Examinando por Autor "Bugnon Valdano, Marina Paula"
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Ítem Acceso Abierto Disc Large 1 expression is altered by Human Papillomavirus E7/E6 proteins in organotypic cultures of human keratinocytes(Microbiology Society, 2016-02) Bugnon Valdano, Marina Paula; Cavatorta, Ana Laura; Morale, Miriam; Marziali, Federico Emanuel; Steenbergen, Renske; Boccardo, Enrique; Gardiol, DanielaÍtem Acceso Abierto DLG1 polarity protein expression associates with the disease progress of low-grade cervical intraepithelial lesions(Elsevier) Cavatorta, Ana Laura; Di Gregorio, Alejandra; Bugnon Valdano, Marina Paula; Marziali, Federico Emanuel; Cabral, Mariela; Bottai, Hebe; Cittadini, Jorge; Nocito, Ana Lía; Gardiol, DanielaÍtem Embargo Estudio de la contribución de factores celulares y virales en los procesos tumorales asociados a infecciones por virus oncogénicos(Universidad Nacional de Rosario. Facultad de Ciencias Bioquímicas y Farmacéuticas., 2016-03-28) Bugnon Valdano, Marina Paula; Gardiol, Daniela; Cavatorta, Ana LauraEn el presente trabajo de Tesis se profundizó el entendimiento de mecanismos involucrados en la regulación de proteínas de polaridad, con especial interés en la alteración de la expresión de dichas proteínas celulares en los procesos de transformación maligna. Particularmente, se analizó la regulación de la expresión de la proteína DLG1, cuya expresión se ve alterada en variedad de tumores y que ha sido propuesta como una proteína clave en el mantenimiento de la polaridad celular a nivel de las uniones adherentes. Inicialmente, se estudió la incumbencia en la regulación de DLG1 durante procesos vinculados a infecciones por HPV. Se optimizaron y desarrollaron, por primera vez en nuestro medio, cultivos organotípicos tipo raft. Se generaron dichos cultivos expresando las proteínas transformantes de HPV-18, lo que permitió analizar la regulación de DLG1 en un contexto mimetizando el ambiente natural de infección viral. Mediante esta estrategia de estudio se pudieron analizar en detalle los efectos de la presencia de las mencionadas proteínas virales en la expresión de DLG1. Así, se demostró que la presencia de las oncoproteínas virales provoca alteraciones en la distribución subcelular de DLG1 en el ambiente epitelial y, a su vez, genera cambios significativos en sus niveles. También se analizó el efecto de proteínas virales del HPV- 11, de bajo riesgo oncogénico, observándose cambios significativos tanto en los niveles como en la distribución de DLG1. Por lo tanto, se profundizó en el entendimiento de los mecanismos subyacentes a infecciones por HPV, tanto asociadas como no a procesos carcinogénicos. Una diferencia importante observada entre ambos tipos viales fue la ausencia de DLG1 en los contactos celulares para HPV-18, efecto no evidenciado en el caso del HPV-11. Estas diferencias entre HPV de alto y bajo riesgo podrían tener relevancia en las patologías asociadas, dado los reportes sobre la función oncosupresora de DLG1 a nivel de los contactos celulares. Además, se analizó y discutió la incumbencia de distintos mecanismos potencialmente involucrados en los cambios de la expresión de DLG1, estudiando en especial detalle la participación de alteraciones en el ciclo celular por parte de HPV. Por otro lado, se investigó la expresión de otra proteína de polaridad, PAR3, y su alteración en presencia de las proteínas virales. PAR3 es crucial para la formación de las uniones tight y en los últimos años se ha incrementado el conocimiento de sus funciones como supresor de tumores. Notablemente, mediante cultivos organotípicos se observaron cambios importantes en los niveles totales de PAR3 en presencia de proteínas de HPV tanto de alto como de bajo riesgo oncogénico, indicando probables mecanismos comunes sobre la expresión de la mencionada proteína celular durante las infecciones virales. Además, se obtuvieron resultados preliminares en el estudio de la expresión de PAR3 en biopsias cervicales, paso importante en la identificación futura de probables biomarcadores. También, se estudió la expresión génica de HPV en los cultivos raft portando las secuencias que codifican para las proteínas E6 y E7 de HPV-18. Una premisa fundamental para conocer como el virus interfiere con los blancos celulares es analizar la expresión de los genes tempranos de HPV, en especial de las distintas isoformas de E6. Así, a partir de técnicas moleculares específicas optimizadas, se demostró una mayor expresión de la isoforma E6* en las capas Inferiores del epitelio. Además, se encontró a lo largo del tejido epitelial una transcripción diferencial de DLG1, en relación directa a los niveles de transcriptos virales. Estos datos constituyen un avance en el entendimiento de los