Examinando por Autor "Ceccarelli, Eduardo Augusto"
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Ítem Embargo Análisis funcional comparativo de las ferredoxinas-NADP+ reductasas de patógenos bacterianos(2022) Monchietti, Paula; Catalano Dupuy, Daniela L.; Ceccarelli, Eduardo AugustoLos procesos redox son esenciales para el mantenimiento de la vida. Estas reacciones, llevadas a cabo fundamentalmente por oxidoreductasas, poseen relevancia en todos los organismos. Dentro del grupo de las oxidoreductasas, las flavoenzimas cumplen un rol preponderante por su capacidad de transferir electrones entre sustratos mono y bielectrónicos. Las Ferredoxinas-NADP+ reductasas (FNR) constituyen una familia de proteínas hidrofílicas monoméricas que contienen FAD no covalentemente unido como grupo prostético. Estas enzimas se encuentran ampliamente distribuidas entre los organismos vivos y están involucradas en la transferencia electrónica en diversos procesos biológicos importantes. Las FNR se clasifican en dos tipos: planta y mitocondrial. A su vez, las FNR tipo planta son agrupadas en las clases plastídica y bacteriana. En organismos fotosintéticos, la FNR es la limitante de la producción de NADPH y, por consiguiente, del proceso de fotosíntesis global. En cambio, las FNR presentes en tejidos y organismos heterotróficos operan en la dirección contraria, conduciendo los equivalentes de reducción desde el “pool” de NADPH celular hacia los transportadores electrónicos de bajo potencial (Fd, Fld, adrenodoxina) para diversos metabolismos de óxido-reducción. Las FNR bacterianas participan en vías metabólicas especialmente apropiadas para el desarrollo de agentes antimicrobianos ya que no se encuentran presentes en humanos. Por esto, pueden ser un blanco importante para el diseño de inhibidores en la lucha contra enfermedades causadas por diferentes patógenos. El modelo más aceptado para el mecanismo catalítico de las FNR es el que ha sido propuesto para las enzimas plastídicas, las cuales poseen un residuo tirosina en su carboxilo terminal, absolutamente conservado, que se encuentra interaccionando con la isoaloxacina del FAD. Esta tirosina sería desplazada para permitir la entrada del sustrato NADP+ durante la catálisis. Por otra parte, las FNR plastídicas presentan números de recambio entre 20 y 100 veces mayores a los de las FNR bacterianas, lo que sugiere que éstas últimas presentan limitaciones catalíticas, las cuales fueron superadas por la contraparte funcional presente en organismos y tejidos fotosintéticos. Sin embargo, las bases bioquímicas de estas ventajas catalíticas aún no han sido elucidadas. Además, las FNR bacterianas presentan una región carboxilo terminal estructurada y variable, que no ha permitido proponer modelos lógicos que justifiquen cómo el sustrato logra alcanzar el sitio activo. Evidencias preliminares nos indican que en las enzimas bacterianas el mecanismo catalítico sería diferente. En el laboratorio previamente se habían obtenido cristales de una FNR mutante de E. coli (EcFPR) observándose que contenía el sustrato NADP+ firmemente unido, a pesar de que el mismo no había sido adicionado en el proceso de cristalización. La estructura tridimensional mostró que el NADP+ interacciona con tres argininas. Estos residuos podrían ser los responsables de generar un sitio altamente estructurado con alta afinidad por el nucleótido. Estos tres aminoácidos estarían conservados en las enzimas bacterianas, pero no en las enzimas plastídicas de alta eficiencia catalítica, presentes en cloroplastos de plantas y en cianobacterias. En este trabajo de Tesis, realizamos un estudio funcional comparativo entre FNR plastídicas y bacterianas. Demostramos que las FNR bacterianas purificadas contienen el sustrato NADP+ fuertemente unido. El nucleótido permanece unido a la enzima luego de una extensa diálisis y filtración en gel. Por el