Examinando por Autor "Vila, Alejandro J."
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Ítem Acceso Abierto 2-Mercaptomethyl-thiazolidines use conserved aromatic–S interactions to achieve broad-range inhibition of metallo-β-lactamases(Royal Society of Chemistry, 2021-01-05) Rossi, María Agustina; Martínez, Verónica; Hinchliffe, Philip; Mojica, María F.; Castillo, Valerie; Moreno, Diego M.; Smith, Ryan; Spellberg, Brad; Drusano, George L.; Banchio, Claudia; Bonomo, Robert A.; Spencer, James; Vila, Alejandro J.; Mahler, Graciela; https://orcid.org/0000-0003-4720-4070; https://orcid.org/0000-0002-3697-5219; https://orcid.org/0000-0001-8611-4743; https://orcid.org/0000-0002-1380-9824; https://orcid.org/0000-0001-5493-8537; https://orcid.org/0000-0002-4602-0571; https://orcid.org/0000-0002-7978-3233; https://orcid.org/0000-0003-0612-0516Infections caused by multidrug resistant (MDR) bacteria are a major public health threat. Carbapenems are among the most potent antimicrobial agents that are commercially available to treat MDR bacteria. Bacterial production of carbapenem-hydrolysing metallo-β-lactamases (MBLs) challenges their safety and efficacy, with subclass B1 MBLs hydrolysing almost all β-lactam antibiotics. MBL inhibitors would fulfil an urgent clinical need by prolonging the lifetime of these life-saving drugs. Here we report the synthesis and activity of a series of 2-mercaptomethyl-thiazolidines (MMTZs), designed to replicate MBL interactions with reaction intermediates or hydrolysis products. MMTZs are potent competitive inhibitors of B1 MBLs in vitro (e.g., Ki = 0.44 μM vs. NDM-1). Crystal structures of MMTZ complexes reveal similar binding patterns to the most clinically important B1 MBLs (NDM-1, VIM-2 and IMP-1), contrasting with previously studied thiol-based MBL inhibitors, such as bisthiazolidines (BTZs) or captopril stereoisomers, which exhibit lower, more variable potencies and multiple binding modes. MMTZ binding involves thiol coordination to the Zn(II) site and extensive hydrophobic interactions, burying the inhibitor more deeply within the active site than D/L-captopril. Unexpectedly, MMTZ binding features a thioether–π interaction with a conserved active-site aromatic residue, consistent with their equipotent inhibition and similar binding to multiple MBLs. MMTZs penetrate multiple Enterobacterales, inhibit NDM-1 in situ, and restore carbapenem potency against clinical isolates expressing B1 MBLs. Based on their inhibitory profile and lack of eukaryotic cell toxicity, MMTZs represent a promising scaffold for MBL inhibitor development. These results also suggest sulphur–π interactions can be exploited for general ligand design in medicinal chemistry.Ítem Acceso Abierto A general reaction mechanism for carbapenem hydrolysis by mononuclear and binuclear metallo-β-lactamases(Nature, 2017-09-14) Lisa, María Natalia; Palacios, Antonela R.; Aitha, Mahesh; González, Mariano M.; Moreno, Diego M.; Crowder, Michael W.; Bonomo, Robert A.; Spencer, James; Tierney, David L.; Llarrull, Leticia Irene; Vila, Alejandro J.Ítem Acceso Abierto Arabidopsis thaliana Hcc1 is a Sco-like metallochaperonefor Cu A assembly in Cytochrome c Oxidase(Wiley, 2020-12) Llases, María Eugenia; Lisa, María Natalia; Morgada, Marcos Nicolás; Giannini, Estefanía; Alzari, Pedro M.; Vila, Alejandro J.The assembly of the CuA site in Cytochrome c Oxidase (COX) is a criticalstep for aerobic respiration in COX-dependent organisms. Several geneproducts have been associated with the assembly of this copper site, themost conserved of them belonging to the Sco family of proteins, whichhave been shown to perform different roles in different organisms. Plantsexpress two orthologs of Sco proteins: Hcc1 and Hcc2. Hcc1 is known tobe essential for plant development and for COX maturation, but its precisefunction has not been addressed until now. Here, we report the biochemi-cal, structural and functional characterization of Arabidopsis thaliana Hcc1protein (here renamed Sco1). We solved the crystal structure of the Cu+1-bound soluble domain of this protein, revealing a tri coordinated environ-ment involving a CxxxCxnH motif. We show that AtSco1 is able to workas a copper metallochaperone, inserting two Cu+1 ions into the CuA site ina model of CoxII. We also show that AtSco1 does not act as a thiol-disul-fide oxido-reductase. Overall, this information sheds new light on the bio-chemistry of Sco proteins, highlighting the diversity of functions amongthem despite their high structural similarities.Ítem Acceso Abierto Biochemistry of copper site assembly in heme-copper oxidases: a theme with variations(MDPI, 2019-08-05) Llases, María Eugenia; Morgada, Marcos Nicolás; Vila, Alejandro J.Ítem Acceso Abierto Cerebrospinal fuid (CSF) augments metabolism and virulence expression factors in Acinetobacter baumannii(Nature Research, 2021-02-26) Martínez, Jasmine; Razo Gutiérrez, Chelsea; Razo Gutiérrez, Chelsea; Courville, Robert; Pimentel, Camila; Liu, Christine; Fung, Sammie E.; Tuttobene, Marisel Romina; Phan, Kimberly; Vila, Alejandro J.; Shahrestani, Parvin; Jimenez, Veronica; Tolmasky, Marcelo E.; Becka, Scott A.; Papp Wallace, Krisztina M.; Bonomo, Robert A.; Soler Bistue, Alfonso; Sieira, Rodrigo; Ramírez, María SoledadIn a recent report by the Centers for Disease Control and Prevention (CDC), multidrug resistant (MDR) Acinetobacter baumannii is a pathogen described as an “urgent threat.” Infection with this bacterium manifests as diferent diseases such as community and nosocomial pneumonia, bloodstream infections, endocarditis, infections of the urinary tract, wound infections, burn infections, skin and soft tissue infections, and meningitis. In particular, nosocomial meningitis, an unwelcome complication of neurosurgery caused by extensivelydrug resistant (XDR) A. baumannii, is extremely challenging to manage. Therefore, understanding how A. baumannii adapts to diferent host environments, such as cerebrospinal fuid (CSF) that may trigger changes in expression of virulence factors that are associated with the successful establishment and progress of this infection is necessary. The present invitro work describes, the genetic changes that occur during A. baumannii infltration into CSF and displays A. baumannii’s expansive versatility to persist in a nutrient limited environment while enhancing several virulence factors to survive and persist. While a hypervirulent A. baumannii strain did not show changes in its transcriptome when incubated in the presence of CSF, a lowvirulence isolate showed signifcant diferences in gene expression and phenotypic traits. Exposure to 4% CSF caused increased expression of virulence factors such as fmbriae, pilins, and iron chelators, and other virulence determinants that was confrmed in various model systems. Furthermore, although CSF’s presence did not enhance bacterial growth, an increase of expression of genes encoding transcription, translation, and the ATP synthesis machinery was observed. This work also explores A. baumannii’s response to an essential component, human serum albumin (HSA), within CSF to trigger the diferential expression of genes associated with its pathoadaptibility in this environment.