cambios en la abundancia de DLG1 en presencia de HPV. Dado que cambios en los patrones de la expresión de DLG1 se observan también en tumores no asociados a HPV, se analizó la incumbencia de factores independientes de tales infecciones. Se investigó la injerencia de mecanismos epigenéticos y, en particular, del estado de metilación de su promotor. Así, se establecieron las bases para el análisis de dichos mecanismos en la regulación de DLG1, no estudiado hasta el momento. Estos ensayos no mostraron una relación directa entre la regulación de los niveles de DLG1 y los mecanismos epigenéticos propuestos, tanto en una variedad de células como en tumores asociados a HPV. No obstante, en base a los resultados obtenidos, dichos mecanismos podrían tener un rol interesante en la regulación de DLG1 en otros tipos tumorales, particularmente durante la progresión maligna en colon. Por lo tanto, en total los resultados del presente trabajo indican mecanismos de alteración de proteínas de polaridad por parte de las proteínas de HPV que podrían ser de gran importancia durante las infecciones naturales. Algunas diferencias fundamentales observadas entre HPV de alto y bajo riesgo podrían resultar relevantes al relacionarse con las patologías asociadas a cada tipo viral. Conjuntamente, los datos presentados constituyen un paso fundamental para comprender la biología del cáncer en general, considerando que la disrupción de la polaridad celular es un evento clave de los procesos tumorales. Por último, la extrapolación a la clínica de los conocimientos generados desde estudios de patobiología básica, como el presente trabajo, es fundamental para la identificación de biomarcadores que contribuyan al diagnóstico y al tratamiento en enfermedades oncológicas.Ítem Acceso Abierto HPV E6 and E7 oncoproteins cooperatively alter the expression of Disc Large 1 polarity protein in epithelial cells(BMC, 2020-04-07) Dizanzo, María Paula; Marziali, Federico Emanuel; Brunet Avalos, Clarise; Bugnon Valdano, Marina Paula; Leiva, Santiago Gabriel; Cavatorta, Ana Laura; Gardiol, DanielaBackground: Persistent infection with high-risk Human Papillomavirus (HPVs) is associated with the development of cervical cancer. The transforming capacity of these viruses relies on the cooperative action of the E6 and E7 viral oncoproteins. Among the oncogenic activities of E6, the interaction and interference with cell polarity PDZ proteins have been well established. One of the most characterized PDZ targets of HPV E6 is human Disc large 1 (DLG1), a scaffolding protein involved in the control of cell polarity and proliferation. Interestingly, in cervical squamous intraepithelial lesions, alterations in DLG1 expression were observed in association to tumour progression. Moreover, the expression of both HPV E6 and E7 proteins may be responsible for the changes in DLG1 abundance and cell localization observed in the HPV-associated lesions. Methods: Due to the relevance of DLG1 deregulation in tumour development, we have performed an in-depth investigation of the expression of DLG1 in the presence of the HPV oncoproteins in epithelial cultured cells. The effects of HPV E6 and E7 proteins on DLG1 abundance and subcellular localization were assessed by western blot and confocal fluorescence microscopy, respectively. Results: We demonstrated that the relative abundance of HPV-18 E6 and DLG1 is a key factor that contributes to defining the expression abundance of both proteins. We also show here that a high expression level of DLG1 may negatively affect HPV-18 E6 nuclear expression. Moreover, the co-expression of HPV-18 E6 and E7 produces a striking effect on DLG1 subcellular localization and a co-distribution in the cytoplasmic region. Interestingly, HPV-18 E7 is also able to increase DLG1 levels, likely by rescuing it from the E6-mediated proteasomal degradation. Conclusions: In general, the data suggest that HPV-18 E6 and E7 may have opposing activities in regards to the regulation of DLG1 levels and may cooperatively contribute to its subcellular redistribution in the HPV context. These findings constitute a step forward in understanding the differential expression of DLG1 during tumour progression in an HPV-associated model.