Mecanismos conservados de patogénesis viral: Alteración de la polaridad celular y de las uniones intercelulares

Los procesos celulares básicos, como el crecimiento y división celular, son guiados por una asimetría especial que adoptan lípidos y proteínas dentro de la célula. Esta disposición de componentes celulares se conoce como polaridad celular y las proteínas de polaridad son las encargadas de su regulación. Durante años se ha estudiado la relación entre alteraciones en la expresión de estas proteínas con el desarrollo oncogénico. A su vez, también, se conoce que diferentes tipos de virus humanos, oncogénicos y no oncogénicos, son capaces de interferir y alterar la expresión de estas proteínas como parte de su mecanismo de patogénesis. Entre aquellos virus oncogénicos se encuentran los Virus de Papiloma Humano (HPV, por sus siglas en inglés Human Papilloma Virus) tipo 16 (HPV-16) y 18 (HPV-18), ya que su infección está altamente asociada al desarrollo de cáncer cervical, y se los ha vinculado también a la progresión de otros tipos de tumores. La actividad transformante de estos virus se asienta principalmente en la acción conjunta de dos de sus proteínas, E6 y E7. La oncoproteína E6 es capaz de unirse a los dominios de interacción proteica denominados PDZ (su nombre deriva de: PSD-95 (del inglés, Postsynaptic density protein 95), DLG1 (del inglés, Disc Large 1) y ZO-1 (del inglés, Zonula Occludens 1)). Muchas proteínas de polaridad poseen en sus secuencias dominios PDZ y se ha demostrado que las mismas presentan alteraciones en su localización y en los niveles de su expresión relacionándose con el desarrollo de patologías. La relación de E6 de HPV con la proteína de polaridad DLG1 ha sido muy estudiada y se propuso como el principal blanco de HPV-18. DLG1 se encuentra involucrada en la organización de uniones intercelulares adherentes que contribuyen a la polarización celular. En primera instancia, se observó que la sobre-expresión de E6 estimula la degradación de DLG1 por un mecanismo dependiente de proteasomas. Por otro lado, para poder analizar la relación de esta proteína de polaridad con el desarrollo de la carcinogénesis mediada por HPV, en nuestro laboratorio se analizó la expresión de DLG1 por inmunohistoquimica en muestras histológicas de pacientes con lesiones cervicales asociadas a HPV oncogénico. En estos experimentos se demostró que, en lesiones precursoras al carcinoma invasivo, los niveles de DLG1 se encuentran incrementados en comparación al epitelio estratificado de la mucosa normal y al mismo tiempo que su localización tisular y celular está alterada. En este caso, la expresión de DLG1 se observó disminuida en los bordes celulares donde normalmente se localiza, con una clara redistribución hacia el citoplasma. Subsecuentemente, con el fin de analizar en más detalle los mecanismos involucrados en estas observaciones, se emplearon cultivos organotípicos raft de queratinocitos humanos (que permiten reproducir in vitro epitelios escamosos) expresando E6 y E7 de HPV de alto riesgo oncogénico, y de este modo se analizó el efecto de las proteínas virales sobre DLG1. Así, se pudo demostrar que la deslocalización e incremento de los niveles de DLG1, observados previamente en biopsias de pacientes, son producto de la expresión de estas oncoproteínas virales. Interesantemente, otros estudios han brindado evidencia de que la proteína DLG1 presenta cambios en su distribución y abundancia celular en varios tumores, lo cual sugiere que funciona como supresor tumoral. Sin embargo, en ciertos contextos biológicos podría favorecer el desarrollo oncogénico, especialmente cuando está deslocalizada. A partir de estas observaciones podemos notar que la relación de DLG1 con proteínas virales es compleja y, por lo tanto, se requiere ahondar aún más en su análisis. Por esta razón, parte de este trabajo de Tesis se enfocó en profundizar los estudios sobre la relación HPV-DLG1 que nos permitan comprender mejor el rol de esta proteína de polaridad en el desarrollo de la carcinogénesis. En línea con lo expuesto, en este trabajo de Tesis, generamos un modelo celular epitelial que nos permitió mimetizar el escenario de las alteraciones sufridas por DLG1 observadas en biopsias de pacientes con lesiones ligadas a infección con HPV, y