2017-11-23) Marziali, Federico Emanuel; Bugnon Valdano, Marina Paula; Brunet Avalos, Clarise; Moriena, Lucía; Cavatorta, Ana Laura; Gardiol, DanielaÍtem Embargo Mecanismos conservados de patogénesis viral: Alteración de la polaridad celular y de las uniones intercelulares(2022) Dizanzo, María Paula; Gardiol, Daniela; Cavatorta, Ana LauraLos procesos celulares básicos, como el crecimiento y división celular, son guiados por una asimetría especial que adoptan lípidos y proteínas dentro de la célula. Esta disposición de componentes celulares se conoce como polaridad celular y las proteínas de polaridad son las encargadas de su regulación. Durante años se ha estudiado la relación entre alteraciones en la expresión de estas proteínas con el desarrollo oncogénico. A su vez, también, se conoce que diferentes tipos de virus humanos, oncogénicos y no oncogénicos, son capaces de interferir y alterar la expresión de estas proteínas como parte de su mecanismo de patogénesis. Entre aquellos virus oncogénicos se encuentran los Virus de Papiloma Humano (HPV, por sus siglas en inglés Human Papilloma Virus) tipo 16 (HPV-16) y 18 (HPV-18), ya que su infección está altamente asociada al desarrollo de cáncer cervical, y se los ha vinculado también a la progresión de otros tipos de tumores. La actividad transformante de estos virus se asienta principalmente en la acción conjunta de dos de sus proteínas, E6 y E7. La oncoproteína E6 es capaz de unirse a los dominios de interacción proteica denominados PDZ (su nombre deriva de: PSD-95 (del inglés, Postsynaptic density protein 95), DLG1 (del inglés, Disc Large 1) y ZO-1 (del inglés, Zonula Occludens 1)). Muchas proteínas de polaridad poseen en sus secuencias dominios PDZ y se ha demostrado que las mismas presentan alteraciones en su localización y en los niveles de su expresión relacionándose con el desarrollo de patologías. La relación de E6 de HPV con la proteína de polaridad DLG1 ha sido muy estudiada y se propuso como el principal blanco de HPV-18. DLG1 se encuentra involucrada en la organización de uniones intercelulares adherentes que contribuyen a la polarización celular. En primera instancia, se observó que la sobre-expresión de E6 estimula la degradación de DLG1 por un mecanismo dependiente de proteasomas. Por otro lado, para poder analizar la relación de esta proteína de polaridad con el desarrollo de la carcinogénesis mediada por HPV, en nuestro laboratorio se analizó la expresión de DLG1 por inmunohistoquimica en muestras histológicas de pacientes con lesiones cervicales asociadas a HPV oncogénico. En estos experimentos se demostró que, en lesiones precursoras al carcinoma invasivo, los niveles de DLG1 se encuentran incrementados en comparación al epitelio estratificado de la mucosa normal y al mismo tiempo que su localización tisular y celular está alterada. En este caso, la expresión de DLG1 se observó disminuida en los bordes celulares donde normalmente se localiza, con una clara redistribución hacia el citoplasma. Subsecuentemente, con el fin de analizar en más detalle los mecanismos involucrados en estas observaciones, se emplearon cultivos organotípicos raft de queratinocitos humanos (que permiten reproducir in vitro epitelios escamosos) expresando E6 y E7 de HPV de alto riesgo oncogénico, y de este modo se analizó el efecto de las proteínas virales sobre DLG1. Así, se pudo demostrar que la deslocalización e incremento de los niveles de DLG1, observados previamente en biopsias de pacientes, son producto de la expresión de estas oncoproteínas virales. Interesantemente, otros estudios han brindado evidencia de que la proteína DLG1 presenta cambios en su distribución y abundancia celular en varios tumores, lo cual sugiere que funciona como supresor tumoral. Sin embargo, en ciertos contextos biológicos podría favorecer el desarrollo oncogénico, especialmente cuando está deslocalizada. A partir de estas observaciones podemos notar que la relación de DLG1 con proteínas virales es compleja y, por lo tanto, se requiere ahondar aún más en su análisis. Por esta razón, parte de este trabajo de Tesis se enfocó en profundizar los estudios sobre la relación HPV-DLG1 que nos permitan comprender mejor el rol de esta proteína de polaridad en el desarrollo de la carcinogénesis. En línea con lo expuesto, en este trabajo de Tesis, generamos un modelo celular epitelial que nos permitió mimetizar el escenario de las alteraciones sufridas por DLG1 observadas en biopsias de pacientes con lesiones ligadas a infección con HPV, y así, pudimos profundizar el estudio de los