Examinando por Autor "Llarrull, Leticia Irene"
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Ítem Acceso Abierto A general reaction mechanism for carbapenem hydrolysis by mononuclear and binuclear metallo-β-lactamases(Nature, 2017-09-14) Lisa, María Natalia; Palacios, Antonela R.; Aitha, Mahesh; González, Mariano M.; Moreno, Diego M.; Crowder, Michael W.; Bonomo, Robert A.; Spencer, James; Tierney, David L.; Llarrull, Leticia Irene; Vila, Alejandro J.Ítem Acceso Abierto An experiment-informed signal transduction model for the role of the Staphylococcus aureus MecR1 protein in β-lactam resistance(Springer Nature, 2019-12-20) Belluzo, Bruno Salvador; Abriata, Luciano Andrés; Giannini, Estefanía; Mihovilcevic, Damila; Dal Peraro, Matteo; Llarrull, Leticia IreneThe treatment of hospital- and community-associated infections by methicillin-resistant Staphylococcus aureus (MRSA) is a perpetual challenge. This Gram-positive bacterium is resistant specifically to β-lactam antibiotics, and generally to many other antibacterial agents. Its resistance mechanisms to β-lactam antibiotics are activated only when the bacterium encounters a β-lactam. This activation is regulated by the transmembrane sensor/signal transducer proteins BlaR1 and MecR1. Neither the transmembrane/metalloprotease domain, nor the complete MecR1 and BlaR1 proteins, are isolatable for mechanistic study. Here we propose a model for full-length MecR1 based on homology modeling, residue coevolution data, a new extensive experimental mapping of transmembrane topology, partial structures, molecular simulations, and available NMR data. Our model defines the metalloprotease domain as a hydrophilic transmembrane chamber effectively sealed by the apo-sensor domain. It proposes that the amphipathic helices inserted into the gluzincin domain constitute the route for transmission of the β-lactam-binding event in the extracellular sensor domain, to the intracellular and membrane-embedded zinc-containing active site. From here, we discuss possible routes for subsequent activation of proteolytic action. This study provides the first coherent model of the structure of MecR1, opening routes for future functional investigations on how β-lactam binding culminates in the proteolytic degradation of MecI.Ítem Embargo Caracterización del sistema mec de Staphylococcus aureus: disociación entre la activación y la manifestación de resistencia a β-lactámicos y estrategias para dilucidar el mecanismo de transducción de señal(2023) Fabbri, Carolina; Llarrull, Leticia IreneStaphylococcus aureus resistente a meticilina (MRSA) es una de las amenazas clínicas multirresistentes más importantes a nivel mundial. Su capacidad de tolerar fármacos radica en la producción de una serin-β-lactamasa y la adquisición de una transpeptidasa accesoria, PBP2a, con baja afinidad por los antibióticos β-lactámicos. Estos antibióticos inducen la expresión de ambos sistemas (bla y mec, respectivamente). A fin de esclarecer el funcionamiento del sistema mec, estudiamos los eventos moleculares que dan lugar a su activación utilizando cepas de S. aureus reporteras. Confirmamos la transcripción inducible de los genes reguladores del sistema mec, así como también del gen de resistencia. Ensayos con una penicilina fluorescente y de espectrometría de masa mostraron la acumulación de PBP2a en membranas, con capacidad de unir β-lactámicos. Pese a la presencia de PBP2a, la cepa reportera no presentó resistencia. La sensibilidad a los antibióticos β-lactámicos indicó que PBP2a carece de actividad transpeptidasa en dicha cepa. Estos resultados sugieren que la manifestación de resistencia en MRSA no se debe únicamente a la expresión de PBP2a inducida por β-lactámicos, sino a una suma de factores que contribuyen a la capacidad de tolerar estos antibióticos. Además, los estudios realizados mostraron diferencias a nivel de regulación de la transcripción a partir de los promotores divergentes de los genes mecA y mecR1-mecI-mecR2, y con el sistema bla. La proteína sensora/transductora MecR1, detecta al antibiótico presente en el medio e inicia una cascada de señalización que culmina con la manifestación de resistencia. El modelo de MecR1 propone interacciones entre el dominio sensor extracelular y el dominio metaloproteasa integral de membrana que permitirían transmitir la señal al interior celular. Empleamos técnicas de entrecruzamiento molecular para identificar los determinantes estructurales que dan lugar a la transducción de señal. Expresamos variantes modificadas de MecR1 con un aminoácido no-natural fotoactivable en las regiones de interés. Conjuntamente, realizamos entrecruzamiento inespecífico. Establecimos las condiciones de purificación de las proteínas resultantes para su estudio por espectrometría de masa. Si bien no fue posible identificar péptidos entrecruzados, este trabajo sienta las bases para