Ítem Acceso Abierto Characterisation of ST25 NDM-1-producing Acinetobacter spp. strains leading the increase in NDM-1 emergence in Argentina(Elsevier, 2020-09-02) Rodgers, Deja; Pasteran, Fernando; Calderon, Manuel; Jaber, Sara; Traglia, German M.; Albornoz, Ezequiel; Corso, Alejandra; Vila, Alejandro J.; Bonomo, Robert A.; Adams, Mark D.; Ramírez, María SoledadÍtem Acceso Abierto COA6 is structurally tuned to function as a thiol-disulfide oxidoreductase in copper delivery to mitochondrial cytochrome c oxidase(Cell Press, 2019-12-17) Soma, Shivatheja; Morgada, Marcos Nicolás; Naik, Mandar T.; Boulet, Aren; Roesler, Anna A.; Dziuba, Nathaniel; Ghosh, Alok; Yu, Qinhong; Lindahl, Paul A.; Ames, James B.; Leary, Scot C.; Vila, Alejandro J.; Gohil, Vishal M.Ítem Acceso Abierto CuA-based chimeric T1 copper sites allow for independent modulation of reorganization energy and reduction potential(Royal Society of Chemistry, 2021-02-04) Szuster, Jonathan; Zitare, Ulises A.; Castro, María A.; Leguto, Alcides J.; Morgada, Marcos Nicolás; Vila, Alejandro J.; Murgida, Daniel H.Ítem Acceso Abierto Deciphering the evolution of metallo-β-lactamases: A journey from the test tube to the bacterial periplasm(American Society for Biochemistry and Molecular Biology Inc., 2022-02-01) López, Carolina; Delmonti, Juliana; Bonomo, Robert A.; Vila, Alejandro J.Ítem Acceso Abierto Engineering a bifunctional copper site in the cupredoxin fold by loop-directed mutagenesis(Royal Society of Chemistry, 2018-06-28) Espinoza Cara, Andrés; Zitare, Ulises A.; Alvarez Paggi , Damián; Klinke, Sebastián; Otero, Lisandro H.; Murgida, Daniel H.; Vila, Alejandro J.; https://orcid.org/0000-0003-0500-4513; https://orcid.org/0000-0003-0248-6916; https://orcid.org/0000-0002-1507-9685; https://orcid.org/0000-0002-8777-0870; https://orcid.org/0000-0002-5448-5483; https://orcid.org/0000-0001-5173-0183; https://orcid.org/0000-0002-7978-3233Copper sites in proteins are designed to perform either electron transfer or redox catalysis. Type 1 and CuA sites are electron transfer hubs bound to a rigid protein fold that prevents binding of exogenous ligands and side reactions. Here we report the engineering of two Type 1 sites by loop-directed mutagenesis within a CuA scaffold with unique electronic structures and functional features. A copper–thioether axial bond shorter than the copper–thiolate bond is responsible for the electronic structure features, in contrast to all other natural or chimeric sites where the copper thiolate bond is short. These sites display highly unusual features, such as: (1) a high reduction potential despite a strong interaction with the axial ligand, which we attribute to changes in the hydrogen bond network and (2) the ability to bind exogenous ligands such as imidazole and azide. This strategy widens the possibility of using natural protein scaffolds with functional features not present in nature.Ítem Acceso Abierto Estudio bioquímico y estructural de la metalo-beta-lactamasa NDM-1: residuos de segunda esfera e implicancias de su anclaje a membrana(2019) Giannini, Estefanía; Vila, Alejandro J.La resistencia bacteriana a antibióticos representa hoy una de las amenazas más serias a la salud. Las infecciones causadas por bacterias resistentes son cada vez más comunes en los ambientes clínicos, y algunos patógenos se han vuelto resistentes a varias clases de antibióticos, limitando las posibilidades de tratamiento. En particular, la diseminación mundial de bacterias Gram-negativas resistentes a carbapenemes se ha vuelto una causa importante de morbilidad y mortalidad. Las carbapenemasas son β-lactamasas capaces de hidrolizar los carbapenemes (antibióticos β-lactámicos utilizados como último recurso terapéutico para el tratamiento de infecciones resistentes a la mayoría de los fármacos). Las carbapenemasas de mayor diseminación clínica son las metalo-β-lactamasas (MBLs), enzimas con una gran versatilidad, ya que son capaces de inactivar igualmente bien las penicilinas, cefalosporinas y carbapenemes. En la actualidad, no existen inhibidores de MBLs de uso clínico. La carbapenemasa NDM-1, se ha expandido a más de 80 países en solamente 12 años y su gen se encuentra acoplado a un cassette de multi-resistencia. Más aún, el gen de NDM-1 ha sido encontrado en gran cantidad de bacterias ambientales en la comunidad, por lo cual su riesgo de diseminación es aún mayor. La enzima NDM-1 posee un sitio activo conservado en todas las MBLs de impacto clínico (como las enzimas del tipo VIM, IMP y SPM). Estas poseen dos sitios de unión a metal, el llamado sitio Zn1, compuesto por los residuos His116, His118 e His196, y el sitio Zn2, formado por los residuos Asp120, Cys221 e His263. Ambos iones Zn(II) son esenciales y están implicados en el mecanismo de hidrólisis de los antibióticos β-lactámicos. Asimismo, las MBLs poseen un conjunto de residuos de segunda esfera de coordinación (RSCs) que forman una red de enlaces de hidrógeno conservada por debajo de la base del sitio activo. Esta red involucra residuos de distintas regiones de la cadena polipeptídica y uno o más de los ligandos metálicos. NDM-1 difiere de las demás enzimas de su clase debido a su localización celular: es una lipoproteína anclada a la cara interna de la membrana externa de organismos Gram-negativos, mientras que las demás MBLs caracterizadas son enzimas periplasmáticas solubles. Esta localización celular se debe a la presencia de una señal de lipidación denominada lipobox dentro del péptido líder de NDM-1, la cual es reconocida por un sistema biosíntesis de lipoproteínas altamente conservado en bacterias. Se encuentra ampliamente reportado