Facultad de Ciencias Bioquímicas y Farmacéuticas
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Nuestra Facultad dicta las carreras de Bioquímica, Farmacia, Licenciatura en Biotecnología, Licenciatura en Química, Profesorado en Química y Licenciatura en Ciencia y Tecnología de los Alimentos. Ofrece una valiosa oferta de posgrado, con la posibilidad de cursar especializaciones, maestrías y doctorados.
Está directamente vinculada con prestigiosos centros e institutos de investigación que forman parte del Consejo Nacional de Investigaciones Científicas y Técnicas (CONICET) y de la UNR, entre los que se encuentran: el Centro de Estudios Fotosintéticos y Bioquímicos (CEFOBI), el Instituto de Procesos Biotecnológicos y Químicos (IPROBYQ), el Instituto de Fisiología Experimental (IFISE), y el Instituto de Biología Molecular y Celular de Rosario (IBR), y el Instituto de Química de Rosario (IQUIR).
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Ítem Acceso Abierto Preformulation and long-term stability studies of an optimized palatable praziquantel Ethanol-free Solution for pediatric delivery(MDPI, 30-07-23) Bedogni, Giselle; García , Paula; Seremeta, Katia; Okulik , Nora; Salomon, Claudio; https://orcid.org/0000-0001-6302-7073To date, the treatment for cysticercosis and neurocysticercosis consists of a single oral intake of praziquantel (5–10 mg/kg), which since it is only available as tablets, hinders its administration to pediatric patients. Praziquantel is a poorly water-soluble drug which represents a challenge for its formulation in solution, particularly for the pediatric population. Thus, this study aimed to develop a palatable solution for praziquantel using pharmaceutical-accepted co-solvent systems. A design of experiments approach was applied to identify the optimal conditions for achieving a suitable amount of praziquantel in solution using co-solvent mixtures. Thus, praziquantel solubility increased from 0.38 up to 43.50 mg/mL in the optimized system. A taste masking assay in healthy human volunteers confirmed a successful reduction of drug bitterness after the addition of selected flavors and a sweetener. Stability studies were also conducted at different temperatures (4, 25, and 40 °C) for 12 months Even though the presence of the three known impurities of praziquantel was observed, their amounts never exceeded the acceptance criteria of the USP. Thus, this novel approach should be considered a valuable alternative for further preclinical studies considering the high prevalence of this infection worldwide.Ítem Acceso Abierto Efecto de la carencia proteica en la dieta sobre la metabolización hepática de aniones orgánicos(1985) Rodríguez, Joaquín Valentín; Rodríguez Garay, Emilio AlbertoEl objetivo de las presentes investigaciones fue analizar los mecanismos por los cuales la carencia de proteínas en la dieta de ratas adultas altera el transporte hepático de aniones orgánicos. Se eligió como modelo experimental la rata entera. El periodo de administración de la dieta aproteica (DA) fue de 7 días, debido a que durante ese lapso no se producen alteraciones histológicas hepáticas. Los aniones orgánicos utilizados fueron la Bromosulfoftaleína (BSF) y Dibromosulfoftaleína (DBSF) considerados modelos representativos para el estudio de la función hepática. Ambos aniones comparten prácticamente los mismos pasos en el transporte hepático, a excepción de la conjugación ya que la BSF es conjugada con glutatión como paso previo a su excreción biliar mientras de la DBSF es metabolizada.Ítem Acceso Abierto Oxidación de desoxiazucares de interés biológico por acción del Cr(vi) en medio ácido(Universidad Nacional de Rosario. Facultad de Ciencias Bioquímicas y Farmacéuticas., 1993-03-15) Daier, Verónica Andrea; Rizzotto, Marcela AdrianaLa oxidación de las aldosas y desoxialdosas estudiadas por acción del Cr(VI) conduce a la formación del ácido aldónico (o su lactona) correspondiente y Cr3+ como productos finales de reacción, cuando se trabaja en exceso de agente reductor respecto al Cr(VI) (condiciones de pseudo-orden n). La reacción redox se produce simultáneamente a través de dos caminos de reacción: Cr(VI) > Cr(III) y Cr(VI) > Cr(V) > Cr(III) Las leyes de velocidad para las reacciones de oxidación por acción del Cr(VI) se expresan de la siguiente forma: Rib(6) -d[Cr(VI)]/dt = kobs [Cr(VI)]T = kH[H+]^2 [Rib] [Cr(VI)]T 2dRib(13) d[Cr(VI)]/dt = kobs’ [Cr(VI)]T= (k0 + kH’ [H+]2 [2dRib] [Cr(VI)]T 2dGlc(14) v = -d[Cr(VI)]/dt = kobs [Cr(VI)] {c + (d + e[H+] + f[H+]^2) [2dGlu]} [Cr(VI)] v = -d[Cr(V)]/dt = k^V [Cr^V]= (k1 + k2 [H+]) [2dGlu] [Cr^V] Glc(1), Gal(2), 6dGal(9), Alo(11), 26dRib(12) -d[Cr(VI)]/dt = kH [ald] [Cr(VI)] -d[Cr^V]/dt = kb Kb [ald] [Cr^V] / (1 + Kb [ald]) En el estudio comparativo de aldosas, el orden de reactividad, a 33°c, fue el siguiente: 2,6dRib(12) > Gal(2) > Alo(11) > Gluc(1) >> 6dGal(9) El radical aldosa-alcóxido intermediario pudo atraparse con DMPO, detectándose por espectroscopia RPE dando lugar a una señal multilinea a g= 2.003. El intermediario paramagnético: Cr(V) se genera, probablemente, en un paso rápido de reacción por reacción del radical- aldosa con Cr(VI). El sustrato orgánico es oxidado por ambos agentes oxidantes Cr(VI) y Cr(V) con: a) velocidades comparables, especialmente a medida que aumenta la concentración de aldosa, produciéndose la reducción de Cr(VI) simultánea a la de Cr(V). Aldosas Glc(1), Gal(2), 6dGal(9), Alo(11) b) velocidades de oxidación por Cr(V)>> Cr(VI) . Aldosas: Rib(6), 2dRib(13), 26dRib(14) y 2dGlc(14) Las mediciones espectroscópicas de RPE demostraron que se formaban intermediarios penta- y hexa- coordinados de oxocromato(V), con la aldosa y/o el ácido aldónico actuando como ligando bidentadoÍtem Acceso Abierto Estudio de la secreción de oviducto en Bufo arenarum y su relación en el proceso de fecundación(Universidad Nacional de Rosario. Facultad de Ciencias Bioquímicas y Farmacéuticas, 1998-04) Arranz, Silvia Eda; Cabada, Marcelo O.El reconocimiento entre el espermatozoide y el ovocito constituye la primera etapa del proceso de fecundación. En Anfibios Anuros, ese primer contacto ocurre entre el espermatozoide y la cubierta gelatinosa que rodea los ovocitos. En este trabajo de tesis se describe: (A) la identificación y purificación de la proteína estructural mayoritaria (HGP) de cubiera gelatinosa de ovocitos de Bufo arenarum a partir de la secreción de oviducto, donde se originan los componentes de la misma; el sitio de síntesis de HGP en oviducto y su caracterización estructural, (B) la purificación y caracterización de una glicoproteína difusible (L-HGP) de cubierta gelatinosa y su sitio de síntesis; (C) la función biológica de L-HGP y (D) el estudio de los componentes estables y difusibles de cubierta gelatinosa de ovocitos de Bufo arenarum. […]Ítem Acceso Abierto Efectos de agonistas GABaérgicos y benzodiazepinas sobre la función renal(Universidad Nacional de Rosario. Facultad de Ciencias Bioquímicas y Farmacéuticas, 1998-10-14) Monasterolo, Liliana Alicia; Elías, María Mónica E.La utilidad terapéutica de distintas drogas GABAérgicas, de las benzodiazepinas