así, pudimos profundizar el estudio de los posibles mecanismos involucrados. Pudimos determinar que la co-expresión de DLG1 y E6 de HPV18 (E618) provoca alteraciones en la localización subcelular de ambas proteínas de manera dependiente del motivo de unión a PDZ presente en E618. Además, estos estudios nos permitieron determinar que la expresión conjunta de las oncoproteínas E618 y E718 (E7 de HPV18) promueve la re-distribución subcelular de DLG1 y que E718 no tiene una interacción directa con DLG1 en este contexto. Analizando los niveles de expresión de DLG1 pudimos determinar que E718 ejerce un efecto estabilizador sobre esta proteína de polaridad, aún en presencia de E618 en condiciones de degradación. Más aún, demostramos que la actividad de E718 sobre DLG1, tanto de estabilización como de deslocalización, se encuentra especialmente ligada a la fosforilación de la proteína viral en el sitio de reconocimiento para la quinasa CKII (del inglés, Casein Kinase II) presente en su secuencia. Esto resulta de mucho interés dado que E7 es capaz de interaccionar con numerosos blancos celulares y su fosforilación puede favorecer estas interacciones, por lo tanto, es probable que la fosforilación por CKII regule las principales funciones de E7 requeridas para la estabilización y re-localización de DLG1. Aún más, a partir de análisis llevados a cabo como parte de esta Tesis, demostramos que E718 también es capaz de regular la abundancia de otra proteína de polaridad clave como hScrib, el principal blanco de HPV-16. Por lo tanto, procedimos a investigar el efecto de E616 y E716 sobre la expresión de dicha proteína celular con el fin de analizar un posible mecanismo de patogénesis conservado entre distintos tipos de HPV de alto riesgo oncogénico. En este sentido, pudimos concluir que la actividad de E7 está conservada en otros tipos de HPV de alto riesgo en relación a la estabilización de proteínas de polaridad. Estos resultados, en conjunto, contribuyen al entendimiento molecular de la alteración de la polaridad celular durante la oncogénesis mediada por los oncovirus HPV. Por otro lado, como se mencionó anteriormente, existen virus no oncogénicos que también son capaces de interferir con la función y expresión de proteínas celulares de polaridad. En este sentido, iniciamos estudios con el virus Zika (ZIKV) como un modelo de virus no oncogénico. El ZIKV es transmitido por mosquitos del género Aedes perteneciente al género flavivirus. Además, existen evidencias de su trasmisión sexual y vertical. Entre los signos y síntomas comunes en personas infectadas se encuentran cuadros de fiebre, letargo, conjuntivitis, sarpullidos y artralgias. Sin embargo, en la última década el ZIKV ha sido relacionado con el desarrollo de enfermedades severas como el Síndrome de Guillain Barré y microcefalia congénita. En Argentina se han confirmado casos autóctonos e importados y en los últimos años ha adquirido creciente relevancia epidemiológica. Con el fin de extender los ensayos sobre el efecto de la infección de este flavivirus en la polaridad celular epitelial, se desarrolló la puesta a punto de la metodología de infección en la línea epitelial A549 a través de una colaboración con el Instituto Nacional de Enfermedades Virales Humanas “Dr. J. Maiztegui”. Luego, como parte de este trabajo de Tesis, se optimizaron las condiciones experimentales para el análisis de la expresión de DLG1 como marcador de polaridad celular en el modelo epitelial tras la infección con aislamientos regionales de ZIKV. Esto permitió sentar las bases para futuros estudios en nuestro laboratorio en relacioón a virus no oncogénicos y la disrupción de la polaridad celular. En resumen, teniendo en cuenta los datos alcanzados, este trabajo de Tesis Doctoral aporta al conocimiento integral de los mecanismos que regulan la expresión de proteínas de polaridad, contribuyendo al entendimiento de los posibles mecanismos involucrados en infecciones por virus de gran impacto clínico como el HPV (modelo oncogénico) y el ZIKV (como modelo no oncogénico). Este trabajo también robustece la idea de la existencia de mecanismos comunes de patogénesis viral donde la alteración de la expresión de proteínas de polaridad celular podría favorecer la diseminación viral y/o el desarrollo de patologías asociadas.