que el ambiente biológico influye en el plegamiento, la estabilidad y la función proteica. Estudios previos realizados en nuestro laboratorio, revelaron que las determinaciones de actividad de MBLs solubles en extractos periplasmáticos reflejan mucho mejor las influencias del entorno nativo de estas enzimas respecto a las determinaciones in vitro con proteínas recombinantes. En el caso particular de las proteínas que se encuentran en el entorno de las membranas biológicas, hay cada vez más evidencia del rol activo de los lípidos en la modulación de su actividad. Por este motivo, en este trabajo de Tesis, nos propusimos desarrollar un sistema modelo para caracterizar NDM-1 simulando su entorno nativo de membrana. La evaluación de actividad β-lactamasa de NDM-1 en preparaciones de membranas totales, micelas de Tritón X-100 y esferoplastos de E. coli, reveló que la enzima se encontraba activa en los tres sistemas. La comparación de NDM-1 en su forma lipidada en esferoplastos y soluble en periplasma, mostró un incremento de eficiencia catalítica para la variante soluble NDM-1-C26A, principalmente influenciado por el valor de KM. Esta diferencia nos permitió hipotetizar que el sitio activo de la variante soluble podría estar más accesible al medio, mientras que en el caso de NDM-1 lipidada su cercanía a la membrana podría estar afectando la unión del sustrato. Por otro lado, ensayos de estabilidad cinética de NDM-1 luego del agregado de Proteinasa K, revelaron que el anclaje no altera la estabilidad de NDM-1 respecto a la de su variante soluble. Continuando con la caracterización de NDM-1 en su forma lipidada, se logró sobreexpresar y purificar la enzima en complejo con detergentes. Se realizaron pruebas de cristalogénesis y fue posible obtener cristales del complejo NDM-1-DDM. Si bien la resolución no fue suficientemente para resolver la estructura e inferir sobre la posible orientación de NDM-1 respecto a la membrana, resulta interesante continuar trabajando en la optimización de los mismos. Por último, se estudió el impacto de mutaciones en RSCs en NDM-1. Estos RSCs modulan fuertemente la estructura y función de las enzimas, siendo capaces de modular tanto la afinidad por Zn(II) como la especificidad de sustrato de las MBLs de impacto clínico. Resulta interesante comprender estos fenómenos y el impacto de mutaciones en RSCs en la evolución de MBLs hacia enzimas optimizadas. Hasta el momento se han reportado 27 variantes alélicas de NDM-1, las cuales son poco divergentes y ninguna posee mutaciones en RSCs. Se aleatorizaron los codones en tres posiciones correspondientes a RSCs (D84, K121 y S262) y se seleccionaron mutantes funcionales. En general la capacidad de las mutantes de conferir resistencia frente a los antibióticos β-lactámicos ensayados fue menor que la de NDM-1, sin embargo, mostraron eficiencias catalíticas dentro del mismo orden. Por otro lado, se evaluó la estabilidad de estas mutantes en condiciones de limitación de metal. Resultó interesante el incremento de estabilidad observado para el apo-derivado (enzima inactiva sin metal) de la mutante K121S. Este incremento resulta relevante en los sitios de infección, donde el hospedador libera al medio grandes cantidades de proteínas quelantes de metal que reducen la disponibilidad del cofactor Zn(II), esencial para la actividad de las MBL. Esta mutación podría resultar, en combinación con otras, relevante en la evolución de NDM-1, fijando nuevos caminos evolutivos de esta enzima de reciente aparición.Ítem Acceso Abierto Estudio bioquímico y estructural del ensamblado del centro CuA de Arabidopsis thaliana(2020) Llases, María Eugenia; Vila, Alejandro J.El cobre es un metal de transición clave para la vida, dado que permite a las proteínas catalizar una variedad de reacciones esenciales. El centro de cobre “CuA” de la Citocromo c Oxidasa (COX) es esencial para la respiración aeróbica de los organismos dependientes de COX. Una serie de genes que codifican para factores de ensamblado de dicho centro, son esenciales para la actividad de COX. Entre ellos, las proteínas de la familia Sco se encuentran altamente conservadas, y se ha demostrado que cumplen funciones variables entre organismos. Las plantas expresan dos proteínas de la familia Sco, Hcc1 y Hcc2, siendo Hcc1 esencial para la viabilidad de la planta. En el presente tesis se diseñó una proteína quimérica que funciona como modelo soluble de la subunidad CoxII de Arabidopsis thaliana, que contiene al centro CuA. Se analizaron sus características estructurales mediante varias espectroscopías, y se resolvió su estructura cristalográfica. Se identificaron y analizaron perturbaciones en la estructura electrónica del centro de cobre, causadas por mutaciones en la segunda esfera de coordinación. Se identificó la presencia de densidad electrónica sobre un ligando clave del centro CuA, la metionina axial. Esta información valida la participación de dicho residuo en la vía de trasferencia electrónica de la COX. Además, se expresó el dominio soluble del proteína Hcc1 de A. thaliana. Se confirmó que es capaz de unir cobre con elevada afinidad, se analizó la estructura del sitio de cobre en sus dos estados de oxidación posibles y se resolvió su estructura cristalográfica. Además, analizó su función in-vitro, demostrando que esta proteína es una metalochaperona, capaz de insertar iones de cobre específicamente para ensamblar el centro CuA.Ítem Embargo Estudio de la evolución natural de la carbapenemasa NDM(2023) Delmonti, Juliana; Vila, Alejandro J.La resistencia a antibióticos es una de las principales causas de mortalidad y morbilidad en el mundo. Los carbapenemes son antibióticos de último recurso en la clínica, amenazados por la actividad de las carbapenemasas. Dentro de éstas, NDM es una de las metalo-βlactamasas más diseminadas. La falta de inhibidores clínicos la convierte en un problema sanitario grave. NDM depende de la unión de Zn(II) a su sitio activo para su actividad y estabilidad in vivo. Durante una infección, la respuesta inmune innata del hospedador limita la disponibilidad de Zn(II), reduciendo los niveles periplasmáticos del metal. Como consecuencia, NDM se inactiva, acumulándose como apo-NDM, es decir sin Zn(II) en el sitio activo. Además, apo-NDM es susceptible a degradación por las proteasas periplasmáticas Prc y DegP, perdiendo la capacidad de conferir resistencia. Sin embargo, las variantes clínicas de NDM