Caracterización del sistema mec de Staphylococcus aureus: disociación entre la activación y la manifestación de resistencia a β-lactámicos y estrategias para dilucidar el mecanismo de transducción de señal

Staphylococcus aureus resistente a meticilina (MRSA) es una de las amenazas clínicas multirresistentes más importantes a nivel mundial. Su capacidad de tolerar fármacos radica en la producción de una serin-β-lactamasa y la adquisición de una transpeptidasa accesoria, PBP2a, con baja afinidad por los antibióticos β-lactámicos. Estos antibióticos inducen la expresión de ambos sistemas (bla y mec, respectivamente). A fin de esclarecer el funcionamiento del sistema mec, estudiamos los eventos moleculares que dan lugar a su activación utilizando cepas de S. aureus reporteras. Confirmamos la transcripción inducible de los genes reguladores del sistema mec, así como también del gen de resistencia. Ensayos con una penicilina fluorescente y de espectrometría de masa mostraron la acumulación de PBP2a en membranas, con capacidad de unir β-lactámicos. Pese a la presencia de PBP2a, la cepa reportera no presentó resistencia. La sensibilidad a los antibióticos β-lactámicos indicó que PBP2a carece de actividad transpeptidasa en dicha cepa. Estos resultados sugieren que la manifestación de resistencia en MRSA no se debe únicamente a la expresión de PBP2a inducida por β-lactámicos, sino a una suma de factores que contribuyen a la capacidad de tolerar estos antibióticos. Además, los estudios realizados mostraron diferencias a nivel de regulación de la transcripción a partir de los promotores divergentes de los genes mecA y mecR1-mecI-mecR2, y con el sistema bla. La proteína sensora/transductora MecR1, detecta al antibiótico presente en el medio e inicia una cascada de señalización que culmina con la manifestación de resistencia. El modelo de MecR1 propone interacciones entre el dominio sensor extracelular y el dominio metaloproteasa integral de membrana que permitirían transmitir la señal al interior celular. Empleamos técnicas de entrecruzamiento molecular para identificar los determinantes estructurales que dan lugar a la transducción de señal. Expresamos variantes modificadas de MecR1 con un aminoácido no-natural fotoactivable en las regiones de interés. Conjuntamente, realizamos entrecruzamiento inespecífico. Establecimos las condiciones de purificación de las proteínas resultantes para su estudio por espectrometría de masa. Si bien no fue posible identificar péptidos entrecruzados, este trabajo sienta las bases para continuar con la caracterización estructural de MecR1 utilizando técnicas de crosslinking. Logramos la sobreexpresión y purificación de MecR1 como fusión a Mistic en micelas de detergente. Abordamos técnicas de cristalogénesis, obteniendo datos preliminares sobre las condiciones de cristalización. Haber sobreexpresado MecR1 en su longitud completa, es uno de los hitos más relevantes de este trabajo. Recientemente se ha publicado la estructura de BlaR1, homólogo de MecR1, que revela un dímero. Con esta información, generamos un modelo de baja resolución para MecR1 en forma dimérica. Nuestro modelo inicial de trabajo correspondía a un monómero. Si bien los ensayos de crosslinking no arrojaron evidencias de que MecR1 forme un dímero, el nuevo modelo permite diseñar otras mutantes puntuales para evaluar, empleando las técnicas aquí puestas a punto, si MecR1 comparte homología estructural y funcional con BlaR1. Esta tesis aporta nuevas perspectivas para continuar con trabajos que permitan dilucidar el mecanismo de transducción de la señal y los requisitos mínimos para la manifestación de resistencia en cepas de MRSA.