posibles mecanismos involucrados. Pudimos determinar que la co-expresión de DLG1 y E6 de HPV18 (E618) provoca alteraciones en la localización subcelular de ambas proteínas de manera dependiente del motivo de unión a PDZ presente en E618. Además, estos estudios nos permitieron determinar que la expresión conjunta de las oncoproteínas E618 y E718 (E7 de HPV18) promueve la re-distribución subcelular de DLG1 y que E718 no tiene una interacción directa con DLG1 en este contexto. Analizando los niveles de expresión de DLG1 pudimos determinar que E718 ejerce un efecto estabilizador sobre esta proteína de polaridad, aún en presencia de E618 en condiciones de degradación. Más aún, demostramos que la actividad de E718 sobre DLG1, tanto de estabilización como de deslocalización, se encuentra especialmente ligada a la fosforilación de la proteína viral en el sitio de reconocimiento para la quinasa CKII (del inglés, Casein Kinase II) presente en su secuencia. Esto resulta de mucho interés dado que E7 es capaz de interaccionar con numerosos blancos celulares y su fosforilación puede favorecer estas interacciones, por lo tanto, es probable que la fosforilación por CKII regule las principales funciones de E7 requeridas para la estabilización y re-localización de DLG1. Aún más, a partir de análisis llevados a cabo como parte de esta Tesis, demostramos que E718 también es capaz de regular la abundancia de otra proteína de polaridad clave como hScrib, el principal blanco de HPV-16. Por lo tanto, procedimos a investigar el efecto de E616 y E716 sobre la expresión de dicha proteína celular con el fin de analizar un posible mecanismo de patogénesis conservado entre distintos tipos de HPV de alto riesgo oncogénico. En este sentido, pudimos concluir que la actividad de E7 está conservada en otros tipos de HPV de alto riesgo en relación a la estabilización de proteínas de polaridad. Estos resultados, en conjunto, contribuyen al entendimiento molecular de la alteración de la polaridad celular durante la oncogénesis mediada por los oncovirus HPV. Por otro lado, como se mencionó anteriormente, existen virus no oncogénicos que también son capaces de interferir con la función y expresión de proteínas celulares de polaridad. En este sentido, iniciamos estudios con el virus Zika (ZIKV) como un modelo de virus no oncogénico. El ZIKV es transmitido por mosquitos del género Aedes perteneciente al género flavivirus. Además, existen evidencias de su trasmisión sexual y vertical. Entre los signos y síntomas comunes en personas infectadas se encuentran cuadros de fiebre, letargo, conjuntivitis, sarpullidos y artralgias. Sin embargo, en la última década el ZIKV ha sido relacionado con el desarrollo de enfermedades severas como el Síndrome de Guillain Barré y microcefalia congénita. En Argentina se han confirmado casos autóctonos e importados y en los últimos años ha adquirido creciente relevancia epidemiológica. Con el fin de extender los ensayos sobre el efecto de la infección de este flavivirus en la polaridad celular epitelial, se desarrolló la puesta a punto de la metodología de infección en la línea epitelial A549 a través de una colaboración con el Instituto Nacional de Enfermedades Virales Humanas “Dr. J. Maiztegui”. Luego, como parte de este trabajo de Tesis, se optimizaron las condiciones experimentales para el análisis de la expresión de DLG1 como marcador de polaridad celular en el modelo epitelial tras la infección con aislamientos regionales de ZIKV. Esto permitió sentar las bases para futuros estudios en nuestro laboratorio en relacioón a virus no oncogénicos y la disrupción de la polaridad celular. En resumen, teniendo en cuenta los datos alcanzados, este trabajo de Tesis Doctoral aporta al conocimiento integral de los mecanismos que regulan la expresión de proteínas de polaridad, contribuyendo al entendimiento de los posibles mecanismos involucrados en infecciones por virus de gran impacto clínico como el HPV (modelo oncogénico) y el ZIKV (como modelo no oncogénico). Este trabajo también robustece la idea de la existencia de mecanismos comunes de patogénesis viral donde la alteración de la expresión de proteínas de polaridad celular podría favorecer la diseminación viral y/o el desarrollo de patologías asociadas.