acumulan sustituciones que optimizan el fenotipo de resistencia en condiciones de escasez de Zn(II), tales como M154L y E152K. La sustitución M154L está presente en el 43% de las variantes, y se ha sugerido que aumenta la afinidad de la enzima por el Zn(II), pero la evidencia experimental en la literatura es confusa. En cambio, la sustitución E152K parece aumentar la estabilidad in vivo de NDM. Hasta el momento se desconocen de qué manera las características bioquímicas y biofísicas inducidas por estas sustituciones impactan en el fenotipo de resistencia. En esta Tesis nos propusimos estudiar los cambios producidos por estas sustituciones claves a nivel bioquímico y estructural. Por medio de estudios bioquímicos en las variantes NDM-1, NDM-4 (M154L), NDM-15 (M154L A233V) y NDM-6 (A233V) determinamos que la sustitución M154L no afecta la actividad catalítica de la enzima, ni la estabilidad térmica de las formas apo y holo (unida a 2 iones Zn(II)), sino que aumenta la afinidad por el Zn(II) en 2 órdenes de magnitud, lo cual favorecería su capacidad de resistir a condiciones de escasez de este metal. Los estudios estructurales revelan que apo-NDM-4 presenta mayor dinámica que apo-NDM-1, lo que resulta en un sitio más ocluido, que podría limitar la disociación del Zn(II), aumentando la afinidad de la enzima por el mismo. La sustitución E152K (presente en NDM-9) estabiliza a la apo-enzima en el periplasma frente a la limitación de Zn(II). Apo-NDM-9 evade la acción de la proteasa Prc, que es activa frente a apo-NDM-1. Demostramos que el residuo K152 forma un puente salino con D223 (ubicado el bucle L10) en apo-NDM-9, que conecta ambas mitades de la enzima y reduce la dinámica del extremo C-terminal. Este impacto en la dinámica proteica impide el reconocimiento de apo-NDM-9 por Prc, lo que resulta en una mayor estabilidad in vivo. La cercanía en la secuencia de las dos sustituciones estudiadas en este trabajo sugiere que la región que contiene la hélice α3 y el bucle L8 (donde se ubican E152K y M154L, respectivamente) puede modular características de la enzima muy diversas como la afinidad por el Zn(II) y la estabilidad de la enzima. En ambos casos, resulta una región clave para la evolución de la carbapenemasa NDM frente a procesos de limitación de metal.Ítem Acceso Abierto Estudio de la metalo-beta-lactamasa anclada a membrana NDM-1 y análisis de su evolución clínica(Universidad Nacional de Rosario. Facultad de Ciencias Bioquímicas y Farmacéuticas, 2018) Bahr, Guillermo; Vila, Alejandro J.Los carbapenemes son potentes antibióticos β-lactámicos, reservados como drogas de último recurso para el tratamiento de infecciones severas o por parte de organismos resistentes. Desafortunadamente, la creciente prevalencia en las últimas dos décadas de organismos con resistencia a estas drogas, en particular de las Enterobacterias Resistentes a Carbapenemes (CRE), constituye una seria amenaza a la efectividad del uso terapéutico de los mismos. El principal mecanismo de resistencia a carbapenemes es la producción de carbapenemasas, β-lactamasas capaces de degradar el antibiótico e inactivarlo. De acuerdo a su mecanismo catalítico se distinguen dos tipo de estas enzimas: las serín-β-lactamasas que utilizan un residuo de serina en su sitio activo para formar un intermediario covalente con el antibiótico y luego hidrolizarlo, y las metalo-β-lactamasas (MBLs), que utilizan iones Zn(II) para posicionar el sustrato y generar el hidroxilo que actúa como nucleófilo, sin formación de un intermediario covalente. NDM-1 es una de las MBLs de relevancia clínica de más reciente aparición. Desde su identificación en el año 2008, se ha expandido con gran rapidez a nivel mundial, y ya ha sido detectada en más de 70 países. NDM-1 difiere de las demás enzimas de su clase debido a su localización celular: es una lipoproteína anclada a la cara interna de la membrana externa de organismos Gram-negativos, mientras que las demás MBLs caracterizadas son enzimas periplasmáticas solubles. Esta localización celular se debe a la presencia de una señal de lipidación denominada lipobox dentro del péptido líder de NDM-1, reconocida por un sistema biosíntesis de lipoproteínas altamente conservado en bacterias. Hasta el momento se han descripto 19 variantes naturales de NDM, las cuales difieren entre sí por un número reducido de mutaciones puntuales. La presencia de Zn(II) en el sitio activo de las MBLs es indispensable para su funcionamiento. El espacio periplasmático, donde actúan estas enzimas en Gramnegativos, carece de mecanismos capaces de mantener la homeostasis de este metal, por lo que el Zn(II) disponible para las MBLs se encuentra directamente ligado a su concentración extracelular. Esto adquiere importancia durante una infección, dado que el sistema inmune utiliza la respuesta de Inmunidad Nutricional para restringir la disponibilidad de Zn(II) y otros cationes metálicos para el patógeno invasor. Como parte de este mecanismo, los neutrófilos liberan en los sitios de infección grandes concentraciones de calprotectina (CP), una proteína capaz de quelar con alta afinidad Zn(II) y Mn(II). En el presente trabajo de tesis se estudió el efecto de la disponibilidad de Zn(II) sobre la capacidad de conferir resistencia de las MBLs. En particular, se evaluó el efecto del anclaje a membrana de NDM-1 sobre las propiedades de la enzima, haciendo foco en su tolerancia a baja disponibilidad de Zn(II). Además, se buscó evaluar qué características de la enzima se encuentran bajo presión de selección mediante un análisis comparativo de sus alelos clínicos. Para determinar el efecto de la disponibilidad de Zn(II) sobre la funcionalidad de las MBLs, se compararon las resistencias de células de E. coli productoras de las MBLs de mayor relevancia clínica (NDM-1, VIM-2, IMP-1 y SPM-1) en medio de crecimiento suplementado con distintas concentraciones del quelante ácido dipicolínico (DPA). Si bien la resistencia de todas las MBLs se vio reducida gradualmente por adición de cantidades crecientes de DPA, se observó que distintas MBLs presentaban distintos grados de susceptibilidad a la limitación de Zn(II). Se encontró además que la adición de quelantes al medio de crecimiento lleva a la degradación de las MBLs, debido a que las formas desprovistas de metal de las mismas son más sensibles a la proteólisis. Se construyeron mutantes solubles de NDM-1 para analizar cómo afecta el anclaje a membrana