Análisis funcional comparativo de las ferredoxinas-NADP+ reductasas de patógenos bacterianos

Los procesos redox son esenciales para el mantenimiento de la vida. Estas reacciones, llevadas a cabo fundamentalmente por oxidoreductasas, poseen relevancia en todos los organismos. Dentro del grupo de las oxidoreductasas, las flavoenzimas cumplen un rol preponderante por su capacidad de transferir electrones entre sustratos mono y bielectrónicos. Las Ferredoxinas-NADP+ reductasas (FNR) constituyen una familia de proteínas hidrofílicas monoméricas que contienen FAD no covalentemente unido como grupo prostético. Estas enzimas se encuentran ampliamente distribuidas entre los organismos vivos y están involucradas en la transferencia electrónica en diversos procesos biológicos importantes. Las FNR se clasifican en dos tipos: planta y mitocondrial. A su vez, las FNR tipo planta son agrupadas en las clases plastídica y bacteriana. En organismos fotosintéticos, la FNR es la limitante de la producción de NADPH y, por consiguiente, del proceso de fotosíntesis global. En cambio, las FNR presentes en tejidos y organismos heterotróficos operan en la dirección contraria, conduciendo los equivalentes de reducción desde el “pool” de NADPH celular hacia los transportadores electrónicos de bajo potencial (Fd, Fld, adrenodoxina) para diversos metabolismos de óxido-reducción. Las FNR bacterianas participan en vías metabólicas especialmente apropiadas para el desarrollo de agentes antimicrobianos ya que no se encuentran presentes en humanos. Por esto, pueden ser un blanco importante para el diseño de inhibidores en la lucha contra enfermedades causadas por diferentes patógenos. El modelo más aceptado para el mecanismo catalítico de las FNR es el que ha sido propuesto para las enzimas plastídicas, las cuales poseen un residuo tirosina en su carboxilo terminal, absolutamente conservado, que se encuentra interaccionando con la isoaloxacina del FAD. Esta tirosina sería desplazada para permitir la entrada del sustrato NADP+ durante la catálisis. Por otra parte, las FNR plastídicas presentan números de recambio entre 20 y 100 veces mayores a los de las FNR bacterianas, lo que sugiere que éstas últimas presentan limitaciones catalíticas, las cuales fueron superadas por la contraparte funcional presente en organismos y tejidos fotosintéticos. Sin embargo, las bases bioquímicas de estas ventajas catalíticas aún no han sido elucidadas. Además, las FNR bacterianas presentan una región carboxilo terminal estructurada y variable, que no ha permitido proponer modelos lógicos que justifiquen cómo el sustrato logra alcanzar el sitio activo. Evidencias preliminares nos indican que en las enzimas bacterianas el mecanismo catalítico sería diferente. En el laboratorio previamente se habían obtenido cristales de una FNR mutante de E. coli (EcFPR) observándose que contenía el sustrato NADP+ firmemente unido, a pesar de que el mismo no había sido adicionado en el proceso de cristalización. La estructura tridimensional mostró que el NADP+ interacciona con tres argininas. Estos residuos podrían ser los responsables de generar un sitio altamente estructurado con alta afinidad por el nucleótido. Estos tres aminoácidos estarían conservados en las enzimas bacterianas, pero no en las enzimas plastídicas de alta eficiencia catalítica, presentes en cloroplastos de plantas y en cianobacterias. En este trabajo de Tesis, realizamos un estudio funcional comparativo entre FNR plastídicas y bacterianas. Demostramos que las FNR bacterianas purificadas contienen el sustrato NADP+ fuertemente unido. El nucleótido permanece unido a la enzima luego de una extensa diálisis y filtración en gel. Por el contrario, las FNR plastídicas analizadas no lo contienen. El NADP+ podría ejercer una regulación enzimática ya que observamos una correlación entre las cantidades de nucleótido unido a las FNR y las velocidades catalíticas. La presencia de NADP+ redujo considerablemente la actividad de EcFPR, que se recuperó cuando se eliminó el nucleótido de la enzima. Vimos también que la unión del NADP+ produjo una estabilización de la estructura en las FNR bacterianas, pero no se observó ningún efecto sobre las contrapartes plastídicas. Para investigar más a fondo la participación de las argininas mencionadas anteriormente en la unión del NADP+ , construimos diferentes enzimas mutantes de EcFPR y de la FNR plastídica de Pisum sativum (PeaFNR). La caracterización cinética, estructural y de estabilidad de estas proteínas nos permitió confirmar que los residuos R144 y R184 en EcFPR están involucrados en la generación de un sitio estructurado con muy alta afinidad por el NADP+ Nuestros resultados sugieren que las FNR bacterianas muestran un modo de unión de NADP+ diferencial y, por consiguiente, un mecanismo catalítico diferente al propuesto para las FNR tipo plastídicas. Estos hallazgos son discutidos en detalle durante el desarrollo de esta Tesis y nos permitieron plantear por primera vez un modelo de unión y catálisis del NADP+ para las FNR bacterianas. Proponemos que esta fuerte unión constituye un mecanismo catalítico y regulador esencial de estas enzimas, involucradas en la homeostasis redox de la célula.