Ítem Acceso Abierto Novel effect of the high risk-HPV E7 CKII phospho-acceptor site on polarity protein expression(BMC, 2022-12) Dizanzo, María Paula; Bugnon Valdano, Marina Paula; Basukala, Om; Banks, Lawrence; Gardiol, DanielaÍtem Acceso Abierto Transcriptional and translational mechanisms contribute to regulate the expression of Disc Large 1 protein during different biological processes(De Gruyter, 2015-03-14) Marziali, Federico Emanuel; Cavatorta, Ana Laura; Bugnon Valdano, Marina Paula; Facciuto, Florencia Natalia; Gardiol, Daniela; ; ; ; ; ;Ítem Embargo Virus Zika: desde la emergencia epidemiológica hacia el entendimiento de los mecanismos de patogénesis viral(2023) Leiva, Santiago Gabriel; Gardiol, Daniela; Bugnon Valdano, Marina PaulaEl virus Zika (ZIKV) pertenece al género de los Flavivirus (FV). Como muchos miembros de este género, posee un genoma de ARN simple hebra de polaridad positiva relativamente pequeño de sólo 11.000 bases, viriones con una envoltura lipídica y un tamaño promedio de 50 nm. Sin embargo, también cuenta con características únicas que lo distingue de otros FV. Durante mi trabajo de tesis doctoral, nos enfocamos en el estudio de los mecanismos relacionados a dos de estas características distintivas de ZIKV. Por un lado, investigamos la gran capacidad de ZIKV de diseminarse dentro de su hospedador. Este virus logra infectar tejidos de difícil acceso para la mayoría de los patógenos humanos, como es el tejido nervioso central. Para lograrlo, debe ser capaz de atravesar complejas barreras biológicas. Sin embargo, los mecanismos que emplea para esto permanecen sin comprenderse completamente. Por lo tanto, decidimos abordar esta incógnita, a través de distintos modelos experimentales. Inicialmente, nos enfocamos en investigar la posibilidad de que ZIKV logre alterar la integridad de las uniones intercelulares (UI) como parte de un mecanismo de patogenicidad que facilite atravesar barreras biológicas por una vía paracelular. Para ello, desarrollamos un modelo de infección in vitro de ZIKV, en colaboración con el Instituto Nacional de Enfermedades Virales Humanas (INEVH) “Dr. Julio Maiztegui”, donde obtuvimos acceso a 3 aislamientos virales de ZIKV. Utilizando dicho modelo realizamos ensayos de inmunofluorescencia (IF) para evidenciar cambios en la abundancia y localización de proteínas celulares constituyente de las UI. Seleccionamos a la proteína celular Ocludina como marcador de la integridad de las uniones estrechas y a la proteína DLG1 (del inglés Disc Large 1) como marcador de integridad de las uniones adherentes. Además, para evaluar de forma más precisa y reproducible los cambios que podrían sufrir estas proteínas durante la infección por ZIKV, desarrollamos un algoritmo de cuantificación automatizada de la fluorescencia asociada a la expresión de dichas proteínas celulares, basado en la segmentación de las imágenes. Luego del análisis cuantitativo de imágenes obtenidas a partir de ensayos de IF, observamos una reducción en los niveles de expresión de las proteínas Ocludina y DLG1 tras la infección con distintas cepas virales, aunque sin cambios significativos en la localización subcelular de tales marcadores. Estos resultados nos alentaron a buscar la existencia de mecanismos alternativos o complementarios que podrían influir en la diseminación del virus dentro de sus hospedadores. Por lo tanto, estudiamos la posibilidad de que el virus emplee mecanismos transcelulares de diseminación, en donde manipularía a su favor componentes de las vías secretoras celulares para facilitar su transporte y liberación dentro de la células que componen las barreras biológicas. En este contexto, analizamos factores celulares que podrían estar implicados en las etapas tardías del ciclo de replicación de ZIKV, que hasta el momento resultan poco comprendidas. Para esto, realizamos ensayos de proteómica donde evaluamos los cambios en el proteoma de células humanas en presencia de la proteína no estructural 1 (NS1) de ZIKV. Esta es la única proteína viral de ZIKV que es secretada al espacio extracelular y se ha reportado que participa tanto en los mecanismos de ensamblaje como de liberación de las partículas virales. Nos enfocamos en buscar posibles proteínas celulares relacionadas a mecanismos de transporte intracelular que hubiesen cambiado su nivel de expresión en presencia de NS1. Interesantemente, encontramos que la proteína celular sinaptotagmina-9 (SYT9) mostró un gran aumento de sus niveles de expresión en presencia de dicha proteína viral. SYT9 es una proteína celular poco estudiada hasta el momento, aunque existen reportes que sugieren que podría ser crucial en mecanismos de transporte intracelulares asociados a vesículas en diversos tejidos. Este hallazgo resultó muy interesante si se contempla que tanto NS1 como los nuevos viriones de ZIKV producidos durante una infección, son