las propiedades de la enzima. Si bien estas variantes eran activas y brindaban niveles de resistencia similares a los de NDM-1 salvaje en medio rico, resultaban más sensibles a la reducción en los niveles de Zn(II) extracelulares, y eran degradadas más rápidamente que la enzima salvaje cuando perdían metal. Por lo tanto el anclaje a membrana en NDM-1 contribuye a la adaptación de la enzima a baja disponibilidad de Zn(II), incrementando su estabilidad frente a la proteólisis. La caracterización de los primeros 16 alelos clínicos de NDM-1 demostró que no existen diferencias importantes entre los mismos en cuanto a la resistencia que otorgan en medio de cultivo rico con elevada disponibilidad de Zn(II), en concordancia con reportes previos. Sin embargo, las propiedades de los alelos difieren marcadamente bajo limitación de Zn(II), y gran parte de ellos tienen mayor capacidad de conferir resistencia bajo estas condiciones respecto a NDM-1. Asimismo, muchos de los alelos presentan mayor estabilidad in vivo que NDM-1, observándose los mayores incrementos en esta propiedad a causa de las mutaciones A233V y E152K. Por otro lado, la mutación más frecuente entre los alelos, M154L, contribuye a la adaptación de la enzima a condiciones de baja disponibilidad de Zn(II) mediante el incremento en la afinidad de unión de este metal. Se comprobó también que la localización de NDM-1 en la membrana externa incrementa su secreción a OMVs respecto a las formas solubles de la enzima. Las OMVs (vesículas de membrana externa) son partículas esféricas formadas a partir de protrusiones de la membrana externa de Gram-negativos, que se escinden y liberan de la célula generando una vesícula cerrada rodeada de membrana externa y que contiene en su lumen componentes periplasmáticos. Las OMVs son producidas por todas las bacterias Gram-negativas, bajo todas las condiciones de crecimiento, y se encuentran asociadas a una amplia variedad de procesos tales como adquisición de nutrientes, formación de biofilms, comunicación celular, resistencia a antibióticos y patogénesis. Se encontró que las OMVs que transportan NDM-1 poseen actividad β-lactamasa, y que son capaces de proteger a células sensibles a antibióticos β-lactámicos de la acción de los mismos. Además, la caracterización de OMVs generadas por distintos aislamientos clínicos productores de NDM-1 demostró que estas vesículas pueden contener la enzima así como el gen codificante para la misma. Las OMVs por lo tanto podrían haber contribuido a la rápida diseminación de NDM-1 a nivel mundial.Ítem Acceso Abierto Estudio de los factores moleculares en juego en la evolución de las enzimas metalo‐β‐lactamasas(Universidad Nacional de Rosario. Facultad de Ciencias Bioquímicas y Farmacéuticas, 2014-07-31) Meini, María Rocío; Vila, Alejandro J.Los compuestos β‐lactámicos constituyen uno de los grupos de antibióticos más empleados para el tratamiento de infecciones bacterianas. Al poco tiempo de su introducción, se puso de manifiesto la presencia de mecanismos de resistencia por parte de las bacterias, las cuales evolucionan rápidamente ante la presión de selección impuesta por el uso indiscriminado de dichos compuestos. Dentro de los antibióticos β‐lactámicos, las penicilinas y las cefalosporinas de primera generación son los más utilizados comúnmente, mientras que las cefalosporinas de tercera y cuarta generación y los carbapenemes se reservan para infecciones graves mediadas por cepas multirresistentes. Las metalo‐β‐lactamasas (MBLs) constituyen uno de los mecanismos de resistencia más alarmantes diseminado en los últimos años, debido a su capacidad de hidrolizar tanto penicilinas como cefalosporinas y carbapenemes, dejando escasas alternativas para el tratamiento. A esto se suma que no se cuenta al presente con un inhibidor de uso clínico capaz de inactivarlas. En este contexto, nos propusimos explorar los mecanismos que afectan a nivel molecular la capacidad de conferir resistencia de estas enzimas, y por lo tanto, su evolución. Para ello empleamos como modelo de estudio la enzima BcII de Bacillus cereus. Esta enzima, si bien corresponde a un organismo no patógeno, ha sido extensamente empleada como representante de las MBLs de subclase B1, que incluye las enzimas de más impacto clínico, como las IMPs, VIMs y NDMs. Las MBLs pertenecen a una superfamilia de enzimas, mayormente de actividad hidrolasa, dependientes de la unión de metales divalentes en su sitio activo. En el caso de las MBLs, presentan el potencial de unir dos iones Zn(II) en su sitio activo. Un tema de discusión central en el mecanismo de hidrólisis de las MBLs de subclase B1 ha sido la identidad de la especie activa relevante, pudiendo ser alguna de la especies mono‐Zn(II) o la especie di‐Zn(II). Las enzimas de la superfamilia comparten un plegamiento global similar a pesar de una baja homología de secuencia. Los residuos que conforman el sitio activo actuando como constituyen las regiones de mayor conservación de secuencia. Una particularidad de las enzimas B1 es que presentan como ligando de Zn(II) un residuo de Cys en lugar de un residuo de Asp altamente conservado en la superfamilia en la posición 221. En el presente trabajo se estudió la mutante BcII‐C221D. Esta variante, si bien presenta una actividad análoga a la enzima silvestre, no es capaz de conferir niveles de resistencia comparables. Observamos que esto se debe a una disminución en la afinidad por Zn(II) de uno los sitios de unión. Concluimos que el residuo de Cys en dicha posición es necesario para asegurar la unión de Zn(II). A su vez, esta mutante da cuenta de la necesidad de forma dar la especie di‐Zn(II) en el periplasma, donde debe ensamblarse para conferir resistencia, lo cual demuestra que es la especie relevante in vivo. Por otro lado, trabajamos con una variante de BcII obtenida previamente mediante evolución molecular dirigida contra el antibiótico cefalexina. Esta variante, a la cual denominamos GLVN presenta cuatro mutaciones (G262S, L250S, V112A y N70S) y es capaz de conferir niveles elevados de resistencia para cefalexina a células de Escherichia coli, en contraste a la enzima silvestre. Con el propósito de estudiar los caminos evolutivos posibles desde la enzima silvestre hasta la cuádruple mutante, se construyeron las 16 combinaciones posibles de estas cuatro mutaciones. Se evaluó la capacidad de conferir resistencia a través de concentraciones inhibitorias mínimas (CIMs), lo