clásicas y de la benzodiazepina antagónista, flumazenil, se debe a las acciones de estos agentes a nivel del sistema nervioso central . Sin embargo, las evidencias acumuladas en los últimos años de la relevancia del sistema GABAérgico y de los receptores a benzodiazepinas en la periferia han ampliado las perspectivas clínicas de estos agentes. El objetivo planteado en el presente trabajo fue caracterizar los efectos de agonistas GABAérgicos y benzodiazepinas sobre la función renal; y evaluar posibles mecanismos involucrados. Los experimentos se realizaron con ratas Wistar adultas. La función renal se evaluó mediante técnicas de clearance, en el animal intacto sometido a infusión continua o en el modelo de riñón aislado y perfundido. Los parámetros funcionales estudiados en los experimentos in vivo fueron: clearance de PAH, como índice de flujo plasmático renal; velocidad de filtración glomerular, estimada a partir del clearance de inulina …Ítem Acceso Abierto Estudio fisicoquímico de la desestabilización de micelas de caseína bovina en suspensión durante la coagulación enzimática de la leche(Universidad Nacional de Rosario. Facultad de Ciencias Bioquímicas y Farmacéuticas, 1998-11-28) Pires, Miryam Susana; Gatti, CarlosLa coagulación de la leche es el proceso básico más importante en la manufactura del queso. Influye en la economía de la fabricación de los mismos por varias razones: determina la velocidad de procesamiento de las plantas elaboradoras, el rendimiento y la calidad del queso producido. Aunque la fabricación del queso es un arte practicado desde hace muchísimos años, las bases fisicoquímicas de este proceso permanecen, aún hoy, poco claras y son motivo de innumerables estudios. La leche esta constituida por una gran cantidad de componentes: proteínas, minerales, grasas, etc. De la fracción protéica, las micelas de caseína (MC) constituyen el elemento fundamental sobre el que se basa el proceso de coagulación. Son estructuras aproximadamente esféricas con un diámetro entre 20-300nm. Están formadas por varios tipos de caseína: alpha s1, alpha s2, beta y kappa. Esta última, muy hidrofílica se ubicaría en la superficie de estas estructuras proyectándose hacia el medio acuoso en forma de pelos...Ítem Acceso Abierto Estudios sobre la expresión y estructura de la enzima málica NADP dependiente de plantas con distintos metabolismos fotosintéticos(Universidad Nacional de Rosario. Facultad de Ciencias Bioquímicas y Farmacéuticas., 1998-12-23) Casati, Paula; Andreo, Carlos SantiagoLos resultados obtenidos al estudiar el posible rol fisiológico y las propiedades cinéticas y estructurales de la enzima málica dependiente de NADP purificada de trigo sugieren la existencia de una única isoforma de 72 kDa en los tejidos de esta especie C3. Esta enzima fue purificada a homogeneidad a partir de tallos y raíces de trigo y con ella se realizaron estudios cinéticos. La enzima no presenta histéresis. Los valores obtenidos de pH óptimo coinciden con los anteriormente descriptos para otras enzimas de plantas C3 y CAM y difieren con el comportamiento de la enzima de plantas C4. La actividad enzimática fue absolutamente dependiente de la presencia de un catión bivalente (Mg2+ o Mn2+), mostrando cinéticas de saturación no hiperbólicas como sucede con la EM-NADP de plantas C4. Por otra parte, las curvas de saturación obtenidas en función da la concentración de NADP y L-malato fueron hiperbólicas. La actividad de EM-NADP fue inducida por tratamiento con celulasa macerosima y glutatión, y este aumento fue asociado con aumentos de proteína determinado a partir de Western blots. Estos resultados sugieren que la EM-NADP de plantas C3 podría estar involucrada en la biosíntesis de lignina relacionada con respuestas de defensa de la planta, proveyendo de NADPH a los dos pasos dependientes de NADPH de la biosíntesis de monolignol. Las EM-NADP de maíz y de trigo se disocian en un medio acidico y bajas temperaturas de manera secuencial siguiendo el orden T-D-M. Las entalpías para los equilibrios fueron negativas, pero el proceso total provoco un cambio de energía libre estándar positiva siendo la entropía del sistema un factor importante en ambos equilibrios. La presencia de Mg2+, NADP y L-malato modifican los equilibrios entre M, D y T dependiendo de la fuente enzimática. El catión indujo la agregación de ambas enzimas hacia la forma tetramerica, mientras que el L-malato no modifico el estado oligomérico de la EM-NADP de ambas fuentes. El NADP no cambio el estado multimérico de la enzima de maíz aunque la enzima de trigo se asoció en presencia de la coenzima. Por último, el glicerol estabilizo la forma tetramerica en ambos sistemas, mientras que un aumento en la fuerza iónica favoreció la disociación de la estructura oligomérica de la EM-NADP. Estos resultados favorecen la idea de que la EM-NADP de maíz y de trigo existiría en varios estados oligoméricos (M, D y T) in vivo y que este proceso de asociación-disociación podría estar mediada por la concentración de metabolitos en el medio, condiciones de luz, fuerza iónica y el pH. La actividad de la enzima málica dependiente de NADP fue inducida por radiación UV-B, al igual que el contenido proteico y el ARNm a casi el mismo nivel que por altos niveles de luz blanca dependiendo de la intensidad de la luz y la duración del tratamiento. El efecto de la radiación UV-B fue también eficaz cuando se administraron pequeñas dosis de UV-B seguidas por un tratamiento de oscuridad. La luz roja fue efectiva en la inducción de EM-NADP, de manera similar a la radiación UV-B, administrada tanto en forma continua como por periodos cortos. Nuestros resultados también muestran también que luego de una exposición corta bajo luz roja lejana aplicada inmediatamente después de los pulsos de luz UV-B o roja el efecto inductivo sobre la enzima málica se reduce significativamente, y el efecto de la luz roja lejana se revierte por un pulso final con luz roja o UV-B. De esta manera proponemos que elevados niveles de EM-NADP podrían proveer a las plantas con mayor cantidad de poder reductor para reparar a la célula y además aumentar el contenido de piruvato y NADPH para la respiración mitocondrial. Las especies C3 de Flaveria poseen baja actividad de EM-NADP, que es principalmente atribuida a la forma de mayor masa molecular de la enzima, mientras que las especies C4 de Flaveria poseen muy altas actividades de EM-NADP en hojas atribuible a la presencia en forma mayoritaria de la isoforma de baja masa molecular. La isoforma de mayor masa molecular en las especies de Flaveria C3 parece poseer una mayor Km para el NADP que la forma de menor masa molecular de las especies de Flaveria C4. Los Western blots realizados con extractos proteicos de hojas de distintas especies C3 muestran que la banda inmunoreactiva mayoritaria es el monómero de 72 kDa y presenta bajos niveles de las formas de menor masa molecular (62 y 64 kDa), mientras que las especies de Flaveria C4 muestran una banda muy reactiva de 62 kDa de la EM-NADP, y bandas menores de 64 y 72 kDa. En las especies C3 y C4 existen hasta tres formas monoméricas de la enzima de 62, 