contrario, las FNR plastídicas analizadas no lo contienen. El NADP+ podría ejercer una regulación enzimática ya que observamos una correlación entre las cantidades de nucleótido unido a las FNR y las velocidades catalíticas. La presencia de NADP+ redujo considerablemente la actividad de EcFPR, que se recuperó cuando se eliminó el nucleótido de la enzima. Vimos también que la unión del NADP+ produjo una estabilización de la estructura en las FNR bacterianas, pero no se observó ningún efecto sobre las contrapartes plastídicas. Para investigar más a fondo la participación de las argininas mencionadas anteriormente en la unión del NADP+ , construimos diferentes enzimas mutantes de EcFPR y de la FNR plastídica de Pisum sativum (PeaFNR). La caracterización cinética, estructural y de estabilidad de estas proteínas nos permitió confirmar que los residuos R144 y R184 en EcFPR están involucrados en la generación de un sitio estructurado con muy alta afinidad por el NADP+ Nuestros resultados sugieren que las FNR bacterianas muestran un modo de unión de NADP+ diferencial y, por consiguiente, un mecanismo catalítico diferente al propuesto para las FNR tipo plastídicas. Estos hallazgos son discutidos en detalle durante el desarrollo de esta Tesis y nos permitieron plantear por primera vez un modelo de unión y catálisis del NADP+ para las FNR bacterianas. Proponemos que esta fuerte unión constituye un mecanismo catalítico y regulador esencial de estas enzimas, involucradas en la homeostasis redox de la célula.Ítem Acceso Abierto Characterization of the accessory protein ClpT1 from Arabidopsis thaliana: oligomerization status and interaction with Hsp100 chaperones(BMC, 2014-08-24) Colombo, Clara V.; Ceccarelli, Eduardo Augusto; Rosano, Germán L.Background: The caseinolytic protease (Clp) is crucial for chloroplast biogenesis and proteostasis. The Arabidopsis Clp consists of two heptameric rings (P and R rings) assembled from nine distinct subunits. Hsp100 chaperones (ClpC1/2 and ClpD) are believed to dock to the axial pores of Clp and then transfer unfolded polypeptides destined to degradation. The adaptor proteins ClpT1 and 2 attach to the protease, apparently blocking the chaperone binding sites. This competition was suggested to regulate Clp activity. Also, monomerization of ClpT1 from dimers in the stroma triggers P and R rings association. So, oligomerization status of ClpT1 seems to control the assembly of the Clp protease. Results: In this work, ClpT1 was obtained in a recombinant form and purified. In solution, it mostly consists of monomers while dimers represent a small fraction of the population. Enrichment of the dimer fraction could only be achieved by stabilization with a crosslinker reagent. We demonstrate that ClpT1 specifically interacts with the Hsp100 chaperones ClpC2 and ClpD. In addition, ClpT1 stimulates the ATPase activity of ClpD by more than 50% when both are present in a 1:1 molar ratio. Outside this optimal proportion, the stimulatory effect of ClpT1 on the ATPase activity of ClpD declines. Conclusions: The accessory protein ClpT1 behaves as a monomer in solution. It interacts with the chloroplastic Hsp100 chaperones ClpC2 and ClpD and tightly modulates the ATPase activity of the latter. Our results provide new experimental evidence that may contribute to revise and expand the existing models that were proposed to explain the roles of this poorly understood regulatory protein.