cual nos da una medida de la denominada aptitud a nivel organismo, evaluada sobre las células bacterianas. De esta manera, observamos que sólo aquellas combinaciones que presentan la mutación G262S son capaces de aumentar los niveles de resistencia contra cefalexina. Las mutaciones V112A y N70S presentan epistasis positiva con G262S, dado que producen efectos beneficiosos para la resistencia en el contexto de G262S, mientras que en el contexto silvestre son, respectivamente, neutral y deletérea. Estas cuestiones condicionan los caminos posibles hacia el óptimo GLVN, siendo accesibles para la evolución adaptativa aquellos en los cuales la mutación G262S aparece en los pasos iniciales. Luego, para analizar los factores moleculares que definen la aptitud para las MBLs, nos planteamos caracterizar en mayor profundidad aquellas variantes que contienen la sustitución G262S. Observamos que esta mutación produce un incremento marcado en la eficiencia hidrolítica de la enzima frente a cefalexina, en forma concomitante al aumento de CIM. Sin embargo, la suma de las demás sustituciones no produce aumentos en la actividad. Encontramos que medidas de actividad realizadas con extractos periplasmáticos muestran una mejor correlación que aquellos realizados con enzimas puras, evidenciando que el estado de la proteína en el periplasma puede ser responsable de las diferencias en la CIMs. Queda en evidencia que existen otras propiedades moleculares, además de la eficiencia hidrolítica in vitro, que están siendo afectadas por estas mutaciones y que contribuyen a la aptitud. Es de esperar que la estabilidad y la capacidad de captar Zn(II) de estas enzimas afecte la cantidad de enzima activa en el periplasma, por lo que se prosiguió con el análisis de estos factores. Se realizaron medidas de la estabilidad térmica en extractos periplasmáticos, y de esta manera se encontró que la mutación G262S produce una disminución en la estabilidad con respecto a la enzima silvestre. La mutación V112A ejerce un efecto compensatorio, aumentando la estabilidad en el contexto de G262S. De igual manera, se observa un efecto estabilizador sobre la triple mutante que contiene las mutaciones G262S/L250S/N70S. Estos aumentos de estabilidad están acompañados de aumentos de CIMs en ambos casos. Sin embargo, la estabilidad por sí sola no alcanza para explicar los aumentos en CIMs observados en los demás casos. Para evaluar la contribución de la capacidad de captar Zn(II) se realizaron medidas de CIMs en condiciones de disponibilidad de Zn(II) variable. Se observó que los valores de CIMs conferidos por la mutante simple G262S presentan una marcada dependencia con la cantidad de Zn(II) en el medio. Esta dependencia disminuye al sumarse cualquiera de las otras tres mutaciones. La variante GLVN, en cambio, es insensible a las condiciones de Zn(II) en el medio. Mediante ensayos de afinidad in vitro comprobamos que la mutación G262S disminuye la afinidad por Zn(II) respecto a la enzima silvestre, y que la mutación N70S compensa esta pérdida restaurando la afinidad a valores cercanos a los de la enzima silvestre. Evaluando globalmente la contribución de los distintos factores a la capacidad de conferir resistencia de estas MBLs, observamos que ante eficiencias hidrolíticas similares, la capacidad de captar Zn(II) es el factor de mayor peso. Las MBLs captan el Zn(II) en el periplasma bacteriano, donde existe una alta competencia por dicho metal, y cuya disponibilidad depende del medio. Durante el proceso infectivo, los mamíferos producen como mecanismo de defensa la proteína calprotectina, que secuestra Zn(II). Es decir, que en el ambiente donde deben actuar las MBLs para la sobrevida de la bacteria, la disponibilidad de Zn(II) se encuentra limitada. Es razonable entonces que la evolución de las MBLs no curse sólo a través de aumentos en la eficiencia hidrolítica, sino que debe ir acompañado de un ajuste en la capacidad de captar Zn(II). Dada la dificultad de diseñar un inhibidor de uso clínico basado en el mecanismo de las MBLs, cabe resaltar que la contribución de la capacidad de unir Zn(II) a la aptitud invita a pensar en nuevas estrategias de inhibición.Ítem Acceso Abierto Estudio estructural e interacción proteína-proteína de Metalochaperonas Mitocondriales(2016) Morgada, Marcos Nicolás; Vila, Alejandro J.El cobre es un metal de transición esencial para la sobrevida de muchos organismos. Es un cofactor importante para proteínas que catalizan procesos fundamentales dentro de las células. Sin embargo fallas en el control de los niveles del mismo pueden desencadenar procesos tóxicos como la reacción de Fenton o la unión de estos iones a sitios proteicos adventicios que llevan a la pérdida de función enzimática de las proteínas afectadas. Debido a esta dualidad esencialidad/toxicidad, las células han generado distintos mecanismos para regular los niveles de cobre de manera de minimizar los efectos tóxicos. Estos mecanismos incluyen la compartimentalización de los iones cobre, la producción metalotioneínas o el bombeo del exceso al espacio extracelular. Un rol fundamental en este proceso de homeostasis lo cumplen proteínas metalochaperonas que unen Cu(I) dentro de las células y lo transfieren de manera específica para la activación de las proteínas que lo emplean como cofactor. En la mitocondria sólo dos proteínas requieren iones cobre para su función. La Cu-Zn superóxido-dismutasa mitocondrial (SOD) que tiene actividad detoxificante y la citocromo c oxidasa (COX) involucrada en el proceso de fosforilación oxidativa. La activación de SOD se da mediante su metalochaperona específica CCS mientras que COX requiere iones cobre para la formación del centro [...]