64 y 72 kDa, y la cantidad relativa de cada forma puede variar entre los intermediarios. En hojas de especies similares a C4, existen dos bandas predominantes (62 y 64 kDa), estando la forma de 72 kDa presente en muy bajos niveles. En conjunto, todos estos resultados demuestran la presencia de 3 isoformas de la EM-NADP con diferentes masas moleculares en Flaveria, un aumento en la expresión de las forma de 64 kDa desde las especies C3 hasta las similares a C4, y un aumento en la expresión de la forma de 62 kDa y una disminución de la expresión de la forma de 72 kDa desde las especies C3 hasta las C3-C4, similar a C4 y las C4. La EM-NADP se localiza principalmente en los cloroplastos, tanto en células mesofilicas de las plantas C3 y en ambos tipos de células fotosintéticas en las otras especies siendo mayoritaria la marca en células de la vaina vascular en las especies C4. En especies intermedias, la marca mayoritaria se encontró en los cloroplastos de la vaina vascular mientras que una marca significativa también se observó en cloroplastos mesofilicos. Se observaron tres formas activas de la EM-NADP en hojas de la especie intermediaria C3-C4 F. floridana que se diferencian por masa molecular y puntos isoeléctricos nativos. La EM-NADP se encuentra parcialmente compartamentalizada en los distintos tipos de células fotosintéticas, obteniéndose una mayor actividad específica y una mayor expresión de las formas de 64 y 62 kDa en la fracción correspondiente a los cloroplastos de la vaina vascular. La forma purificada de 62 kDa presenta propiedades cinéticas intermedias entre las enzimas málicas de plantas C3 y C4. La enzima exhibe un máximo de actividad a pH 7,5 de manera similar a lo observado con otras enzimas de plantas C3 y CAM y difiriendo con el comportamiento de la enzima de plantas C4. La actividad enzimática depende de la presencia de un catión bivalente (Mg2+ o Mn2+). Las cinéticas de saturación obtenidas para NADP y L-malato fueron hiperbólicas y no se observó inhibición por L-malato a pH 7,0, difiriendo al comportamiento de plantas C4 e indicando que la enzima presenta características intermedias. En resumen, la forma purificada representa una forma enzimática no descripta hasta el presente.Ítem Acceso Abierto Estudio de rutas sintéticas dirigidas a Saudina(Universidad Nacional de Rosario. Facultad de Ciencias Bioquímicas y Farmacéuticas., 1999-03-27) Labadie, Guillermo Roberto; González Sierra, ManuelEn la primera etapa de este trabajo de tesis, se intentó una secuencia sintética convergente hacia un modelo simplificado de saudina. Para ello se desarrolló una ruta de síntesis para preparar las vinil cetonas 72 y 86 partiendo de los monoterpenos Limoneno y Carvona respectivamente. Los intentos de acoplamiento con ácido tetrónico, rindieron únicamente el aducto bicíclico 90 proveniente de 72. Del estudio de la reacción de condensación aldólica de 88 se concluye que, la presencia del grupo metilo vecino a la cetona jugaría un importante rol impidiendo la formación del estado de transición que conduce al producto. Para sustentar esta suposición se preparó una vinil cetona más sencilla, sin el grupo metilo y el estudio con este modelo dio el biciclo 100 que cuidadosamente aislado e identificado confirmó la factibilidad de las reacciones de Michael-Condensación aldólica conteniendo sustituyentes en el carbono beta al grupo carbonilo. Un intermediario más avanzado en funcionalidades fue la β-aminocetona 106, equivalente sintético de la vinil cetona 108 que fue preparada a partir de norbornenona, a través de una reacción retro oxi-eno del alcóxido del compuesto 110. Luego del acoplamiento de la β-amino cetona con ácido [Figuras de los compuestos 72, 86, 88, 100, 110] tetrónico y de una reacción de condensación aldólica se obtuvo la enona 125, compuesto que resulta un intermediario interesante hacia Saudina y o compuestos modelos, pues posee todos los carbonos del esqueleto base y las funcionalidades necesarias para llegar a Saudina. [Figuras de los compuestos 108, 106, 124, 125] En la segunda parte de este trabajo se estudió una aproximación lineal hacia modelos de Saudina. Partiendo de la reacción de alquilación de Birch de la α-tetralona, se preparó la dienona 173, compuesto cuya tendencia a dar reacciones retro fue confirmada por un estudio teórico, y fue necesario, para estabilizar el sistema, funcionalizar uno de los doble enlaces. Se optimizó una ruta sintética estereoselectiva hacia el intermediario 195 y luego se sintetizaron, pasando por los triciclos 201 y 202, el modelo 205 conteniendo el resto de acetal cíclico presente en Saudina 8 [Figuras de los compuestos 173, 195, 201 y 202, 199, 8 R=Furanilo] y un modelo más avanzado conteniendo además el sistema de lactona-acetal 201, que posee una lactona de 7 miembros en lugar de una δ-lactona. Se intentaron diferentes alternativas para lograr la lactona de seis y en esos intentos se obtuvieron los intermediarios claves 238 y [Figuras de los compuestos 208, 207, 238 y 239, 241] 239 que condujeron al cetoácido 241 por una ruptura oxidativa del doble enlace. Sin embargo, la reacción de ciclación de este compuesto no se pudo concretar. Alternativamente se estudió otra ruta de síntesis de un compuesto modelo más funcionalizado que dió lugar a la lactona intermediaria 248 y a los intermediarios 254 y 256. [Figuras de los compuestos 248, 254, 256] Durante el análisis de los datos espectrales de RMN de 13C de una serie de epóxidos obtenidos sobre los sistemas de decalinas utilizadas en este trabajo se pudo establecer una regla empírica que permite asignar inequívocamente la estereoquímica de epóxidos ubicados en la posición 4a-5 de decalinas.Ítem Acceso Abierto Identificación y caracterización de proteínas de estrés de Streptomyces coelicolor(Universidad Nacional de Rosario. Facultad de Ciencias Bioquímicas y Farmacéuticas, 1999-03-29) Orsaria, Lelia María; Gramajo, Hugo CesarLas bacteria del genero Streptomyces presentan un complejo mecanismo de diferenciación morfológica: el mismo se inicia cuando el micelio sustrato comienza a autolisarse y de el emergen hifas aéreas multinucleadas, que darán lugar al micelio aéreo. Estas hifas aéreas continuaran con la diferenciación morfológica (enrollamiento, tabicacion, etc.) para dar finalmente numerosas esporas uninucleadas. En medio líquido muchas especies de Streptomyces no esporulan, sin embargo aun mantienen la capacidad de diferenciarse fisiológicamente, dando lugar a la producción de una gama muy amplia de metabolitos secundarios (antibióticos, antihelmínticos, antifúngicos, etc.) En medios de cultivos líquidos, ya sean mínimos o ricos, S coelicolor muestra una curva de crecimiento de tipo bifásica con cuatro fases claramente diferenciables; una primera fase de crecimiento logarítmico (CR1), luego una fase de transición (T) que antecede a una segunda fase de crecimiento logarítmico (CR2)….