Ítem Acceso Abierto Crystal structure of the FAD-containing ferredoxin-NADP+ reductase from the plant pathogen Xanthomonas axonopodis pv. citri(Hindawi, 2013-08-01) Tondo, María Laura; Hurtado-Guerrero, Ramón; Ceccarelli, Eduardo Augusto; Medina, Milagros; Orellano, Elena G.; Martínez-Júlvez, Marta; https://orcid.org/0000-0002-3122-9401We have solved the structure of ferredoxin-NADP(H) reductase, FPR, from the plant pathogen Xanthomonas axonopodis pv. citri, responsible for citrus canker, at a resolution of 1.5 Å. This structure reveals differences in the mobility of specific loops when compared to other FPRs, probably unrelated to the hydride transfer process, which contributes to explaining the structural and functional divergence between the subclass I FPRs. Interactions of the C-terminus of the enzyme with the phosphoadenosine of the cofactor FAD limit its mobility, thus affecting the entrance of nicotinamide into the active site. This structure opens the possibility of rationally designing drugs against the X. axonopodis pv. citri phytopathogen.Ítem Acceso Abierto New tools for recombinant proteinproduction in Escherichia coli:A 5-year update(Wiley, 2019-06-01) Rosano, Germán L.; Morales, Enrique Salvador; Ceccarelli, Eduardo Augusto; https://orcid.org/0000-0002-8313-6813; https://orcid.org/0000-0001-5776-3306The production of proteins in sufficient amounts is key for their study or use asbiotherapeutic agents. Escherichia coli is the host of choice for recombinant protein production givenits fast growth, easy manipulation, and cost-effectiveness. As such, its protein production capabilitiesare continuously being improved. Also, the associated tools (such as plasmids and cultivationconditions) are subject of ongoing research to optimize product yield. In this work, we review thelatest advances in recombinant protein production in E. coli.Ítem Embargo Participación de chaperones Hsp100 en el proceso de estrés térmico en plantas. Reconocimiento de sustratos artificiales y naturales de ClpB(2020) Parcerisa, Ivana Lorna; Ceccarelli, Eduardo AugustoLa agregación de proteínas es un proceso que tiene lugar en las células de todos los organismos, desde bacterias hasta humanos, y que se asocia con una variedad de factores. Uno de ellos es el cambio en las condiciones ambientales y, dentro de éste, la carga térmica es particularmente relevante debido al estrés que desencadena, sobre todo en organismos sésiles. Afortunadamente, las células han desarrollado una maquinaria molecular compuesta por múltiples proteínas genéricamente llamadas chaperones, que les permite resolver (en gran medida al menos) el problema de la agregación proteica. Estas proteínas actúan en primer lugar, previniendo la formación de los agregados, o en su defecto, operando sobre éstos una vez que se han formado. Cuando esto último sucede, la célula puede eliminar estos agregados por dos vías: (i) mediante la solubilización de los mismos y posterior plegamiento de los polipéptidos liberados o (ii) por medio de su proteólisis. La primera de estas funciones es llevada a cabo por los chaperones ClpB pertenecientes a la familia de proteínas de choque térmico Hsp100, en colaboración con el sistema de chaperones Hsp70. Los chaperones moleculares ClpB son miembros de la superfamilia de ATPasas AAA+ (ATPases associated with a variety of cellular activities), y al igual que otros chaperones Hsp100, se ensamblan en hexámeros en presencia de ATP, generando una estructura en forma de anillo con un poro central axial. Cada protómero del anillo de ClpB se compone de un dominio N-terminal (NTD); dos dominios de unión a ATP, NBD1 y NBD2; y un dominio medio (MD), característico de esta subfamilia y esencial para la actividad del chaperón. La familia de proteínas Hsp100/ClpB cumple un rol fundamental en la termotolerancia celular, solubilizando y reactivando los agregados de proteína que se generan durante el estrés térmico. Esta función se describió por primera vez en Saccharomyces cerevisiae donde se demostró que las células que expresaban el chaperón ScHsp104 eran capaces de sobrevivir entre 1000 y 10.000 veces más cuando se las sometía a altas temperaturas. Resultados similares se obtuvieron para ClpB de Escherichia coli (EcClpB) y de Arabidopsis thaliana (AtHsp101), entre otros organismos. En particular, los homólogos