Ítem Acceso Abierto Human papillomavirus (HPV)-18 E6 oncoprotein interferes with the epithelial cell polarity Par3 protein(Federation of European Biochemical Societies, 2014-01-14) Facciuto, Florencia Natalia; Bugnon Valdano, Marina Paula; Marziali, Federico Emanuel; Massimi, Paola; Banks, Lawrence; Cavatorta, Ana Laura; Gardiol, DanielaÍtem Acceso Abierto Interference of HTLV-1 Tax Protein with Cell Polarity Regulators: Defining the Subcellular Localization of the Tax-DLG1 Interaction(MDPI, 2017-11-23) Marziali, Federico Emanuel; Bugnon Valdano, Marina Paula; Brunet Avalos, Clarise; Moriena, Lucía; Cavatorta, Ana Laura; Gardiol, DanielaÍtem Acceso Abierto Novel effect of the high risk-HPV E7 CKII phospho-acceptor site on polarity protein expression(BMC, 2022-12) Dizanzo, María Paula; Bugnon Valdano, Marina Paula; Basukala, Om; Banks, Lawrence; Gardiol, DanielaÍtem Acceso Abierto Transcriptional and translational mechanisms contribute to regulate the expression of Disc Large 1 protein during different biological processes(De Gruyter, 2015-03-14) Marziali, Federico Emanuel; Cavatorta, Ana Laura; Bugnon Valdano, Marina Paula; Facciuto, Florencia Natalia; Gardiol, Daniela; ; ; ; ; ;Ítem Embargo Virus Zika: desde la emergencia epidemiológica hacia el entendimiento de los mecanismos de patogénesis viral(2023) Leiva, Santiago Gabriel; Gardiol, Daniela; Bugnon Valdano, Marina PaulaEl virus Zika (ZIKV) pertenece al género de los Flavivirus (FV). Como muchos miembros de este género, posee un genoma de ARN simple hebra de polaridad positiva relativamente pequeño de sólo 11.000 bases, viriones con una envoltura lipídica y un tamaño promedio de 50 nm. Sin embargo, también cuenta con características únicas que lo distingue de otros FV. Durante mi trabajo de tesis doctoral, nos enfocamos en el estudio de los mecanismos relacionados a dos de estas características distintivas de ZIKV. Por un lado, investigamos la gran capacidad de ZIKV de diseminarse dentro de su hospedador. Este virus logra infectar tejidos de difícil acceso para la mayoría de los patógenos humanos, como es el tejido nervioso central. Para lograrlo, debe ser capaz de atravesar complejas barreras biológicas. Sin embargo, los mecanismos que emplea para esto permanecen sin comprenderse completamente. Por lo tanto, decidimos abordar esta incógnita, a través de distintos modelos experimentales. Inicialmente, nos enfocamos en investigar la posibilidad de que ZIKV logre alterar la integridad de las uniones intercelulares (UI) como parte de un mecanismo de patogenicidad que facilite atravesar barreras biológicas por una vía paracelular. Para ello, desarrollamos un modelo de infección in vitro de ZIKV, en colaboración con el Instituto Nacional de Enfermedades Virales Humanas (INEVH) “Dr. Julio Maiztegui”, donde obtuvimos acceso a 3 aislamientos virales de ZIKV. Utilizando dicho modelo realizamos ensayos de inmunofluorescencia (IF) para evidenciar cambios en la abundancia y localización de proteínas celulares constituyente de las UI. Seleccionamos a la proteína celular Ocludina como marcador de la integridad de las uniones estrechas y a la proteína DLG1 (del inglés Disc Large 1) como marcador de integridad de las uniones adherentes. Además, para evaluar de forma más precisa y reproducible los cambios que podrían sufrir estas proteínas durante la infección por ZIKV, desarrollamos un algoritmo de cuantificación automatizada de la fluorescencia asociada a la expresión de dichas proteínas celulares, basado en la segmentación de las imágenes. Luego del análisis cuantitativo de imágenes obtenidas a partir de ensayos de IF, observamos una reducción en los niveles de expresión de las proteínas Ocludina y DLG1 tras la infección con distintas cepas virales, aunque sin cambios significativos en la localización subcelular de tales marcadores. Estos resultados nos alentaron a buscar la existencia de mecanismos alternativos o complementarios que podrían influir en la diseminación del virus dentro de sus hospedadores. Por lo tanto, estudiamos la posibilidad de que el virus emplee mecanismos transcelulares de diseminación, en donde manipularía a su favor componentes de las vías secretoras celulares para facilitar su transporte y liberación dentro de la células que componen las barreras biológicas. En este contexto, analizamos factores celulares que podrían estar implicados en las etapas tardías del ciclo de replicación de ZIKV, que hasta el momento resultan poco comprendidas. Para esto, realizamos ensayos de proteómica donde evaluamos los cambios en el proteoma de células humanas en presencia de la proteína no estructural 1 (NS1) de ZIKV. Esta es la única proteína viral de ZIKV que es secretada al espacio extracelular y se ha reportado que participa tanto en los mecanismos de ensamblaje como de liberación de las partículas virales. Nos enfocamos en buscar posibles proteínas celulares relacionadas a mecanismos de transporte intracelular que hubiesen cambiado su nivel de expresión en presencia de NS1. Interesantemente, encontramos que la proteína celular sinaptotagmina-9 (SYT9) mostró un gran aumento de sus niveles de expresión en presencia de dicha proteína viral. SYT9 es una proteína celular poco estudiada hasta el momento, aunque existen reportes que sugieren que podría ser crucial en mecanismos