Ítem Acceso Abierto Chaperones moleculares : su rol en el proceso de plegamiento y ensamble intracelular de proteínas(Universidad Nacional de Rosario. Facultad de Ciencias Bioquímicas y Farmacéuticas, 1999-04-08) Checa, Susana Karina; Viale, Alejandro M.El plegamiento de las proteínas a su conformación nativa constituye una de las bases para el correcto funcionamiento celular. La eficiencia del proceso es asegurada in vivo gracias a la participación entre otros, de sistemas especializados de proteínas denominados chaperones moleculares. Estos asistentes de plegado interaccionan no covalentemente con polipéptidos total o parcialmente desplegados favoreciendo el plegado productivo por sobre las reacciones no productivas que conducen a la agregación en condiciones fisiológicas y de estrés. Numerosas evidencias experimentales indican que distintos chaperones pueden cooperar en las células. Se ha propuesto que los sistemas de chaperones Hsp70/DnaK y Hsp60/GroE actúan secuencialmente asistiendo el plegamiento de proteínas recién sintetizadas o desnaturalizadas y el importe de éstas a organelas. Sin embargo, la transferencia secuencial parece no ocurrir en todos los casos y por ello se ha propuesto la existencia de redes flexibles y funcionales …Ítem Acceso Abierto Dinámica de la micota celulolítica y queratinolótica de suelos agrícolas con el agregado de fertilizantes y residuos de cosecha(Universidad Nacional de Rosario. Facultad de Ciencias Bioquímicas y Farmacéuticas., 1999-10-04) Luque, Alicia Graciela; Álvarez, Delia P.Los hongos cumplen un importante rol en ecosistemas terrestres, ya que su intervención en el ciclado de nutrientes y energía es de notable magnitud. Estos microorganismos participan activamente en la descomposición de restos vegetales y animales, hecho que favorece la nutrición vegetal porque se solubilizan muchas sustancia que la planta puede aprovechar directamente. De allí la importancia de los diversos grupos funcionales fúngicos en la fertilidad del suelo, entre ellos se destacan los hongos celulolíticos y queratinolíticos, activos en la degradación de compuestos carbonados y nitrogenados. Es de interés conocer las modificaciones que se producen sobre estos grupos funcionales fúngicos y su actividad biológica, antes diversas prácticas de manejo de suelos empleados en agricultura, como el agregado de fertilizantes, las rotaciones de cultivo, los sistemas de labranzas y el manejo de los residuos de cosecha, con el fin de aplicar los datos obtenidos en programas de conservación de suelos agrícolas. Se emplearon dos ensayos: 1. Para estudiar el efecto de la aplicación de fertilizantes en un sistema de labranza convencional, sobre los hongos celulolíticos y queratinolíticos del suelo. 2. Par estudiar el efecto de los sistemas de labranza en la incorporación de los residuos de cosecha y las poblaciones fúngicas celulolíticas asociadfas a los mismos, como así también los hongos celulolíticos y queratinolítcos del suelo.Ítem Acceso Abierto Participación de residuos aromáticos en la estructura y función de flavoproteínas(Universidad Nacional de Rosario. Facultad de Ciencias Bioquímicas y Farmacéuticas., 2000) Arakaki, Adrián Kimei; Ceccarelli, Eduardo AugustoLa ferredoxina-NADP+ reductasa presente en organismos fotosintéticos (FNR plastídica) es una flavoproteína de 35 kDa que cataliza el transporte reversible de electrones entre NADP(H) y ferredoxina o flavodoxina. La FNR plastídica es el prototipo de una superfamilia estructural que incluye proteínas de funciones diversas. Su estructura terciaria consta de un dominio amino terminal para la unión de una molécula del grupo prostético FAD y un dominio carboxilo terminal para la unión del sustrato NADP+. En todas las secuencias conocidas de FNR plastídicas se encuentran dos residuos tirosina estrictamente conservados que resultan homólogos a los residuos en posición 89 y 308 en la FNR de hojas de arveja, éste último ubicado en el extremo carboxilo terminal de la proteína. Las estructuras cristalográficas de la enzima muestran que estas tirosinas se ubican a ambos lados de la flavina del FAD. Hasta el presente no existía información directa acerca de la geometría de unión de la parte nicotinamida del sustrato NADP+ a la enzima. En este trabajo de Tesis se empleó a la FNR de hojas de arveja como modelo para estudiar la importancia evolutiva, funcional y estructural de los residuos aromáticos conservados en el entorno de la flavina de las flavoproteínas pertenecientes a la superfamilia estructural ferredoxina-NADP+ reductasa. Se estudió la evolución de la ferredoxina-NADP+ reductasa mediante técnicas de Filogenia Molecular. Con este fin se construyeron árboles filogenéticos basados en las secuencias de aminoácidos de todas las enzimas plastídicas (FNR) y proteobacterianas (FPR) disponibles en las bases de datos. El análisis evolutivo de las FPRs permitió validar una clasificación de la flavoproteína en tres subtipos: subtipo E. coli, subtipo A. vinelandii y subtipo A. actinomycetemcomitans. Los subtipos propuestos se distinguen por particularidades en la secuencia del extremo carboxilo terminal, que incluye al residuo homólogo a la tirosina 308 de FNR de arveja. La caracterización de mutantes de FNR fusionadas a GST permitió estudiar el papel desempeñado por el residuo tirosina 89 en la estructura y función de FNR de arveja. Se demostró que la aromaticidad de la cadena lateral de la tirosina 89 resulta importante para la fijación del grupo prostético, con una contribución menor del puente de hidrógeno que forma el grupo hidroxilo del residuo con el ribitilo del FAD. Esta última interacción sería indispensable para definir una conformación adecuada que permita el acercamiento de la cadena lateral de la lisina 110 al puente pirofosfato del NADP+, ya que la sustitución de la tirosina 89 por fenilalanina disminuyó dramáticamente la afinidad por este sustrato. La aromaticidad del residuo en posición 89 no es el único requerimiento para mantener una geometría compatible con la transferencia de hidruro, ya que la sustitución del mismo por triptofano afectó profundamente la capacidad catalítica de la enzima. Se dilucidó el modo de unión productivo del sustrato NADP+ a FNR, mediante el estudio cristalográfico de los mutantes FNR Y308S y FNR Y308W de la enzima de arveja en complejos con NADP(H). La sustitución del residuo tirosina en posición 308 produjo un aumento de la estabilidad de la interacción de la nicotinamida en el sitio activo, no afectó la geometría de unión del NADP(H) y mantuvo la efectividad de la catálisis. Se demostró la existencia de un determinante adicional que contribuye a la capacidad de discriminación entre los sustratos NADP(H) y NAD(H) por parte de FNR. El sitio de unión para el 2'-fosfato del piridín nucleótido realiza el reconocimiento específico y establece fuertes interacciones con el grupo diferencial. El determinante adicional está constituido por la tirosina 308, cuya cadena lateral compite por la misma ubicación en el sitio activo con la nicotinamida, grupo que es común a NADP(H) y NAD(H). En FNR silvestre ambos determinantes contribuyen para alcanzar una preferencia NADPH/NADH de 37100. La anulación del determinante adicional en la mutante FNR Y308S ocasiona una disminución de 500 veces en la preferencia de la enzima por NADPH. El estudio ab initio de un sistema que modeló las interacciones entre la isoaloxazina y las cadenas laterales de las tirosinas 89 y 308 de FNR de arveja, permitió concluir que el ángulo diedro isoaloxazina-fenol en la geometría de mínima energía estaría determinado principalmente por la separación interplanar entre las dos moléculas. Se propone que el grupo de residuos cisteína 266, glicina 267 y leucina 268 impondría una cota a la separación interplanar entre la flavina y la cadena lateral de la tirosina 308, disminuyendo la estabilidad de la interacción entre ambas moléculas.