Estudio de la evolución natural de la carbapenemasa NDM

La resistencia a antibióticos es una de las principales causas de mortalidad y morbilidad en el mundo. Los carbapenemes son antibióticos de último recurso en la clínica, amenazados por la actividad de las carbapenemasas. Dentro de éstas, NDM es una de las metalo-βlactamasas más diseminadas. La falta de inhibidores clínicos la convierte en un problema sanitario grave. NDM depende de la unión de Zn(II) a su sitio activo para su actividad y estabilidad in vivo. Durante una infección, la respuesta inmune innata del hospedador limita la disponibilidad de Zn(II), reduciendo los niveles periplasmáticos del metal. Como consecuencia, NDM se inactiva, acumulándose como apo-NDM, es decir sin Zn(II) en el sitio activo. Además, apo-NDM es susceptible a degradación por las proteasas periplasmáticas Prc y DegP, perdiendo la capacidad de conferir resistencia. Sin embargo, las variantes clínicas de NDM acumulan sustituciones que optimizan el fenotipo de resistencia en condiciones de escasez de Zn(II), tales como M154L y E152K. La sustitución M154L está presente en el 43% de las variantes, y se ha sugerido que aumenta la afinidad de la enzima por el Zn(II), pero la evidencia experimental en la literatura es confusa. En cambio, la sustitución E152K parece aumentar la estabilidad in vivo de NDM. Hasta el momento se desconocen de qué manera las características bioquímicas y biofísicas inducidas por estas sustituciones impactan en el fenotipo de resistencia. En esta Tesis nos propusimos estudiar los cambios producidos por estas sustituciones claves a nivel bioquímico y estructural. Por medio de estudios bioquímicos en las variantes NDM-1, NDM-4 (M154L), NDM-15 (M154L A233V) y NDM-6 (A233V) determinamos que la sustitución M154L no afecta la actividad catalítica de la enzima, ni la estabilidad térmica de las formas apo y holo (unida a 2 iones Zn(II)), sino que aumenta la afinidad por el Zn(II) en 2 órdenes de magnitud, lo cual favorecería su capacidad de resistir a condiciones de escasez de este metal. Los estudios estructurales revelan que apo-NDM-4 presenta mayor dinámica que apo-NDM-1, lo que resulta en un sitio más ocluido, que podría limitar la disociación del Zn(II), aumentando la afinidad de la enzima por el mismo. La sustitución E152K (presente en NDM-9) estabiliza a la apo-enzima en el periplasma frente a la limitación de Zn(II). Apo-NDM-9 evade la acción de la proteasa Prc, que es activa frente a apo-NDM-1. Demostramos que el residuo K152 forma un puente salino con D223 (ubicado el bucle L10) en apo-NDM-9, que conecta ambas mitades de la enzima y reduce la dinámica del extremo C-terminal. Este impacto en la dinámica proteica impide el reconocimiento de apo-NDM-9 por Prc, lo que resulta en una mayor estabilidad in vivo. La cercanía en la secuencia de las dos sustituciones estudiadas en este trabajo sugiere que la región que contiene la hélice α3 y el bucle L8 (donde se ubican E152K y M154L, respectivamente) puede modular características de la enzima muy diversas como la afinidad por el Zn(II) y la estabilidad de la enzima. En ambos casos, resulta una región clave para la evolución de la carbapenemasa NDM frente a procesos de limitación de metal.