de transporte intracelulares asociados a vesículas en diversos tejidos. Este hallazgo resultó muy interesante si se contempla que tanto NS1 como los nuevos viriones de ZIKV producidos durante una infección, son liberados de las células mediante transporte vesicular. Por lo tanto, nos propusimos realizar ensayos de microscopia confocal de fluorescencia y Western Blot (WB) para profundizar dicho hallazgo. En este contexto, pudimos demostrar que la presencia de proteínas virales relacionadas a la liberación y ensamblado de los nuevos viriones de ZIKV como son NS1 o la proteína estructural de la envoltura (E), incrementan significativamente la expresión de la proteína celular SYT9. Además, en los ensayos de microscopía confocal de fluorescencia fue posible evidenciar que NS1 y E de ZIKV inducen una fuerte redistribución de SYT9 con un intenso patrón de co-localización con ambas proteínas virales. Además, pudimos reforzar nuestros resultados al demostrar que durante la infección por ZIKV la proteína SYT9 sufre cambios similares a los descriptos anteriormente en relación a su expresión y localización subcelular, mostrando nuevamente una intensa co-localización con las proteínas virales NS1 y E de ZIKV en modelos de infección in vitro. Si bien otros estudios son necesarios para profundizar estos hallazgos, estos resultados son muy importantes dado que es la primera vez que puede asociarse una proteína de la familia de las sinaptotagminas con el ciclo de replicación de los FV. Por otro lado, también decidimos investigar la particular epidemiología de ZIKV. Principalmente, nos abocamos a estudiar las diferencias genéticas existentes entre las cepas de linaje Asiático responsables de las epidemias por ZIKV y las cepas pre epidémicas tanto de linaje asiático como africano (los 2 únicos linajes descriptos para ZIKV). Además, también estudiamos si las cepas epidémicas responsables de los casos asociados a neuropatologías (principalmente microcefalia) poseían variantes genéticas únicas respecto a las demás cepas epidémicas asociadas a casos sintomáticos más leves. Para ello, generamos una base de datos con secuencias genómicas completas de ZIKV que se encontraban disponibles en repositorios digitales. Luego, desarrollamos un algoritmo bioinformático para comparar las secuencias asiáticas epidémicas con los demás grupos, y registrar todas las variantes nucleotídicas así como información relevante asociada a estas variantes, incluyendo: sus posiciones en el genoma, sus consecuencias traduccionales y la frecuencia de cada variante dentro de cada uno de los grupos de secuencias mencionados. Posteriormente, evaluamos la distribución de estas variantes en el genoma de ZIKV para determinar si existían genes con diferente tasa de variabilidad. Además, analizamos en profundidad la frecuencia de cada variante, con el objetivo de encontrar variantes que fueran comunes a todas las secuencias de un determinado grupo de aislamientos de ZIKV. Finalmente, estimamos el impacto de estas mutaciones sobre la estabilidad de las proteínas virales utilizando como parámetro la variación de la energía libre de Gibbs del plegamiento de las proteínas (ΔΔG) y realizando un modelado proteico de las variables más relevantes epidemiológicamente. De esta manera, logramos identificar varias nuevas variantes genéticas que afectarían la estructura de las proteínas virales y que, a su vez, están presentes en todas las secuencias de los aislamientos epidémicos, pero en ninguna de las secuencias pre epidémicas. Estos datos podrían servir como un importante punto de partida para futuros estudios biológicos para comprender fehacientemente el impacto de estos cambios en las características de las cepas emergentes. En resumen, teniendo en cuenta los resultados obtenidos durante este trabajo de Tesis Doctoral podemos concluir que el mismo aporta al conocimiento integral de los mecanismos subyacentes a las particularidades biológicas y epidemiológicas demostradas para un virus con impacto importante en la salud pública regional. Durante este trabajo, fue posible mejorar nuestro entendimiento de los mecanismos patogénicos que ZIKV utiliza para diseminarse dentro de su hospedador. Además, fue posible identificar potenciales factores celulares que el virus necesitaría para completar su ciclo de vida durante el curso de una infección y que podrían interpretarse como potenciales blancos terapéuticos en futuras investigaciones. Por otro lado, con este trabajo de tesis también hemos aportado a dilucidar las razones por las cuales este virus podría haber logrado desarrollar la última epidemia en América. Esto último nos permite conocer mejor la biología de este virus y sentar las bases para una mejor estrategia preventiva en caso de nuevas emergencias por ZIKV.