Ítem Acceso Abierto Alteraciones de isoenzimas de citocromo P450 durante la regeneración hepatica : participación de putrescina(Universidad Nacional de Rosario. Facultad de Ciencias Bioquímicas y Farmacéuticas, 2000-06-30) Favre, Cristian; Carrillo, María CristinaEl hígado es un órgano con una notable capacidad de regeneración que se manifiesta ante cualquier agresión sea ésta de origen tóxico, infeccioso o quirúrgico. La hepatectomía parcial en roedores es un incuestionable modelo para abordar el estudio del proceso regenerativo del hígado. La regeneración comienza con una serie de eventos que conducen al hepatocito a ingresar en la fase G1 del ciclo celular. Estos cambios iniciales incluyen la activación temprana de una serie de genes como c-myc, c-fos, c-jun y el gen odc. Los productos de estos genes son requeridos para la progresión del ciclo celular. odc codifica la enzima ornitina decarboxilasa, la primera de las enzimas de la vía sintética de las poliaminas y la limitante de esta ruta. Las poliaminas aumentan sus niveles durante cualquier proceso proliferativo en cualquier tipo de tejido. Poseen afinidad por moléculas nucleofílicas y posibilitan que aumente la velocidad de síntesis de ácidos nucleicos y proteínas. (...)Ítem Acceso Abierto Incidencia de la relación estructura-función del sistema de grupo sanguíneo MN y del receptor cd44 en la adhesión eritrocitaria(Universidad Nacional de Rosario. Facultad de Ciencias Bioquímicas y Farmacéuticas., 2000-08-28) D'Arrigo, Mabel; Valverde, Juana Rosa; Rasia, Rodolfo M.El objetivo general de la presente tesis es estudiar las alteraciones de propiedades superficiales eritrocitarias y su incidencia en la agregación y la adhesión. Este objetivo fue desarrollado en 4 etapas: 1. Comparar las variaciones de la CESE inducidas por diversos mecanismos, utilizando como herramienta el reparto en sistema acuoso bifásico Dx/PEG. Se trabajó con GR sin tratar y GR con variaciones de la CESE por distintos mecanismos: a)-tratados con distintas enzimas proteolíticas; b)-tripsinados a distintos tiempos; c)-tratados con anticuerpos; d)-sometidos a conservación en condiciones standard de Banco de Sangre y e)- GR de distintas especies. A través del P se pudo poner en evidencia variaciones significativas entre GR tratados y no tratados. De esta manera resulta el P una herramienta útil para el estudio comparativo de las variaciones de la CESE. 2. Estudiar por visualización microscópica directa, la morfología de los agregados de GR. Se estudió la morfología de los agregados de GR sin tratar; tratados (tripsinados a distintos tiempos y glicosilados) y de pacientes diabéticos e hipertensos. Por medio del ASP se mostraron diferencias significativas de la morfología de los agregados de GR sin tratar y tratados. Se observaron diferencias significativas de la morfología de GR normales y de diabéticos e hipertensos. El ASP da una estimación cuantitativa de la morfología de los agregados eritrocitarios y de las desviaciones de la misma. 3. Estudiar la adhesión bajo condiciones estáticas utilizando como modelo el sistema receptor de hialuronato(CD44) –hialuronato observando macroscópicamente, el fenómeno por adhesión (aglutinación) eritrocitaria. Se investigó el receptor de hialuronato en la membrana de GR de adulto, de cordón umbilical y de diabéticos. Se observó una diferencia estadísticamente significativa en la adhesión de GR de adulto y de cordón y también de diabéticos y de adultos normales. Se determinó el receptor de hialuronato(CD44) soluble en suero por inhibición de la adhesión(aglutinación). Se trabajó con suero de dadores normales y de recién nacidos. La sensibilidad de esta técnica no permitió demostrar la presencia de receptores de hialuronato solubles en el suero de neonatos, a diferencia de lo que ocurre en el adulto donde se observó poder inhibitorio. 4. En la última etapa de esta tesis se alcanzó el objetivo propuesto, desarrollar una técnica por análisis de imágenes digitalizadas en cámara de flujo para estimar la energía de adhesión del receptor de hialuronato y su ligando. De acuerdo a las energías calculadas el método es aceptable y puede ser aplicado en otros tipos de interacción celular.Ítem Acceso Abierto Estudio de la adherencia, colonización y diseminación de levaduras del género Candida(Universidad Nacional de Rosario. Facultad de Ciencias Bioquímicas y Farmacéuticas., 2000-10-06) Biasoli, Marisa Susana; Magaró, HortensiaEn los últimos años se produjo un aumento significativo en la frecuencia de las candidiasis sistémicas, siendo muchas de estas micosis de origen endógeno, a partir de levaduras que colonizan el tracto gastrointestinal del hombre. La adherencia de Candida a la superficie de las células del huésped sería esencial para iniciar el proceso que lleva a la colonización. Se estudiaron las modificaciones que ejercen diferentes factores sobre la capacidad de las levaduras aisladas en el tracto gastrointestinal humano (TGH) como también la importancia que el proceso de adherencia de estos microorganismos tiene en la colonización y diseminación de las levaduras en el huésped. Se aislaron e identificaron 23 cepas de levaduras provenientes del TGH, a partir de muestras de heces obtenidas de pacientes que concurrieron al Laboratorio de Análisis Clínicos del CEREMIC. El mayor porcentaje de aislamientos correspondió a C. albicans (52,1 por ciento), seguida por C. glabrata (8,7 por ciento), C. krusei (8,7 por ciento), C. parapsilosis (8,7 por ciento) y C. tropicalis (8,7 por ciento) y C. colliculosa, C. kefyr y C. lusitaniae (4,36 por ciento cada uno).