Participación de chaperones Hsp100 en el proceso de estrés térmico en plantas. Reconocimiento de sustratos artificiales y naturales de ClpB

La agregación de proteínas es un proceso que tiene lugar en las células de todos los organismos, desde bacterias hasta humanos, y que se asocia con una variedad de factores. Uno de ellos es el cambio en las condiciones ambientales y, dentro de éste, la carga térmica es particularmente relevante debido al estrés que desencadena, sobre todo en organismos sésiles. Afortunadamente, las células han desarrollado una maquinaria molecular compuesta por múltiples proteínas genéricamente llamadas chaperones, que les permite resolver (en gran medida al menos) el problema de la agregación proteica. Estas proteínas actúan en primer lugar, previniendo la formación de los agregados, o en su defecto, operando sobre éstos una vez que se han formado. Cuando esto último sucede, la célula puede eliminar estos agregados por dos vías: (i) mediante la solubilización de los mismos y posterior plegamiento de los polipéptidos liberados o (ii) por medio de su proteólisis. La primera de estas funciones es llevada a cabo por los chaperones ClpB pertenecientes a la familia de proteínas de choque térmico Hsp100, en colaboración con el sistema de chaperones Hsp70. Los chaperones moleculares ClpB son miembros de la superfamilia de ATPasas AAA+ (ATPases associated with a variety of cellular activities), y al igual que otros chaperones Hsp100, se ensamblan en hexámeros en presencia de ATP, generando una estructura en forma de anillo con un poro central axial. Cada protómero del anillo de ClpB se compone de un dominio N-terminal (NTD); dos dominios de unión a ATP, NBD1 y NBD2; y un dominio medio (MD), característico de esta subfamilia y esencial para la actividad del chaperón. La familia de proteínas Hsp100/ClpB cumple un rol fundamental en la termotolerancia celular, solubilizando y reactivando los agregados de proteína que se generan durante el estrés térmico. Esta función se describió por primera vez en Saccharomyces cerevisiae donde se demostró que las células que expresaban el chaperón ScHsp104 eran capaces de sobrevivir entre 1000 y 10.000 veces más cuando se las sometía a altas temperaturas. Resultados similares se obtuvieron para ClpB de Escherichia coli (EcClpB) y de Arabidopsis thaliana (AtHsp101), entre otros organismos. En particular, los homólogos funcionales de ScHsp104 en plantas corresponden a la forma citosólica de ClpB. Además, existen versiones de esta proteína en cloroplastos y mitocondrias, de las cuales se conoce muy poco en comparación con la forma citoplasmática. Los estudios que se han hecho en cloroplastos de tomate han mostrado por primera vez evidencia de que ClpB podría estar implicada en los procesos de termotolerancia celular. En A. thaliana esto aún no se ha evidenciado, pero se sabe que es imposible obtener plantas knockout en ClpB, por lo que se piensa que podría tener un rol esencial en el desarrollo del proteoma plastídico, además de salvaguardar a la célula en situaciones de estrés. Las evidencias apuntan a que ClpB de cloroplastos sería mayormente un gen housekeeping y por ende diferiría de la forma citosólica, la cual funciona esencialmente luego de una crisis térmica. El reconocimiento y unión de sustratos por chaperones Hsp100/Clp se ha estudiado para muchas proteínas Clp, incluyendo ClpA y ClpX, dos chaperones bacterianos asociados a proteasas. Se han identificado algunos sustratos e incluso secuencias específicas de reconocimiento. Sin embargo, para las diferentes ClpB estudiadas se han registrado muy pocos sustratos, incluso para las provenientes de E. coli y de S. cerevisiae. El presente trabajo de tesis intenta comprender cómo opera ClpB de cloroplastos de A. thaliana (AtClpB3) y qué características presenta en el reconocimiento y unión de sustratos. Para esto nos hemos propuesto como primera medida obtener la enzima pura en solución. Seguidamente, procuramos una caracterización estructural y funcional de AtClpB3, para finalmente analizar la interacción del chaperón con diversos sustratos artificiales y naturales del mismo. El chaperón AtClpB3 se obtuvo en el laboratorio