funcionales de ScHsp104 en plantas corresponden a la forma citosólica de ClpB. Además, existen versiones de esta proteína en cloroplastos y mitocondrias, de las cuales se conoce muy poco en comparación con la forma citoplasmática. Los estudios que se han hecho en cloroplastos de tomate han mostrado por primera vez evidencia de que ClpB podría estar implicada en los procesos de termotolerancia celular. En A. thaliana esto aún no se ha evidenciado, pero se sabe que es imposible obtener plantas knockout en ClpB, por lo que se piensa que podría tener un rol esencial en el desarrollo del proteoma plastídico, además de salvaguardar a la célula en situaciones de estrés. Las evidencias apuntan a que ClpB de cloroplastos sería mayormente un gen housekeeping y por ende diferiría de la forma citosólica, la cual funciona esencialmente luego de una crisis térmica. El reconocimiento y unión de sustratos por chaperones Hsp100/Clp se ha estudiado para muchas proteínas Clp, incluyendo ClpA y ClpX, dos chaperones bacterianos asociados a proteasas. Se han identificado algunos sustratos e incluso secuencias específicas de reconocimiento. Sin embargo, para las diferentes ClpB estudiadas se han registrado muy pocos sustratos, incluso para las provenientes de E. coli y de S. cerevisiae. El presente trabajo de tesis intenta comprender cómo opera ClpB de cloroplastos de A. thaliana (AtClpB3) y qué características presenta en el reconocimiento y unión de sustratos. Para esto nos hemos propuesto como primera medida obtener la enzima pura en solución. Seguidamente, procuramos una caracterización estructural y funcional de AtClpB3, para finalmente analizar la interacción del chaperón con diversos sustratos artificiales y naturales del mismo. El chaperón AtClpB3 se obtuvo en el laboratorio de manera recombinante en E. coli, mediante clonado y posterior expresión y purificación a homogeneidad. Una vez obtenida la enzima pura, se determinó en primer lugar la actividad ATPasa por el método Verde de Malaquita. El chaperón AtClpB3 fue capaz de hidrolizar ATP-Mg2+, pero no ADP-Mg2+ ni ADP o ATP solos (sin Mg2+). A su vez, por cromatografía de exclusión molecular, se pudo determinar que AtClpB3 es capaz de ensamblarse en hexámeros de manera estable en presencia de ATP-Mg2+, pero no así en presencia de los otros nucleótidos. Sin el agregado de ellos, la proteína se encuentra principalmente en forma dimérica, y cuando se agrega ATP o ADP al medio (sin Mg2+), la misma alcanza en ambos casos conformaciones intermedias no funcionales. Una vez determinada la actividad basal de AtClpB3 en presencia de ATP-Mg2+, se procedió a caracterizar esta actividad frente a diferentes condiciones y componentes del medio. En primer lugar, se determinaron los parámetros cinéticos Km y Vmáx, los cuales siguieron una cinética tipo michaeliana para el ATP-Mg2+. Por otro lado, la enzima presentó una relación inversa con la fuerza iónica, mostrando menores actividades a mayores concentraciones de sal, característica compartida por otros chaperones Hsp100. Además, se determinó que AtClpB3 es incapaz de hidrolizar ATP-Mg2+ frente a valores de pH iguales o inferiores a 4,5 como ocurre para EcClpB; siendo ésta una inactivación reversible. Respecto de la temperatura, AtClpB3 presentó una actividad máxima a 62 oC, mostrando actividad incluso hasta los 75-80 oC, lo que sería un indicio de que la proteína podría estar implicada en los procesos de termotolerancia celular. Por otro lado, en ensayos de complementación de cepas de E. coli mutantes en ClpB, el chaperón plastídico no fue capaz de rescatar el fenotipo sensible a la temperatura de las bacterias defectivas, lo que indicaría que ambos chaperones son funcionalmente distintos. Seguidamente, se estudió la actividad de AtClpB3 in vitro en presencia de diferentes sustratos modelos. Los polipéptidos desestructurados como la caseína y la