Ítem Acceso Abierto Reacción acrosómica y glicosidasas acrosomales en espermatozoides de Bufo arenarum(2001) Martínez, María Laura; Cabada, Marcelo O.La reacción acrosómica es un requisito para que ocurra la fecundación. En anfibios este proceso es poco conocido debido a que la alta fragilidad del espermatozoide en numerosas especies dificulta el análisis. Sin embargo, en Bufo arenarum esta gameta posee una alta resistencia que permite utilizarlo como modelo de estudio. En este trabajo de tesis se describen: A) Métodos para la evaluación de la ruptura acrosomal en espermatozoides de Bufo arenarum. B) Estudio de las glicosidasas asociadas al espermatozoide. C) Caracterización de la NAcGlcasa en relación al proceso de fecundación. A. Evaluación de la ruptura acrosomal en espermatozoides de Bufo arenarum. En Bufo arenarum el acrosoma es más pequeño que en la mayoría de las especies informadas y la única forma de visualizarlo era mediante técnicas de microscopía electrónica. Este método es dificultoso, costoso y no puede utilizarse para el análisis de un gran número de espermatozoides. En este trabajo se han presentado diferentes métodos para evaluar el estado acrosomal en esta especie. Sólo mediante la tinción con Coomassie se ha podido detectar por microscopía óptica el perforatorium en algunos espermatozoides reaccionados. El uso de la lectina de Arachis hypogaea (PNA) marcada fluorescentemente permitió diferenciar “espermatozoides intactos” de los que habían sufrido la reacción acrosómica. Sin embargo, cuando se trabaja con sapos recolectados en verano, los patrones de tinción con la lectina no son tan claramente distinguibles. El método de la inmunocitoquímica es el de elección para detectar la reacción acrosómica. La técnica es sencilla y sensible. Tiene la ventaja que puede usarse en presencia de los componentes de la matriz extracelular de los ovocitos para estudiar los roles de éstos en la fecundación y fundamentalmente sus efectos en el espermatozoide. Por otro lado, mediante la utilización de la técnica de inmunofluorescencia se han establecido las mejores condiciones para la inducción de la reacción acrosómica. La incubación durante 20 minutos en un medio hipotónico induce la ruptura en el 70% de los espermatozoides. Sin embargo, cuando el ionóforo 20µM durante 45 minutos sería el tratamiento de elección ya que es más eficiente y los resultas son más reproducibles. B. Glicosidasas asociadas al espermatozoide. Actividades NAcGlcasa, N-AcetilGalactosaminidasa, β-Galactosidasa, β-Glucosidasa, α-Manosidasa, α-Glucosidas y α-Fucosidasa fueron detectadas en el espermatozoide de Bufo arenarum, siendo la NAcGlcasa la mayor de las actividades medidas. Todas estas glicosidasas pertenecen a entidades proteicas diferentes a excepción de las actividades de NAcGlcasa y N-Acetilgalactosaminidasa que parecen estar relacionadas a la misma proteína. Los estudios de la distribución subcelular de las distintas glicosidasas revelaron que la mayor actividad detectada para cada una de ellas está en la fracción de MA. Sin embargo, en el espermatozoide reaccionado se encontró el 10% de la actividad total de NAcGlcasa. Por otro lado, en la fracción que corresponde a las vesículas acrosomales se detectó actividad α-manosidasa. Mediante experimentos in vitro, se vio que NAcGlcasa es la única de las seis glicosidasas anteriormente mencionadas que interacciona con la EV de los ovocitos de la misma especie en condiciones que simulan el medio de fecundación. C. Caracterización de la enzima NAcGlcasa Estudios en otras especies de Anfibios anuros revelaron que los restos NAcGlc del ovocito podrían estar implicados en la interacción con el espermatozoide. La NAcGlcasaes la mayor actividad glicosidasa detectada en espermatozoides de Bufo arenarum. Además, la enzima se une in vitro a la EV sugiriendo algún rol en el proceso de fecundación. Debido a estas consideraciones se comenzó con el estudio de la glicosidasa. La enzima fue parcialmente purificada a partir de espermatozoides mediante cromatografías de interacción hidrofóbica y de afinidad en una matriz de ConA. La fuerte unión de la NAcGlcasa a estas matrices permiten sugerir que la enzima posee dominios hidrofóbicos y restos manosa en su composición. La muestra parcialmente purificada fue utilizada para analizar diferentes propiedades cinéticas y bioquímicas. El pH óptimo es 3,6 y la actividad se inhibe total y reversiblemente a pHs superiores a 8,0. Cuando se estudió el efecto de la temperatura, se vio que la actividad aumenta hasta alcanzar un máximo a 55ºC. Además, la enzima posee la ventaja de ser estable a 4ºC durante varios días, este hecho facilitó la manipulación. Las propiedades cinéticas descriptas muestran que la Vmax aparente es 3,18 ± 0,10 (U/mg) y la Km para el p-nitrofenil NAcGlc es 0,25 mM ± 0,04. Los azúcares NAcGlc y NAcGal son potentes inhibidores de tipo competitivo, siendo la Ki para NAcGal 1,5 mM. Los análisis de los requerimientos catiónicos mostraron que el aumento de la concentración tanto de Ca2+como de Mg2+ en el medio de reacción resultó en un igual aumento de la actividad. La purificación de la enzima a homogeneidad se realizó a partir de un hígado de machos de Bufo arenarum debido a que se disponía de cantidades limitantes de la enzima de origen espermático. Las enzimas de ambas fuentes poseen propiedades bioquímicas y cinéticas comparables. Las enzimas de ambas fuentes poseen propiedades bioquímicas y cinéticas comparables. El protocolo de purificación requiere únicamente de dos pasos. Luego de realizar una corrida electroforética en condiciones nativas, se cortó la banda en donde se detectó la actividad y finalmente la enzima fue purificada mediante una cromatografía de afinidad con una matriz ConA. El análisis electroforético en condiciones reductoras de la enzima purificada reveló que posee un masa molecular aparente de 45 kDa. Esta misma banda es detectada en las muestras de homogenado de hígado y de espermatozoides en análisis por Inmunodetección usando los anticuerpos anti- NAcGlcasa. Más aún, los análisis mediante exclusión molecular en HPLC muestran un pico de actividad a 45 kDa y otro a 190-200 kDa sugiriendo que la enzima pueda ser un tetrámetro constituido por subunidades de 45 kDa. La reacción acrosómica permite la liberación de las enzimas acrosomales y expone la membrana interna acrosomal. La NAcGlcasa de Bufo arenarum es la mayor actividad medida en el contenido acrosomal pero también se detectó actividad de esta glicosidasa asociada al espermatozoide reaccionado. Se ha analizado la participación de la NAcGlcasa en la fecundación mediante experimentos in vitro. La inhibición de la enzima por la adición de anticuerpos anti- NAcGlcasa reduce el porcentaje de ovocitos fecundados en comparación con los controles. Para corroborar que este bloqueo no es simplemente estérico, se agregaron al medio de fecundación NAcGlc o NAcGal, que tienen un efecto inhibitorio de la actividad enzimática, y en estos casos también se observó una fuerte inhibición de la fecundación. Finalmente, el tratamiento de los ovocitos con la enzima purificada provocó prácticamente una inhibición completa de la fecundación. En resumen, la enzima NAcGlcasa es la glicosidasa con mayor actividad detectada en el espermatozoide de Bufo arenarum. A pesar que el rol preciso de la enzima no se conoce, se detectó que interacciona con la EV. Dado que la inhibición de la enzima implica una inhibición de la fecundación se sugiere que la NAcGlcasa juega un papel importante en la fecundación de Anfibios.