de manera recombinante en E. coli, mediante clonado y posterior expresión y purificación a homogeneidad. Una vez obtenida la enzima pura, se determinó en primer lugar la actividad ATPasa por el método Verde de Malaquita. El chaperón AtClpB3 fue capaz de hidrolizar ATP-Mg2+, pero no ADP-Mg2+ ni ADP o ATP solos (sin Mg2+). A su vez, por cromatografía de exclusión molecular, se pudo determinar que AtClpB3 es capaz de ensamblarse en hexámeros de manera estable en presencia de ATP-Mg2+, pero no así en presencia de los otros nucleótidos. Sin el agregado de ellos, la proteína se encuentra principalmente en forma dimérica, y cuando se agrega ATP o ADP al medio (sin Mg2+), la misma alcanza en ambos casos conformaciones intermedias no funcionales. Una vez determinada la actividad basal de AtClpB3 en presencia de ATP-Mg2+, se procedió a caracterizar esta actividad frente a diferentes condiciones y componentes del medio. En primer lugar, se determinaron los parámetros cinéticos Km y Vmáx, los cuales siguieron una cinética tipo michaeliana para el ATP-Mg2+. Por otro lado, la enzima presentó una relación inversa con la fuerza iónica, mostrando menores actividades a mayores concentraciones de sal, característica compartida por otros chaperones Hsp100. Además, se determinó que AtClpB3 es incapaz de hidrolizar ATP-Mg2+ frente a valores de pH iguales o inferiores a 4,5 como ocurre para EcClpB; siendo ésta una inactivación reversible. Respecto de la temperatura, AtClpB3 presentó una actividad máxima a 62 oC, mostrando actividad incluso hasta los 75-80 oC, lo que sería un indicio de que la proteína podría estar implicada en los procesos de termotolerancia celular. Por otro lado, en ensayos de complementación de cepas de E. coli mutantes en ClpB, el chaperón plastídico no fue capaz de rescatar el fenotipo sensible a la temperatura de las bacterias defectivas, lo que indicaría que ambos chaperones son funcionalmente distintos. Seguidamente, se estudió la actividad de AtClpB3 in vitro en presencia de diferentes sustratos modelos. Los polipéptidos desestructurados como la caseína y la poli-lisina, tienen la capacidad de estimular la actividad ATPasa de los chaperones ClpB y, por lo tanto, pueden actuar como sus sustratos. La adición de caseínas o de poli-L-lisinas estimuló la actividad ATPasa de AtClpB3, aunque en menor proporción a lo observado para EcClpB y ScHsp104. Asimismo, se enfrentó al chaperón con distintas “sondas conformacionales”, cada una de ellas con un grado de plegamiento y estructura diferentes, a fin de inferir las características de plegamiento de los sustratos preferidos por AtClpB3. Desafortunadamente, ninguno de ellos logró activar de manera diferencial a AtClpB3, no pudiendo así especificar los patrones estructurales reconocidos por el chaperón. Estos experimentos con sustratos fueron repetidos empleando el sistema bi-chaperón AtClpB3-AtHsp70, obteniéndose resultados similares. Otros sustratos comúnmente usados son las enzimas luciferasa y glucosa-6-P-deshidrogenasa (G6PDH), debido a que permiten estudiar de manera sencilla la reactivación de los agregados xvi RESUMEN | por ClpB. Hasta hace algún tiempo se pensaba que los chaperones ClpB sólo eran capaces de cumplir su función en colaboración con el sistema Hsp70. Pero más recientemente se ha visto que los chaperones ClpB son capaces de solubilizar agregados in vitro sin la asistencia del sistema Hsp70. Además, la reactivación de agregados Hsp70-independiente puede potenciarse cuando el medio es suplementado con análogo de ATP no hidrolizable como el ATP--S o AMP- PNP. En nuestro caso, AtClpB3 fue capaz de restaurar eficientemente los agregados de G6PDH en ausencia de los chaperones AtHsp70, pero no así los de luciferasa, sea que las Hsp70 plastídicas estuviesen o no presentes. A su vez, la adición de nucleótidos no hidrolizables permitió una mayor y más rápida reactivación. Estos hallazgos son discutidos en detalle durante el desarrollo de esta tesis. Estos resultados permiten por primera vez conocer las características y el funcionamiento del sistema ClpB de cloroplastos de A. thaliana y amplían el conocimiento actual que hay sobre ClpB de diferentes orígenes.