Ítem Acceso Abierto Estudios de inhibición y flexibilidad en enzimas metalo-β-lactamasas(Universidad Nacional de Rosario. Facultad de Ciencias Bioquímicas y Farmacéuticas, 2016-03-28) González, Mariano Martín; Vila, Alejandro J.La resistencia bacteriana a los antibióticos -lactámicos constituye uno de los problemas clínicos más preocupantes en la actualidad y ha sido reconocida por la comunidad científica la urgente necesidad de llevar a cabo programas para la identificación de nuevos compuestos antibacterianos que puedan paliar esta situación. Uno de los mecanismos de resistencia más importantes constituye la expresión de enzimas capaces de inactivar a los -lactámicos denominadas -lactamasas. Las enzimas serín--lactamasas (SBLs), las cuales presentan una Ser esencial en el sitio activo, fueron las primeras enzimas identificadas capaces de inactivar a estos antibióticos. Las -lactamasas dependientes de Zn(II), denominadas metalo--lactamasas (MBLs), fueron identificadas inicialmente en cepas inocuas. Sin embargo, a partir de finales de la década de 1980, nuevas y más eficientes MBLs fueron identificadas en diversas cepas de Enterobacterias y patógenos oportunistas, lo cual promovió el estudio e identificación de los rasgos moleculares y biofísicos que participan durante el mecanismo catalítico y evolución en estas enzimas. El estudio del mecanismo catalítico en las enzimas SBLs permitió el diseño de inhibidores basados en el mecanismo. Hoy en día estos inhibidores se administran junto con los -lactámicos para el tratamiento de infecciones. Sin embargo, debido a que el mecanismo catalítico en las MBLs es fundamentalmente distinto, no ha sido posible identificar inhibidores en base al mecanismo y no hay inhibidores de uso clínico disponibles. Durante el presente trabajo de Tesis se diseñaron y sintetizaron 4 bistiazolidinas que presentan dos anillos de tiazolidina fusionados por un átomo de nitrógeno, un grupo carboxilato similar al carboxilato presente en las posiciones 3 de penicilinas y carbapenemes y en posición 4 de cefalosporinas junto con un grupo tiol que provee un motivo de unión a metal. Estos compuestos constituyen 2 pares de enantiómeros que difieren en la presencia de un grupo gemdimetilo similar al encontrado en las penicilinas. Los mismos fueron ensayados como inhibidores de MBLs de distintas subclases: NDM-1, IMP-1 y BcII (B1), Sfh-I (B2), L1 y GOB-18 (B3). Por otro lado, las MBLs constituyen un sistema modelo ideal para el estudio de la evolución de proteínas, ya que es posible desarrollar un sistema que permita la evolución dirigida de estas enzimas en el laboratorio. Previamente, se había obtenido por estas técnicas una variante evolucionada de BcII que confería mayor resistencia a la bacteria hospedadora contra un antibiótico pobremente hidrolizado por la enzima silvestre. En este trabajo de Tesis exploramos la hipótesis acerca de si la dinámica conformacional en proteínas puede constituir un rasgo evolutivo susceptible de ser optimizado para conferir una mayor capacidad de adaptación a un nuevo desafío funcional. Como conclusiones generales podemos mencionar: 1) Las bistiazolidinas ideadas y sintetizadas para ser ensayadas como inhibidores de MBLs, fueron capaces de inhibir la actividad carbapenemasa de NDM-1, una enzima que se ha diseminado muy rápidamente entre diferentes cepas patógenas en todo el mundo. 2) Asimismo, estos compuestos demostraron ser capaces incluso de inhibir la actividad de enzimas de subclase B1, B2 y B3. Estos resultados indican que las bistiazolidinas son capaces de unirse eficientemente y ejercer un efecto inhibitorio en enzimas con diferentes topologías en los sitios activos. 3) Con excepción del caso de los derivados de la serie L- con Sfh-I, no se observó una clara diferencia en la potencia inhibitoria debida a la estereoquímica de los compuestos ni en la presencia o ausencia del grupo gemdimetilo. Para el caso de Sfh-I se observó una clara preferencia por los derivados de la serie L-, los cuales mostraron una disminución de dos órdenes de magnitud en cuanto a los valores de Ki. 4) Mediante experimentos de RMN demostramos que estos compuestos son capaces de penetrar al interior de la bacteria atravesando la membrana externa de E. coli e inhibir a la enzima in situ. Asimismo, los experimentos de muerte celular llevados a cabo en bacterias que expresan MBLs dan cuenta de la capacidad de estas bistiazolidinas de restaurar la susceptibilidad hacia los -lactámicos. 5) A partir de las estructuras cristalográficas podemos observar que las bistiazolidinas presentan la capacidad de unirse a los sitios activos de las MBLs en diferentes conformaciones. En general, salvo para el caso de L-CS319 con Sfh-I, las bistiazolidinas se unen al sitio activo mediante coordinación del grupo tiol entre ambos iones Zn(II) a distancias similares para Zn1 y Zn2, desplazando a la molécula de agua/hidróxido a puente. El carboxilato de estos compuestos queda interactuando con residuos estructuralmente equivalentes en enzimas de subclase B1 y B3 (Lys224 y Ser223, respectivamente). Para el caso de los derivados de la serie D-, la unión de los compuestos es ligeramente diferente, presentando una interacción entre el N de fusión de anillos con el Zn2, similar a lo observado en las estructuras cristalográficas de aductos enzima:-lactámico. 6) En el caso de L-CS319 unido a Sfh-I se observó que este compuesto se une por medio del carboxilato al sitio metálico, mientras que el grupo tiol se posiciona dentro de la región hidrofóbica 3. Esto contrasta con la estructura reportada entre la enzima B2 CphA y D-captopril, en donde si bien en este caso también el compuesto se une por medio del carboxilato al metal, el tiol queda en una posición más expuesta sobre la superficie del sitio activo. Es posible que la diferencia de potencia inhibitoria de los derivados de la serie L- se deba a que solo estos compuestos presentarían la capacidad de unirse de esta forma a Sfh-I. Dado que las enzimas de subclase B2 son carbapenemasas exclusivas, la topología de los sitios activos de estas enzimas serían capaces de ejercer una mayor restricción en cuanto a qué compuestos pueden ingresar y unirse en los mismos. 7) Por último estudiamos cómo es modulada la flexibilidad conformacional en las MBLs durante la evolución. El estudio por RMN de las variantes BcII wt, BcII G262, BcII N70S y BcII G262/N70S nos permitió establecer que (1) el análisis de las señales en los espectros 1H-15N HSQC indican perturbaciones precisas en la estructura y dinámica proteica que dan cuenta del efecto de las mutaciones en la afinidad por Zn(II); (2) el impacto de las mutaciones en la dinámica depende fuertemente del contexto genético, es decir, es epistático; y (3) la vía exitosa acumula mutaciones sucesivamente incrementando la dinámica de los bucles del sitio activo principalmente en la escala de micro a milisegundos, dando origen a un perfil de sustrato más amplio. Estos resultados nos permiten sugerir que la dinámica conformacional en escalas de tiempo catalíticamente relevantes es un importante rasgo biofísico en la evolución de proteínas.