poli-lisina, tienen la capacidad de estimular la actividad ATPasa de los chaperones ClpB y, por lo tanto, pueden actuar como sus sustratos. La adición de caseínas o de poli-L-lisinas estimuló la actividad ATPasa de AtClpB3, aunque en menor proporción a lo observado para EcClpB y ScHsp104. Asimismo, se enfrentó al chaperón con distintas “sondas conformacionales”, cada una de ellas con un grado de plegamiento y estructura diferentes, a fin de inferir las características de plegamiento de los sustratos preferidos por AtClpB3. Desafortunadamente, ninguno de ellos logró activar de manera diferencial a AtClpB3, no pudiendo así especificar los patrones estructurales reconocidos por el chaperón. Estos experimentos con sustratos fueron repetidos empleando el sistema bi-chaperón AtClpB3-AtHsp70, obteniéndose resultados similares. Otros sustratos comúnmente usados son las enzimas luciferasa y glucosa-6-P-deshidrogenasa (G6PDH), debido a que permiten estudiar de manera sencilla la reactivación de los agregados xvi RESUMEN | por ClpB. Hasta hace algún tiempo se pensaba que los chaperones ClpB sólo eran capaces de cumplir su función en colaboración con el sistema Hsp70. Pero más recientemente se ha visto que los chaperones ClpB son capaces de solubilizar agregados in vitro sin la asistencia del sistema Hsp70. Además, la reactivación de agregados Hsp70-independiente puede potenciarse cuando el medio es suplementado con análogo de ATP no hidrolizable como el ATP--S o AMP- PNP. En nuestro caso, AtClpB3 fue capaz de restaurar eficientemente los agregados de G6PDH en ausencia de los chaperones AtHsp70, pero no así los de luciferasa, sea que las Hsp70 plastídicas estuviesen o no presentes. A su vez, la adición de nucleótidos no hidrolizables permitió una mayor y más rápida reactivación. Estos hallazgos son discutidos en detalle durante el desarrollo de esta tesis. Estos resultados permiten por primera vez conocer las características y el funcionamiento del sistema ClpB de cloroplastos de A. thaliana y amplían el conocimiento actual que hay sobre ClpB de diferentes orígenes.Ítem Acceso Abierto Participación de residuos aromáticos en la estructura y función de flavoproteínas(Universidad Nacional de Rosario. Facultad de Ciencias Bioquímicas y Farmacéuticas., 2000) Arakaki, Adrián Kimei; Ceccarelli, Eduardo AugustoLa ferredoxina-NADP+ reductasa presente en organismos fotosintéticos (FNR plastídica) es una flavoproteína de 35 kDa que cataliza el transporte reversible de electrones entre NADP(H) y ferredoxina o flavodoxina. La FNR plastídica es el prototipo de una superfamilia estructural que incluye proteínas de funciones diversas. Su estructura terciaria consta de un dominio amino terminal para la unión de una molécula del grupo prostético FAD y un dominio carboxilo terminal para la unión del sustrato NADP+. En todas las secuencias conocidas de FNR plastídicas se encuentran dos residuos tirosina estrictamente conservados que resultan homólogos a los residuos en posición 89 y 308 en la FNR de hojas de arveja, éste último ubicado en el extremo carboxilo terminal de la proteína. Las estructuras cristalográficas de la enzima muestran que estas tirosinas se ubican a ambos lados de la flavina del FAD. Hasta el presente no existía información directa acerca de la geometría de unión de la parte nicotinamida del sustrato NADP+ a la enzima. En este trabajo de Tesis se empleó a la FNR de hojas de arveja como modelo para estudiar la importancia evolutiva, funcional y estructural de los residuos aromáticos conservados en el entorno de la flavina de las flavoproteínas pertenecientes a la superfamilia estructural ferredoxina-NADP+ reductasa. Se estudió la evolución de la ferredoxina-NADP+ reductasa mediante técnicas de Filogenia Molecular. Con este fin se construyeron árboles filogenéticos basados en las secuencias de aminoácidos de todas las enzimas plastídicas (FNR) y