liberados de las células mediante transporte vesicular. Por lo tanto, nos propusimos realizar ensayos de microscopia confocal de fluorescencia y Western Blot (WB) para profundizar dicho hallazgo. En este contexto, pudimos demostrar que la presencia de proteínas virales relacionadas a la liberación y ensamblado de los nuevos viriones de ZIKV como son NS1 o la proteína estructural de la envoltura (E), incrementan significativamente la expresión de la proteína celular SYT9. Además, en los ensayos de microscopía confocal de fluorescencia fue posible evidenciar que NS1 y E de ZIKV inducen una fuerte redistribución de SYT9 con un intenso patrón de co-localización con ambas proteínas virales. Además, pudimos reforzar nuestros resultados al demostrar que durante la infección por ZIKV la proteína SYT9 sufre cambios similares a los descriptos anteriormente en relación a su expresión y localización subcelular, mostrando nuevamente una intensa co-localización con las proteínas virales NS1 y E de ZIKV en modelos de infección in vitro. Si bien otros estudios son necesarios para profundizar estos hallazgos, estos resultados son muy importantes dado que es la primera vez que puede asociarse una proteína de la familia de las sinaptotagminas con el ciclo de replicación de los FV. Por otro lado, también decidimos investigar la particular epidemiología de ZIKV. Principalmente, nos abocamos a estudiar las diferencias genéticas existentes entre las cepas de linaje Asiático responsables de las epidemias por ZIKV y las cepas pre epidémicas tanto de linaje asiático como africano (los 2 únicos linajes descriptos para ZIKV). Además, también estudiamos si las cepas epidémicas responsables de los casos asociados a neuropatologías (principalmente microcefalia) poseían variantes genéticas únicas respecto a las demás cepas epidémicas asociadas a casos sintomáticos más leves. Para ello, generamos una base de datos con secuencias genómicas completas de ZIKV que se encontraban disponibles en repositorios digitales. Luego, desarrollamos un algoritmo bioinformático para comparar las secuencias asiáticas epidémicas con los demás grupos, y registrar todas las variantes nucleotídicas así como información relevante asociada a estas variantes, incluyendo: sus posiciones en el genoma, sus consecuencias traduccionales y la frecuencia de cada variante dentro de cada uno de los grupos de secuencias mencionados. Posteriormente, evaluamos la distribución de estas variantes en el genoma de ZIKV para determinar si existían genes con diferente tasa de variabilidad. Además, analizamos en profundidad la frecuencia de cada variante, con el objetivo de encontrar variantes que fueran comunes a todas las secuencias de un determinado grupo de aislamientos de ZIKV. Finalmente, estimamos el impacto de estas mutaciones sobre la estabilidad de las proteínas virales utilizando como parámetro la variación de la energía libre de Gibbs del plegamiento de las proteínas (ΔΔG) y realizando un modelado proteico de las variables más relevantes epidemiológicamente. De esta manera, logramos identificar varias nuevas variantes genéticas que afectarían la estructura de las proteínas virales y que, a su vez, están presentes en todas las secuencias de los aislamientos epidémicos, pero en ninguna de las secuencias pre epidémicas. Estos datos podrían servir como un importante punto de partida para futuros estudios biológicos para comprender fehacientemente el impacto de estos cambios en las características de las cepas emergentes. En resumen, teniendo en cuenta los resultados obtenidos durante este trabajo de Tesis Doctoral podemos concluir que el mismo aporta al conocimiento integral de los mecanismos subyacentes a las particularidades biológicas y epidemiológicas demostradas para un virus con impacto importante en la salud pública regional. Durante este trabajo, fue posible mejorar nuestro entendimiento de los mecanismos patogénicos que ZIKV utiliza para diseminarse dentro de su hospedador. Además, fue posible identificar potenciales factores celulares que el virus necesitaría para completar su ciclo de vida durante el curso de una infección y que podrían interpretarse como potenciales blancos terapéuticos en futuras investigaciones. Por otro lado, con este trabajo de tesis también hemos aportado a dilucidar las razones por las cuales este virus podría haber logrado desarrollar la última epidemia en América. Esto último nos permite conocer mejor la biología de este virus y sentar las bases para una mejor estrategia preventiva en caso de nuevas emergencias por ZIKV.