Virus Zika: desde la emergencia epidemiológica hacia el entendimiento de los mecanismos de patogénesis viral
Fecha
2023
Autores
Título de la revista
ISSN de la revista
Título del volumen
Editor
Resumen
El virus Zika (ZIKV) pertenece al género de los Flavivirus (FV). Como muchos
miembros de este género, posee un genoma de ARN simple hebra de polaridad positiva
relativamente pequeño de sólo 11.000 bases, viriones con una envoltura lipídica y un
tamaño promedio de 50 nm. Sin embargo, también cuenta con características únicas que
lo distingue de otros FV. Durante mi trabajo de tesis doctoral, nos enfocamos en el estudio
de los mecanismos relacionados a dos de estas características distintivas de ZIKV.
Por un lado, investigamos la gran capacidad de ZIKV de diseminarse dentro de su
hospedador. Este virus logra infectar tejidos de difícil acceso para la mayoría de los
patógenos humanos, como es el tejido nervioso central. Para lograrlo, debe ser capaz de
atravesar complejas barreras biológicas. Sin embargo, los mecanismos que emplea para
esto permanecen sin comprenderse completamente.
Por lo tanto, decidimos abordar esta incógnita, a través de distintos modelos
experimentales. Inicialmente, nos enfocamos en investigar la posibilidad de que ZIKV
logre alterar la integridad de las uniones intercelulares (UI) como parte de un mecanismo
de patogenicidad que facilite atravesar barreras biológicas por una vía paracelular. Para
ello, desarrollamos un modelo de infección in vitro de ZIKV, en colaboración con el
Instituto Nacional de Enfermedades Virales Humanas (INEVH) “Dr. Julio Maiztegui”,
donde obtuvimos acceso a 3 aislamientos virales de ZIKV. Utilizando dicho modelo
realizamos ensayos de inmunofluorescencia (IF) para evidenciar cambios en la
abundancia y localización de proteínas celulares constituyente de las UI. Seleccionamos a
la proteína celular Ocludina como marcador de la integridad de las uniones estrechas y a
la proteína DLG1 (del inglés Disc Large 1) como marcador de integridad de las uniones
adherentes. Además, para evaluar de forma más precisa y reproducible los cambios que
podrían sufrir estas proteínas durante la infección por ZIKV, desarrollamos un algoritmo
de cuantificación automatizada de la fluorescencia asociada a la expresión de dichas
proteínas celulares, basado en la segmentación de las imágenes. Luego del análisis
cuantitativo de imágenes obtenidas a partir de ensayos de IF, observamos una reducción
en los niveles de expresión de las proteínas Ocludina y DLG1 tras la infección con
distintas cepas virales, aunque sin cambios significativos en la localización subcelular de
tales marcadores.
Estos resultados nos alentaron a buscar la existencia de mecanismos alternativos o
complementarios que podrían influir en la diseminación del virus dentro de sus hospedadores. Por lo tanto, estudiamos la posibilidad de que el virus emplee mecanismos
transcelulares de diseminación, en donde manipularía a su favor componentes de las vías
secretoras celulares para facilitar su transporte y liberación dentro de la células que
componen las barreras biológicas. En este contexto, analizamos factores celulares que
podrían estar implicados en las etapas tardías del ciclo de replicación de ZIKV, que hasta
el momento resultan poco comprendidas. Para esto, realizamos ensayos de proteómica
donde evaluamos los cambios en el proteoma de células humanas en presencia de la
proteína no estructural 1 (NS1) de ZIKV. Esta es la única proteína viral de ZIKV que es
secretada al espacio extracelular y se ha reportado que participa tanto en los mecanismos
de ensamblaje como de liberación de las partículas virales. Nos enfocamos en buscar
posibles proteínas celulares relacionadas a mecanismos de transporte intracelular que
hubiesen cambiado su nivel de expresión en presencia de NS1. Interesantemente,
encontramos que la proteína celular sinaptotagmina-9 (SYT9) mostró un gran aumento de
sus niveles de expresión en presencia de dicha proteína viral. SYT9 es una proteína
celular poco estudiada hasta el momento, aunque existen reportes que sugieren que
podría ser crucial en mecanismos de transporte intracelulares asociados a vesículas en
diversos tejidos. Este hallazgo resultó muy interesante si se contempla que tanto NS1
como los nuevos viriones de ZIKV producidos durante una infección, son liberados de las
células mediante transporte vesicular. Por lo tanto, nos propusimos realizar ensayos de
microscopia confocal de fluorescencia y Western Blot (WB) para profundizar dicho
hallazgo. En este contexto, pudimos demostrar que la presencia de proteínas virales
relacionadas a la liberación y ensamblado de los nuevos viriones de ZIKV como son NS1
o la proteína estructural de la envoltura (E), incrementan significativamente la expresión
de la proteína celular SYT9. Además, en los ensayos de microscopía confocal de
fluorescencia fue posible evidenciar que NS1 y E de ZIKV inducen una fuerte
redistribución de SYT9 con un intenso patrón de co-localización con ambas proteínas
virales. Además, pudimos reforzar nuestros resultados al demostrar que durante la
infección por ZIKV la proteína SYT9 sufre cambios similares a los descriptos
anteriormente en relación a su expresión y localización subcelular, mostrando
nuevamente una intensa co-localización con las proteínas virales NS1 y E de ZIKV en
modelos de infección in vitro. Si bien otros estudios son necesarios para profundizar estos
hallazgos, estos resultados son muy importantes dado que es la primera vez que puede asociarse una proteína de la familia de las sinaptotagminas con el ciclo de replicación de
los FV.