proteobacterianas (FPR) disponibles en las bases de datos. El análisis evolutivo de las FPRs permitió validar una clasificación de la flavoproteína en tres subtipos: subtipo E. coli, subtipo A. vinelandii y subtipo A. actinomycetemcomitans. Los subtipos propuestos se distinguen por particularidades en la secuencia del extremo carboxilo terminal, que incluye al residuo homólogo a la tirosina 308 de FNR de arveja. La caracterización de mutantes de FNR fusionadas a GST permitió estudiar el papel desempeñado por el residuo tirosina 89 en la estructura y función de FNR de arveja. Se demostró que la aromaticidad de la cadena lateral de la tirosina 89 resulta importante para la fijación del grupo prostético, con una contribución menor del puente de hidrógeno que forma el grupo hidroxilo del residuo con el ribitilo del FAD. Esta última interacción sería indispensable para definir una conformación adecuada que permita el acercamiento de la cadena lateral de la lisina 110 al puente pirofosfato del NADP+, ya que la sustitución de la tirosina 89 por fenilalanina disminuyó dramáticamente la afinidad por este sustrato. La aromaticidad del residuo en posición 89 no es el único requerimiento para mantener una geometría compatible con la transferencia de hidruro, ya que la sustitución del mismo por triptofano afectó profundamente la capacidad catalítica de la enzima. Se dilucidó el modo de unión productivo del sustrato NADP+ a FNR, mediante el estudio cristalográfico de los mutantes FNR Y308S y FNR Y308W de la enzima de arveja en complejos con NADP(H). La sustitución del residuo tirosina en posición 308 produjo un aumento de la estabilidad de la interacción de la nicotinamida en el sitio activo, no afectó la geometría de unión del NADP(H) y mantuvo la efectividad de la catálisis. Se demostró la existencia de un determinante adicional que contribuye a la capacidad de discriminación entre los sustratos NADP(H) y NAD(H) por parte de FNR. El sitio de unión para el 2'-fosfato del piridín nucleótido realiza el reconocimiento específico y establece fuertes interacciones con el grupo diferencial. El determinante adicional está constituido por la tirosina 308, cuya cadena lateral compite por la misma ubicación en el sitio activo con la nicotinamida, grupo que es común a NADP(H) y NAD(H). En FNR silvestre ambos determinantes contribuyen para alcanzar una preferencia NADPH/NADH de 37100. La anulación del determinante adicional en la mutante FNR Y308S ocasiona una disminución de 500 veces en la preferencia de la enzima por NADPH. El estudio ab initio de un sistema que modeló las interacciones entre la isoaloxazina y las cadenas laterales de las tirosinas 89 y 308 de FNR de arveja, permitió concluir que el ángulo diedro isoaloxazina-fenol en la geometría de mínima energía estaría determinado principalmente por la separación interplanar entre las dos moléculas. Se propone que el grupo de residuos cisteína 266, glicina 267 y leucina 268 impondría una cota a la separación interplanar entre la flavina y la cadena lateral de la tirosina 308, disminuyendo la estabilidad de la interacción entre ambas moléculas.Ítem Acceso Abierto Recombinant protein expression in Escherichia coli: advances and challenges(Frontiers Media, 2014-04-17) Rosano, Germán L.; Ceccarelli, Eduardo AugustoEscherichia coli is one of the organisms of choice for the production of recombinant proteins. Its use as a cell factory is well-established and it has become the most popular expression platform. For this reason, there are many molecular tools and protocols at hand for the high-level production of heterologous proteins, such as a vast catalog of expression plasmids, a great number of engineered strains and many cultivation strategies.We review the different approaches for the synthesis of recombinant proteins in E. coli and discuss recent progress in this ever-growing field.