Aspectos fisiológicos del metabolismo de esteroles en Tetrahymena thermophila

Tetrahymena thermophila es un ciliado de vida libre, aerobio y fagótrofo, que habita en fuentes de agua dulce de clima templado. La cubierta de cilias que posee en la totalidad de su superficie le permite movilizarse y alimentarse, y una compleja estructura interna le confiere resistencia y flexibilidad. Las membranas de T. thermophila poseen un hopanoide denominado tetrahymanol en lugar de los esteroles conocidos en otros eucariotas; sin embargo, cuando encuentra esteroles en su medio de crecimiento, los incorpora y los modifica tanto por desetilación -en el caso de ser fitoesteroles- como por adición de dobles enlaces en posiciones 5(6), 7(8) y 22(23). El compuesto final tri-insaturado, llamado 7,22-bis dehidrocolesterol, eventualmente reemplaza al tetrahymanol en la membrana. En este trabajo de tesis, particularmente se abordaron los mecanismos involucrados en la internalización de esteroles, y en las vías de señalización que conducen al cambio en la expresión de las enzimas involucradas. Por medio de videos digitales de alta resolución se comprobó que las células de T. thermophila suplementadas con colesterol aumentan inmediatamente la velocidad promedio de nado, de tipo lineal. Este efecto es característico de quimio-atrayentes, siendo la primera vez que se demuestra un comportamiento similar frente a esteroles. También se observó un mayor número de células en el estado estacionario de cultivos crecidos con colesterol, indicando un posible efecto mitogénico. Evidenciamos una modulación transcripcional generalizada en cultivos de T. thermophila suplementados con colesterol. Analizando el transcriptoma de estas células, obtenido por RNAseq, identificamos 177 genes inducidos y 179 genes reprimidos significativamente (genes diferencialmente expresados, o GDE). Sólo tres de los cuatro genes que codifican para las desaturasas de esteroles se encuentran inducidos. La mayor parte de los genes involucrados en la síntesis de tetrahymanol se encuentran reprimidos, confirmando que dicha síntesis es regulada principalmente a nivel transcripcional. Entre otros genes identificados figuran algunos presumiblemente involucrados en el transporte de esteroles y en mecanismos de señalización celular. Los resultados de RNAseq se validaron por medio de la técnica RT-qPCR. El patrón de expresión de los GDE seleccionados es consistente entre ambas metodologías, demostrando la confiabilidad de los datos de RNAseq. La técnica de RT-qPCR, además, fue utilizada como una herramienta para evaluar los cambios a nivel transcripcional de cultivos de T. thermophila sometidos a diferentes tratamientos, utilizando algunos de los GDE como “reporteros” de inducción/represión. En primera instancia, se ensayaron compuestos comerciales conocidos por afectar vías de señalización canónicas. La intención fue encontrar paralelismos en su accionar que pudieran dar un indicio sobre las vías de traducción de señales gatilladas por colesterol. De los numerosos compuestos probados, sólo cuatro ejercieron un efecto significativo, antagónico al colesterol. En otros modelos celulares, estas drogas inhiben la acción de fosfolipasas y/o kinasas; sin embargo, en T. thermophila no hemos observado diferencias en los patrones de fosforilación de proteínas producidos por colesterol, droga, o una combinación de ambos. Sus blancos son, entonces, diferentes a los reportados para los modelos animales. En todos los casos, el efecto sobre el gen reportero de represión fue total, mientras que sobre el de inducción fue parcial, lo que da cuenta de la existencia de al menos dos vías de señalización diferentes para estos grupos de genes. Las siguientes preguntas por resolver fueron cómo ocurre la internalización y compartimentalización de los esteroles, y cómo estos procesos se asocian a las señales que desencadenan la regulación transcripcional. Un trabajo reportado por otros autores utilizando la cepa deficiente en fagocitosis T. thermophila II8G-IA sugería que la incorporación de esteroles ocurre únicamente por fagocitosis. Se utilizó la misma mutante en comparación con la cepa salvaje para (a) observar la actividad transcripcional frente a colesterol, (b) detectar la producción de esteroles modificados, y (c) describir las vías de incorporación de esteroles. Empleamos para algunos de estos fines Citocalasina D (CytD), inhibidor de la endocitosis dependiente de actina, y U18666A, inhibidor de la proteína NPC1, encargada del egreso de colesterol desde los endolisosomas hacia otras organelas, como el retículo endoplasmático (RE). Comprobamos así que existen dos vías de incorporación, ambas dependientes de actina: una fagocítica, en la cual la acumulación de colesterol es masiva y a cortos tiempos, y otra endocítica (evidenciable en la mutante), más lenta, aunque sostenida en el tiempo. En contraste con la cepa salvaje, en la cepa mutante II8G-IA el colesterol no es modificado hacia los derivados insaturados. En los perfiles de lípidos de ambas cepas incubadas con 14C-colesterol se distinguen bandas de ésteres de esteroles, evidenciando su pasaje por RE -donde reside la enzima responsable de la esterificación, la acil-CoA transferasa-. No se observan esteroles acilados cuando se agrega U18666A al medio; este compuesto inhibiría a una proteína similar en función a NPC1 de este ciliado, impidiendo la salida de colesterol desde los endolisosomas, y consecuentemente, su llegada al RE. En la cepa mutante, sólo el grupo de GDE inducibles responden a colesterol. Por ende, el ingreso del esterol por fagocitosis es clave para la represión de genes. Esto es coherente con la existencia de dos vías de señalización distintas planteadas anteriormente. Tanto CytD como U18666A ejercen un efecto antagónico al colesterol sobre los GDE de ambas cepas. Las señales por colesterol se generarían entonces en compartimentos intracelulares, y no en la membrana plasmática, de forma similar a lo que ocurre en eucariotas superiores.