Ítem Acceso Abierto Regulación de la síntesis de lípidos en Bacillus subtilis durante la adaptación a bajas temperaturas de crecimiento(Universidad Nacional de Rosario. Facultad de Ciencias Bioquímicas y Farmacéuticas., 2001) Aguilar, Pablo; De Mendoza, DiegoEn este trabajo de Tesis se ha identificado y caracterizado un conjunto de genes que pertenece a un circuito regulatorio involucrado en la percepción y respuesta al frío en la bacteria Gram positiva B. subtilis. Para comenzar a elucidar las bases moleculares de la percepción de la temperatura en bacterias se identificó el gen que codifica para la actividad desaturasa frío inducible de B. subtilis. El estudio de este gen, denominado des, reveló que es monocistrónico y que B. subtilis posee una única actividad desaturasa, del tipo A5 acil lípido desaturasa. Se determinó que la expresión de des se encuentra estrictamente regulada por la temperatura de crecimiento. A 37ºC su transcripción se encuentra reprimida mientras que al descender la temperatura ambiente se induce su transcripción de manera transitoria. A diferencia de la mayoría de los genes descriptos como frío-inducibles en bacterias, el gen des no es regulado a través de la estabilidad de su ARNm. La regulación del gen des por temperatura es de carácter exclusivamente transcripcional. En la búsqueda de genes involucrados en la regulación del gen des, se identificó un operón, denominado desKR, cuyo dos genes, desKR y desR, resultaron ser esenciales para la inducción por frío del gen des. Este operón codifica para proteínas con homología a las de los sistemas reguladores de dos componentes. DesR, es una proteína soluble que se une específicamente al promotor del gen des. Desk presenta homología con histidin quinasas de membrana y la evidencia experimental recogida permite postular que presenta actividades fosfatasa y quinasa sobre DesR en función de la temperatura ambiente. Finalmente, se determinó que los AGIs constituyen una señal negativa en la inducción por frío del gen des. Por lo tanto un circuito regulatorio formado por las proteínas DesK y DesR y los AGIs constituye un nuevo mecanismo de control de la expresión génica a bajas temperaturas.Ítem Acceso Abierto Programa de acreditación de servicios de farmacias hospitalarias(Universidad Nacional de Rosario. Facultad de Ciencias Bioquímicas y Farmacéuticas, 2001-04-23) Traverso, María Luz; Nadalin, María Elsa; Matínez, María NelidaCalidad en el cuidado de la salud ha sido definida como "el grado en que los servicios de salud brindados al paciente incrementan la probabilidad de obtener los resultados deseados y reducen la probabilidad de resultados no deseados, dentro de un nivel de conocimiento dado. Siendo determinada por muchos comp0onentes, entre ellos accesibilidad, adecuación, continuidad, eficacia, efectividad, eficiencia, perspectivas del paciente, inocuidad y oportunidad de la asistencia". La Acreditación de Establecimientos Asistenciales es de amplia aplicación en los países que cuentan con un Sistema de Salud organizado, ya que permite evaluar los servicios de salud, promover un incremento en la calidad de la atención médica y la planificación en salud. En lo referente al Servicio de Farmacia Institucional, en nuestro país la evaluación propuesta hasta el momento es muy limitada, no siendo consideradas las múltiples actividades que se desarrollan, no permitiendo así un análisis completo del servicio; ni tampoco se han desarrollado medidas que sean comparables y válidas para poder evaluar la calidad del servicio prestado…Ítem Acceso Abierto Estudios preliminares de la oxidación crómica de D-glucitol(Universidad Nacional de Rosario. Facultad de Ciencias Bioquímicas y Farmacéuticas., 2002-03-08) Calisto, Nancy Cristina; Sala, Luis FedericoEl Cr(VI) oxida selectivamente al grupo hidroxilo primario del D-glucitol, para dar como producto de la reacción D-glucono-1,5-lactona. La reacción sigue los siguientes pasos de reducción Cr(VI)-Cr(V)-Cr(III), siendo el paso Cr(VI)-Cr(V) el determinante de la velocidad de reacción. Se propuso el mismo mecanismo para la oxidación de D-Manitol, la configuración del C(2) afecta levemente la velocidad de la reacción redox, hecho que se puede observar a partir de los valores similares de las constantes de velocidad. La reacción redox del D-glucitol con Cr(VI) requiere la presencia de protones en el medio: cuando la acidez es baja la reacción redox se produce muy lentamente. El D-glucitol es oxidado por el Cr(VI) más rápidamente que el respectivo metil-glicósido (metil-D-glucopiranosa) en el cual el grupo hidroxilo primario también es oxidado a carboxilato. Esta mayor reactividad en el aditol está relacionada con la habilidad de este para formar complejos quelatos de Cr(VI) de cinco miembros involucrados al grupo hidroxilo primario, lo cual no es posible en el metil-glicósido debido a que el grupo hidroxilo inmediato al grupo hidroxilo primario se encuentra formando parte del enlace acetálico. Cuando se emplea un exceso de agente reductor respecto al agente oxidante los grupos hidroxilos secundarios son inertes a la oxidación como ocurre en el caso de los azúcares y sus derivados. El D-glucitol estabiliza al Cr(V) dando complejos penta y hexacoodinados oxo-Cr(V), dependiendo de la concentración de protones. A [H+]>0,1 M se forman monoquelatos hexacoordinados oxo-Cr(V) cargados positivamente, los cuales serian los responsables de las altas velocidades de transferencia electrónica observadas en el rango de [H+]=0,1 - 0,75 M. A pH>1, se forman solamente las especies pentacoordinadas, siendo las reacciones redox intramoleculares muy lentas y los complejos de Cr(V) permaneces en solcón varios días o semanas. Los parámetros RPE justamente con el patrón shf indican que los complejos penta coordinados oxo-Cr(V) formados en exceso de D-glucitol involucran el enlace del metal a cuatro grupos alcoholatos secundarios pertenecientes a dos moléculas de D-glucitol. Además los complejos más estables oxo-Cr(V) no involucran al Cr(V) coordinado al grupo hidroxilo primarios, hecho similar al observado para azúcares y sus derivados.Ítem Acceso Abierto Genética molecular de beta talasémicos heterocigotas : interrelación con parámetros hematológicos(Universidad Nacional de Rosario. Facultad de Ciencias Bioquímicas y Farmacéuticas, 2002-05-16) Bragós, Irma Margarita; Milani, Ángela CristinaLas talasemias son un grupo heterogéneo de anemias hereditarias, tanto desde el punto de vista molecular como clínico y hematológico, caracterizadas por la disminución o total ausencia de síntesis de una o varias cadenas de globina. La cadena sintetizada en menor cuantía es, por lo demás rigurosamente normal en su composición y estructura. Se trata, por tanto, de desórdenes cuantitativos, en oposición a las alteraciones cualitativas denominadas hemoglobinopatías. La mayoría de los defectos génicos responsables de las -talasemias son la mutación de un único nucleótido que afecta a uno de los diferentes procesos moleculares involucrados en la expresión del gen globina: transcripción, procesamiento del pre-ácido ribonucleico mensajero (pre-RNAm) y traducción. La intensa actividad desarrollada en la década de los 80 y el gran avance de las técnicas de Biología Molecular para establecer las bases moleculares de las talasemias, han demostrado que las lesiones genéticas no pueden ser detectadas con los métodos analíticos convencionales. Las -talasemias son una de las alteraciones hereditarias más frecuentes y se encuentran distribuidas por todo el mundo. La alta frecuencia de los genes talasémicos se debe probablemente a la protección frente a la malaria que proporciona el estado heterocigota. En Argentina los estudios epidemiológicos, aunque escasos y fragmentarios, han evidenciado la presencia de las -talasemias con cierta heterogeneidad fenotípica. Debido a todo esto, se diseñó el presente estudio para optar al grado de Doctora en Bioquímica, y se marcaron los siguientes objetivos: 1- Determinar la heterogeneidad molecular de la -talasemia que nos permita dar el adecuado asesoramiento genético y establecer el consiguiente diagnóstico prenatal. 