Ítem Acceso Abierto Recombinant protein expression in microbial systems(Frontiers, 2014-07-08) Rosano, Germán L.; Ceccarelli, Eduardo AugustoThe emergence of recombinant DNA technology during the early 70's set a revolution in molecular biology. This set of techniques was strengthened even further later on with the introduction of the polymerase chain reaction and allowed scientists to explore and understand essential life processes in an easy and straightforward way. It also marked the birth of the modern biotech industry [...]Ítem Embargo Regulación y especificidad del sistema proteolítico clp de plantas(2022) Aguilar Lucero, Dianela Ailin; Rosano, Germán L.; Ceccarelli, Eduardo AugustoLa correcta eliminación de proteínas del medio celular constituye un mecanismo de control de calidad esencial que asegura la proteostasis. El reconocimiento adecuado del sustrato es vital para evitar la eliminación de proteínas útiles. Por esta razón, los complejos proteolíticos detectan señales de degradación en sus objetivos. Por ejemplo, los determinantes de secuencia llamados degrones marcan las proteínas para su eliminación. En particular, los residuos específicos en el extremo amino (N-degrones) son una característica de las proteínas de vida corta. La regulación de la vida media de una proteína por la identidad de su región N-terminal se conoce como la “vía N-degrón”. En Escherichia coli, el sistema proteolítico Clp está formado por. ClpP, una proteasa que se asocia con los chaperones Hsp100 ClpA o ClpX. Los monómeros de ClpP se autoensamblan en un tetradecámero en forma de barril. Los chaperones reconocen el objetivo y lo presentan a ClpP. Por ejemplo, ClpA se oligomeriza en un anillo hexámerico que se ancla a los poros de ClpP. Los degrones se unen a ClpA y son desplegados y entregados a ClpP para su procesamiento. ClpS es una proteína adaptadora de ClpA que se une a sus objetivos y los entrega a ClpAP. Reconoce los residuos N-terminales: fenilalanina, tirosina, triptófano y leucina. ClpS contiene una extensión N-terminal desordenada y un núcleo central plegado que presenta una cavidad hidrófoba en la que encajan los residuos desestabilizantes. El reconocimiento requiere un extremo N-terminal libre, ya que la N-acetilación anula la unión a ClpS. Los cloroplastos retienen muchos de los sistemas moleculares presentes en las bacterias, siendo el sistema Clp uno de ellos. En los cloroplastos de Arabidopsis thaliana, la cámara proteolítica está formada por nueve subunidades diferentes (ClpP1, ClpP3-6 y ClpR1-4). Las plantas no poseen homólogos de secuencia de ClpA, pero en cambio, los chaperones ClpC (ClpC1 y ClpC2) y ClpD cumplen su función. El adaptador asociado es ClpS1, que presenta gran homología de secuencia con ClpS, lo que sugiere que los objetivos de ClpS1 podrían seguir la vía N-degrón bacteriana. Finalmente, los cloroplastos presentan otro componente llamado ClpF cuya función todavía no está del todo definida. ClpF estimula la unión de ClpS1 a chaperones ClpC; por tanto, podría actuar como un facilitador de la interacción ClpS1-Hsp100, regular la especificidad de ClpS1 o unirse a N-degrones por sí sola. Hay muchas preguntas abiertas con respecto a la función, especificidad, el modo de acción y las características estructurales de ClpS1. Además, se desconocen los efectos de la acetilación N-terminal en la diana. A su vez, el rol de ClpF es incierto. En este trabajo, se analizaron los determinantes de secuencia que regulan la especificidad de ClpS1 cloroplástica. Se utilizó una combinación de matrices de péptidos, anisotropía de fluorescencia y resonancia magnética nuclear (RMN) y construcción de quimeras para comprender el proceso de reconocimiento y la especificidad de sustrato por ClpS1. Para muchas proteínas ClpS bacterianas, se utilizaron con éxito matrices de péptidos para descubrir sus patrones de reconocimiento. En este trabajo, se