Estudio del mecanismo de activación del sistema VraSRT de Staphylococcus aureus y búsqueda de inhibidores producidos por actinomicetos

Staphylococcus aureus es una de las amenazas clínicas multirresistentes más importantes a nivel mundial. El sistema VraSRT detecta daños en el peptidoglicano de la pared celular y coordina una respuesta que conduce a la resistencia a los antibióticos. Presenta un mecanismo de activación aún no esclarecido y está formado por 3 proteínas: una histidin quinasa de membrana (VraS), un regulador de respuesta citoplasmático (VraR) y otra proteína de membrana esencial, cuya función se desconoce (VraT). En este trabajo de tesis se realizaron experimentos in vitro e in vivo para investigar la activación del sistema VraSRT y los acontecimientos moleculares implicados en la transducción de señal que conducen a la resistencia. Se construyó y validó una cepa reportera que permite la expresión de GFP bajo el control del sistema VraSRT. Se confirmó que el sistema VraSRT sólo responde a la presencia de antibióticos que dañan la pared celular y se descubrió que el sistema VraSRT no se activa en respuesta a fragmentos del peptidoglicano generados por la acción de las enzimas lisostafina y mutanolisina, involucradas en el remodelado de la pared celular. También se evaluó la interacción entre VraS, VraT y diferentes fotosondas de afinidad derivadas del antibiótico β-lactámico ampicilina (FS-Amp) y del antibiótico glicopéptido vancomicina (VPP). Se verificó que las modificaciones químicas introducidas en los antibióticos para generar las fotosondas de afinidad no afectaron su capacidad de inducir al sistema VraSRT. Se logró sobre-expresar y localizar correctamente en membrana las proteínas VraS y VraT en células E. coli BL21 StarTM (DE3). Se observó un retraso en la movilidad electroforética tras la incubación e irradiación de VraS con las fotosondas de ampicilina, lo que sugiere la presencia de un aducto VraS-FS-Amp. Fue posible purificar dicho aducto pero no se pudo corroborar la formación del mismo. Se confirmó la existencia de un aducto VraS-VPP, lo que demostró una interacción directa entre VraS y la vancomicina. Si bien no fue posible confirmar el lugar exacto de la interacción, ensayos preliminares sugieren que la interacción se daría a través del péptido T 41QIF. La proteína VraS purificada no conservó la actividad auto-quinasa. Sin embargo, la proteína en membranas de E. coli y reconstituida en liposomas luego de ser purificada mostró actividad auto-quinasa constitutiva. Con respecto a VraT, los ensayos con las fotosondas derivadas de antibióticos permitieron descartar una interacción directa con esta proteína. Además, se examinó una mezcla de compuestos secretados por 40 cepas diferentes de actinomicetos utilizando la cepa reportera y se identificaron varias que impedían la activación del sistema de resistencia. También se observó que algunos de estos extractos restablecían la eficacia de los antibióticos frente a cepas clínicas resistentes. En conclusión, el sistema VraSRT es una importante vía de señalización que desempeña un papel clave en la resistencia de S. aureus a los antibióticos. Esta tesis permitió dilucidar nuevos aspectos del mecanismo de activación del sistema VraSRT; específicamente, se demostró la existencia de una interacción directa de la proteína VraS con el antibiótico glicopéptido vancomicina sin que esta interacción modifique notoriamente la actividad auto-quinasa basal de VraS. Además, se identificaron extractos de actinomicetos con compuestos con potencial terapéutico, abriéndose así una nueva línea de investigación para la determinación de la estructura de estos compuestos y del mecanismo de acción.