Ítem Embargo Estudios de los Caminos Evolutivos de la Carbapenemasa NDM(2022) Zuccato, Francesco Gabriel; Vila, Alejandro J.; Delmonti, JulianaLos compuestos β-lactámicos son los antibióticos más utilizados para el tratamiento de infecciones bacterianas en la clínica. En las últimas décadas la aparición de cepas bacterianas multirresistentes ha aumentado, limitando su uso. El principal mecanismo de resistencia es la expresión de β-lactamasas, enzimas que hidrolizan estos antibióticos. La metalo-β-lactamasa de Nueva Delhi (NDM) es una de las más diseminadas por el mundo y de amplio espectro, siendo capaz de hidrolizar antibióticos de último recurso como los carbapenemes. Para lograr esto requiere de dos iones Zn(II) en su sitio activo. En ausencia de estos metales, la proteína no es activa y es proteolizada en el periplasma. La mayoría de las sustituciones en las 41 variantes naturales proveen ventajas adaptativas frente a la limitación de la disponibilidad de Zn(II) durante una infección. Entre las sustituciones más frecuentes, M154L aumenta la afinidad de la proteína por el Zn(II), y A233V estabiliza a la apo-enzima frente a la acción de proteasas. Resultados preliminares sugieren que la sustitución E152K estabiliza la apo-enzima, de manera similar a A233V, pero es menos frecuente y no se ha encontrado en combinaciones con otras sustituciones. En esta tesina evaluamos posibles caminos evolutivos de NDM a fin de entender los mecanismos de adaptación más relevante en su evolución. A tales fines, se estudiaron los efectos de la sustitución E152K sobre las variantesnaturales con las sustituciones A233V y M154L y se exploraron las características moleculares de las variantes NDM-EA, NDM-EM y NDM-EMA en condiciones de limitación de Zn(II) como sucede durante la respuesta innata del hospedador. Todas presentaron ventajas evolutivas al compararlas con NDM-1, mostrando mejor capacidad de proteger a las bacterias en condiciones de limitación de Zn(II). Esta optimización se da por un aumento de la estabilidad in vivo de la forma apo. Sin embargo, la sustitución E152K mostró tener un efecto negativo sobre la afinidad por el Zn(II) en combinación con las sustituciones M154L y A233V. Esto confirma que las sustituciones presentes en las variantes naturales de NDM tienden a estabilizar la proteína frente a la limitación de Zn(II), aumentando la afinidad por el metal o disminuyendo la susceptibilidad frente a proteasas. La menor frecuencia de aparición de la sustitución E152K con respecto a A233V podría deberse a que la primera disminuye la afinidad por el metal.Ítem Acceso Abierto Gating interactions steer loop conformational changes in the active site of the L1 metallo-β-lactamase(eLife Sciences Publications, 2023-02-24) Zhao, Zhuoran; Shen, Xiayu; Chen, Shuang; Gu, Jing; Wang, Haun; Mojica, María F.; Samanta, Moumita; Bhowmik, Debsindhu; Vila, Alejandro J.; Bonomo, Robert A.; Haider, Shozeb; http://orcid.org/0000-0002-1380-9824; http://orcid.org/0000-0001-7770-9091; http://orcid.org/0000-0002-7978-3233; http://orcid.org/0000-0003-2650-2925β-Lactam antibiotics are the most important and widely used antibacterial agents across the world. However, the widespread dissemination of β-lactamases among pathogenic bacteria limits the efficacy of β-lactam antibiotics. This has created a major public health crisis. The use of β-lactamase inhibitors has proven useful in restoring the activity of β-lactam antibiotics, yet, effective clinically approved inhibitors against class B metallo-β-lactamases are not available. L1, a class B3 enzyme expressed by Stenotrophomonas maltophilia, is a significant contributor to the β-lactam resistance displayed by this opportunistic pathogen. Structurally, L1 is a tetramer with two elongated loops, α3-β7 and β12-α5, present around the active site of each monomer. Residues in these two loops influence substrate/inhibitor binding. To study how the conformational changes of the elongated loops affect the active site in each monomer, enhanced sampling molecular dynamics simulations were performed, Markov State Models were built, and convolutional variational autoencoder-based deep learning was applied. The key identified residues (D150a, H151, P225, Y227, and R236) were mutated and the activity of the generated L1 variants was evaluated in cellbased experiments. The results demonstrate that there are extremely significant gating interactions between α3-β7 and β12-α5 loops. Taken together, the gating interactions with the conformational changes of the key residues play an important role in the structural remodeling of the active site. These observations offer insights into the potential for novel drug development exploiting these gating interactions.Ítem Acceso Abierto Host-specific enzyme-substrate interactions in SPM-1 metallo-β-lactamase are modulated by second sphere residues(Public Library of Science (PLOS), 2014-01-02) González, Lisandro Javier; Moreno, Diego M.; Bonomo, Robert A.; Vila, Alejandro J.Pseudomonas aeruginosa is one of the most virulent and resistant non-fermenting Gram-negative pathogens in the clinic. Unfortunately, P. aeruginosa has acquired genes encoding metallo-β-lactamases (MβLs), enzymes able to hydrolyze most β-lactam antibiotics. SPM-1 is an MβL produced only by P. aeruginosa, while other MβLs are found in different bacteria. Despite similar active sites, the resistance profile of MβLs towards β-lactams changes from one enzyme to the other. SPM-1 is unique among pathogen-associated MβLs in that it contains “atypical” second sphere residues (S84, G121). Codon randomization on these positions and further selection of resistance-conferring mutants was performed. MICs, periplasmic enzymatic activity, Zn(II) requirements, and protein stability was assessed. Our results indicated that identity of second sphere residues modulates the substrate preferences and the resistance profile of SPM-1 expressed in P. aeruginosa. The second sphere residues found in wild type SPM-1 give rise to a substrate selectivity that is observed only in the periplasmic environment. These residues also allow SPM-1 to confer resistance in P. aeruginosa under Zn(II)-limiting conditions, such as those expected under infection. By optimizing the catalytic efficiency towards β-lactam antibiotics, the enzyme stability and the Zn(II) binding features, molecular evolution meets the specific needs of a pathogenic bacterial host by means of substitutions outside the active site.