usaron matrices peptídicas para estudiar la especificidad de ClpS1. Mediante esta técnica se pudo determinar que ClpS1 reconoce los cuatro residuos (fenilalanina, leucina, tirosina y triptófano) afines de la vía N-degrón bacteriana, pero la identidad del segundo residuo influye en la unión. El mismo ensayo utilizando una membrana peptídica N-acetilada mostró que ClpS1 no es capaz de reconocer y unirse a ningún péptido que se encuentre N-acetilado. Asimismo, para conocer si la presencia de ClpF modifica la capacidad de unión a los péptidos o la especificidad de ClpS1, se repitió el ensayo con las membranas peptídicas y se observó que ClpF no se une a los extremos N-terminales por sí solo ni altera la especificidad de ClpS1. Para obtener una mejor comprensión de la estructura de ClpS1 y sus propiedades de unión al ligando, realizamos un análisis de RMN de la proteína marcada isotópicamente. Este análisis mostró que ClpS1 contiene una región intrínsecamente desordenada y una plegada, rica en elementos de estructura secundaria. Curiosamente, el extremo N-terminal de ClpS1 no presenta un comportamiento de espiral aleatorio puro, sino que muestra dos subregiones con propensión a poblar estructuras secundarias de hoja β y hélice α. Los resultados de la matriz de péptidos indican que ClpS1 se une con alta afinidad a péptidos con Phe y Trp en el extremo N-terminal. Por esta razón, estudiamos mediante RMN la unión de ligandos utilizando análogos de estos dos aminoácidos, L-Phe-amida y L-Trp-amida. Los resultados indican que ClpS1 se une a L-Phe-amida con alta afinidad (Kd <10 μM). También revelaron que el sitio de unión está ubicado entre la primera y la segunda hélice α y la porción N-terminal de la primera hoja β. Así la región más afectada por la unión de L-Phe-amida es el bolsillo hidrófobo presente en la región globular de ClpS1. L-Trp-amida dio perfiles similares, aunque con efectos más pronunciados. Para determinar de forma precisa las afinidades de unión a estos interactuantes se realizó anisotropía de fluorescencia. ClpS1 se unió a L-Trp-amida con una Kd de 2,20 ± 0,33 μM, dentro del valor esperado de acuerdo con los experimentos de titulación de RMN. Se estableció un ensayo de competencia de anisotropía para calcular el Kd para la unión de ClpS1 a L-Phe-amida. ClpS1 se unió a L-Phe-amida con afinidad similar a la LTrp-amida. Con el fin de conocer la especificidad y especificidad de ClpS1, se estudió la posibilidad de utilizar el sistema ClpAP de E. coli junto con ClpS1. En base a esto se construyeron cinco quimeras utilizando la estructura de ClpS1 e intercambiando distintos segmentos por los correspondientes a ClpS de E. coli que podrían estar involucrados en la unión al chaperón y entrega del sustrato. Las quimeras se clonaron y purificaron exitosamente. Se realizaron ensayos de sustitución de ClpS por las distintas quimeras y no se observó degradación del sustrato fluorescente en presencia de ninguna de las quimeras. Los ensayos de competencia realizados con las quimeras, mostraron que todas compiten por el sustrato con ClpS1, aunque en diferente grado. Estos resultados representan un nuevo paso en la comprensión del reconocimiento de objetivos por parte del sistema Clp en orgánulos de plantas y son discutidos en detalle durante el desarrollo de esta tesis.Ítem Acceso Abierto Structural and mutational analyses of the Leptospira interrogans virulence-related heme oxygenase provide insights into its catalytic mechanism(Public Library of Science (PLOS), 2017-08-03) Soldano, Anabel; Klinke, Sebastián; Otero, Lisandro H.; Rivera, Mario; Catalano-Dupuy, Daniela L.; Ceccarelli, Eduardo AugustoÍtem Acceso Abierto TAT-mediated transduction of bacterial redox proteins generates a cytoprotective effect on neuronal cells(Public Library of Science (PLOS), 2017-09-08) Balaban, Cecilia Lucía; Banchio, Claudia; Ceccarelli, Eduardo Augusto