continuar con la caracterización estructural de MecR1 utilizando técnicas de crosslinking. Logramos la sobreexpresión y purificación de MecR1 como fusión a Mistic en micelas de detergente. Abordamos técnicas de cristalogénesis, obteniendo datos preliminares sobre las condiciones de cristalización. Haber sobreexpresado MecR1 en su longitud completa, es uno de los hitos más relevantes de este trabajo. Recientemente se ha publicado la estructura de BlaR1, homólogo de MecR1, que revela un dímero. Con esta información, generamos un modelo de baja resolución para MecR1 en forma dimérica. Nuestro modelo inicial de trabajo correspondía a un monómero. Si bien los ensayos de crosslinking no arrojaron evidencias de que MecR1 forme un dímero, el nuevo modelo permite diseñar otras mutantes puntuales para evaluar, empleando las técnicas aquí puestas a punto, si MecR1 comparte homología estructural y funcional con BlaR1. Esta tesis aporta nuevas perspectivas para continuar con trabajos que permitan dilucidar el mecanismo de transducción de la señal y los requisitos mínimos para la manifestación de resistencia en cepas de MRSA.Ítem Embargo Estudio del mecanismo de activación del sistema VraSRT de Staphylococcus aureus y búsqueda de inhibidores producidos por actinomicetos(2023) Antinori, Melisa Belén; Llarrull, Leticia IreneStaphylococcus aureus es una de las amenazas clínicas multirresistentes más importantes a nivel mundial. El sistema VraSRT detecta daños en el peptidoglicano de la pared celular y coordina una respuesta que conduce a la resistencia a los antibióticos. Presenta un mecanismo de activación aún no esclarecido y está formado por 3 proteínas: una histidin quinasa de membrana (VraS), un regulador de respuesta citoplasmático (VraR) y otra proteína de membrana esencial, cuya función se desconoce (VraT). En este trabajo de tesis se realizaron experimentos in vitro e in vivo para investigar la activación del sistema VraSRT y los acontecimientos moleculares implicados en la transducción de señal que conducen a la resistencia. Se construyó y validó una cepa reportera que permite la expresión de GFP bajo el control del sistema VraSRT. Se confirmó que el sistema VraSRT sólo responde a la presencia de antibióticos que dañan la pared celular y se descubrió que el sistema VraSRT no se activa en respuesta a fragmentos del peptidoglicano generados por la acción de las enzimas lisostafina y mutanolisina, involucradas en el remodelado de la pared celular. También se evaluó la interacción entre VraS, VraT y diferentes fotosondas de afinidad derivadas del antibiótico β-lactámico ampicilina (FS-Amp) y del antibiótico glicopéptido vancomicina (VPP). Se verificó que las modificaciones químicas introducidas en los antibióticos para generar las fotosondas de afinidad no afectaron su capacidad de inducir al sistema VraSRT. Se logró sobre-expresar y localizar correctamente en membrana las proteínas VraS y VraT en células E. coli BL21 StarTM (DE3). Se observó un retraso en la movilidad electroforética tras la incubación e irradiación de VraS con las fotosondas de ampicilina, lo que sugiere la presencia de un aducto VraS-FS-Amp. Fue posible purificar dicho aducto pero no se pudo corroborar la formación del mismo. Se confirmó la existencia de un aducto VraS-VPP, lo que demostró una interacción directa entre VraS y la vancomicina. Si bien no fue posible confirmar el lugar exacto de la interacción, ensayos preliminares sugieren que la interacción se daría a través del péptido T 41QIF. La proteína VraS purificada no conservó la actividad auto-quinasa. Sin embargo, la proteína en membranas de E. coli y reconstituida en liposomas luego de ser purificada mostró actividad auto-quinasa constitutiva. Con respecto a VraT, los ensayos con las fotosondas derivadas de antibióticos permitieron descartar una interacción directa con esta proteína. Además, se examinó una mezcla de compuestos secretados por 40 cepas diferentes de actinomicetos utilizando la cepa reportera y se identificaron varias que impedían la activación del sistema de resistencia. También se observó que algunos de estos extractos restablecían la eficacia de los antibióticos frente a cepas clínicas resistentes. En conclusión, el sistema VraSRT es una importante vía de señalización que desempeña un papel clave en la resistencia de S. aureus a los antibióticos. Esta tesis permitió dilucidar nuevos aspectos del mecanismo de activación del sistema VraSRT; específicamente, se demostró la existencia de una interacción directa de la proteína VraS con el antibiótico glicopéptido vancomicina sin que esta interacción modifique notoriamente la actividad auto-quinasa basal de VraS. Además, se identificaron extractos de actinomicetos con compuestos con potencial terapéutico, abriéndose así una nueva línea de investigación para la determinación de la estructura de estos compuestos y del mecanismo de acción.