Por otro lado, también decidimos investigar la particular epidemiología de ZIKV.
Principalmente, nos abocamos a estudiar las diferencias genéticas existentes entre las
cepas de linaje Asiático responsables de las epidemias por ZIKV y las cepas pre
epidémicas tanto de linaje asiático como africano (los 2 únicos linajes descriptos para
ZIKV). Además, también estudiamos si las cepas epidémicas responsables de los casos
asociados a neuropatologías (principalmente microcefalia) poseían variantes genéticas
únicas respecto a las demás cepas epidémicas asociadas a casos sintomáticos más
leves. Para ello, generamos una base de datos con secuencias genómicas completas de
ZIKV que se encontraban disponibles en repositorios digitales. Luego, desarrollamos un
algoritmo bioinformático para comparar las secuencias asiáticas epidémicas con los
demás grupos, y registrar todas las variantes nucleotídicas así como información
relevante asociada a estas variantes, incluyendo: sus posiciones en el genoma, sus
consecuencias traduccionales y la frecuencia de cada variante dentro de cada uno de los
grupos de secuencias mencionados. Posteriormente, evaluamos la distribución de estas
variantes en el genoma de ZIKV para determinar si existían genes con diferente tasa de
variabilidad. Además, analizamos en profundidad la frecuencia de cada variante, con el
objetivo de encontrar variantes que fueran comunes a todas las secuencias de un
determinado grupo de aislamientos de ZIKV. Finalmente, estimamos el impacto de estas
mutaciones sobre la estabilidad de las proteínas virales utilizando como parámetro la
variación de la energía libre de Gibbs del plegamiento de las proteínas (ΔΔG) y realizando
un modelado proteico de las variables más relevantes epidemiológicamente. De esta
manera, logramos identificar varias nuevas variantes genéticas que afectarían la
estructura de las proteínas virales y que, a su vez, están presentes en todas las
secuencias de los aislamientos epidémicos, pero en ninguna de las secuencias pre
epidémicas. Estos datos podrían servir como un importante punto de partida para futuros
estudios biológicos para comprender fehacientemente el impacto de estos cambios en las
características de las cepas emergentes.
En resumen, teniendo en cuenta los resultados obtenidos durante este trabajo de
Tesis Doctoral podemos concluir que el mismo aporta al conocimiento integral de los
mecanismos subyacentes a las particularidades biológicas y epidemiológicas
demostradas para un virus con impacto importante en la salud pública regional. Durante este trabajo, fue posible mejorar nuestro entendimiento de los mecanismos patogénicos
que ZIKV utiliza para diseminarse dentro de su hospedador. Además, fue posible
identificar potenciales factores celulares que el virus necesitaría para completar su ciclo
de vida durante el curso de una infección y que podrían interpretarse como potenciales
blancos terapéuticos en futuras investigaciones. Por otro lado, con este trabajo de tesis
también hemos aportado a dilucidar las razones por las cuales este virus podría haber
logrado desarrollar la última epidemia en América. Esto último nos permite conocer mejor
la biología de este virus y sentar las bases para una mejor estrategia preventiva en caso
de nuevas emergencias por ZIKV.
Palabras clave
Zika, Uniones intercelulares, SYT9, Bioinformática