2- Interrelacionar el fenotipo de la mutación responsable de la -talasemia (+ ó 0) con parámetros hematológicos. 3- Tratar de establecer la causa de las diferencias fenotípicas observadas en portadores talasémicos que presentan la misma mutación. Con el objetivo de obtener nuestros valores normales se realizó el estudio de un grupo control constituido por 150 individuos normales (59 varones, 70 mujeres y 21 niños), considerados normales al tener los valores hematimétricos dentro de los rangos normales, morfología de serie roja normal y no presentar ninguna alteración en el estudio de hemoglobinas por electroforesis. Desde 1996 hasta fines de 2000, se han estudiado 124 individuos talasémicos mayores de un año, no relacionadas entre sí, originarios de Rosario y su zona de influencia. En unos casos se trató de sujetos asintomáticos o con leves manifestaciones clínicas que acudieron a nuestro Servicio (Servicio de Hematología- Sala 9- Hospital Provincial del Centenario) por haber presentado microcitosis en un análisis de sangre rutinario coincidiendo con un ingreso quirúrgico, proceso infeccioso banal o chequeo de salud, y otros eran pacientes diagnosticados como portadores de talasemia con anterioridad. Durante la realización de este trabajo de tesis fue derivado a nuestro Servicio un paciente de 15 meses (hijo de un matrimonio de portadores incluidos en este estudio) por presentar un cuadro de anemia severa con requerimiento transfusional. A las muestras mencionadas anteriormente se les practicaron las siguientes determinaciones: 1. Estudio hematimétrico: Cuantificación de hematíes, hemoglobina y hematocrito. Determinación de los parámetros VCM, HCM, CHCM Observación de la morfología eritrocitaria Recuento de reticulocitos 2. Metabolismo férrico: Dosaje de hierro y capacidad de saturación de la siderofilina Determinación de ferritina sérica 3. Estudio de hemoglobinas Electroforesis de hemoglobinas en acetato de celulosa a pH 9,0 Electroforesis de hemoglobinas en Agar-citrato a pH 6,1 Cuantificación de hemoglobina Fetal Test de cuerpos de inclusión Test de inestabilidad térmica Test de anaerobiosis 4. Estudios moleculares Identificación de la mutación responsable de -talasemia Presencia de la deleción -3,7 Presencia de la triplicación de genes alfa (anti 3,7) en aquellos individuos en los que el dosaje de Hb estuvo por debajo de 11 g/dl (varones y mujeres 50 años) y por debajo de 10,5 g/dl (mujeres 50 años y niños), estudiándose entonces 48 individuos (7 varones, 2 mujeres 50 años, 30 mujeres 50 años y 9 niños). Para la identificación molecular de la mutación responsable de -talasemia se empleó la técnica de PCR-ARMS y para detectar la presencia de la alfa deleción y de la alfa triplicación se empleó PCR- alelo específica. Un individuo presentó la deleción -3,7, dos presentaron triplicación de genes alfa ( anti3,7), dos fueron portadores de una talasemia y uno mostró una doble heterocigosis tal/HbS. Estos seis individuos fueron por lo tanto excluidos del grupo en el que se estudió la interrrelación de los parámetros hematológicos con el genotipo -talasémico y en ellos se analizaron las diferencias fenotípicas al compararlos con portadores -talasémicos que presentaron la misma mutación. Se identificaron entonces, 118 sujetos no emparentados, portadores de talasemia heterocigota, con metabolismo de hierro normal y sin asociación a ninguna otra de las patologías de la hemoglobina estudiadas. Los dos individuos portadores de talasemia fueron excluidos del grupo en el que se analizó la heterogeneidad molecular de la talasemia ya que estas talasemias presentan, en su gran mayoría, deleciones y no mutaciones puntuales que fue lo investigado en este trabajo, quedando por lo tanto constituido este grupo por 122 individuos. La experiencia en el Mediterráneo ha mostrado que los programas preventivos de talasemia basados en la detección de portadores heterocigotas y el consejo genético no son efectivos para reducir la incidencia de nacimientos de niños con -talasemia mayor. El diagnóstico prenatal de la -talasemia ha dado una nueva dimensión a la prevención de la misma, pero para poder llevarlo a cabo, lo más importante es tener conocimiento de las mutaciones y su incidencia. Este estudio intenta ofrecer un cuadro general de la genética molecular de la talasemia en nuestra área. El 92,6 % de los alelos se identificaron con las 6 mutaciones diferentes estudiadas, superponible a los datos encontrados en otros países de la cuenca Mediterránea como Italia, donde el 88% se distribuye entre CD39 (40,1%), IVS-I-ntl10 (23,0%), IVS-I nt l (10,2%), IVS-I-nt 6 (9,9%) y IVS-II-nt 745 (5,0%), superponible también a lo publicado por Brasil en el estado de San Pablo donde la mayoría de los portadores de -talasemia son descendientes de italianos y con cuatro mutaciones, CD39 (45 %), IVS-I-ntl10 (14 %), IVS-I-nt6 (5 %) y IVS-I-nt 1 (4 %) identificaron el 97,1 % de los cromosomas talasémicos. En España, Villegas y col, lograron identificar el 86,6 % de los alelos investigando cinco mutaciones IVS I-1, IVS I-6, IVS I-110, CD39 y CD8/9 (+G). En nuestro estudio, la mutación más frecuente se correspondió con el CD39, la cual fue identificada en el 57,4 % de los alelos. Esta también resultó ser la mutación más frecuente en Italia, España, Francia y Portugal. La segunda mutación en importancia correspondió a la IVS I-110 que representó el 22,1 % del total identificado siendo ésta la segunda en importancia también en Italia y Francia (23,2 y 25,7 % respectivamente), no así en España y Portugal donde la IVS I-6 (15,5 %) y la IVS I-1 (32,9 %) ocuparon el segundo lugar respectivamente. Cabe destacar que la frecuencia de la mutación IVS I-6 que representa el 10,3 % en Italia y el 15,5 % en España, en este estudio fue hallada sólo en el 2,5 % de los casos. El resto de mutaciones encontradas, IVS I-1 (4,9 %), IVS II-1 (1,6%) e IVS II-745 (4,1 %), representó el 10,6 %. Este estudio viene a confirmar que a pesar de la elevada heterogeneidad molecular de la -talasemia, un grupo de mutaciones, relativamente pequeño, es el responsable de la mayoría de los casos de -talasemia en nuestra área, y su incidencia, en general, superponible con las descritas en otros países de la cuenca Mediterránea, teniendo fundamentalmente en cuenta los datos publicados por Italia ya que el origen de nuestros pacientes fue 89,3% italianos, 9,8 % españoles y 0.9 % griego. Si comparamos nuestros datos con los publicados por nuestro país, vemos que Varela y col logró identificar en una población de Bs. As. de origen Mediterráneo, el 90 % (similar a nuestro porcentaje) de los alelos talasémicos estudiando cuatro mutaciones (CD39, IVS-I-nt l10, IVS-I-nt 6 y IVS-I-nt 1). Estos mismos autores cuando posteriormente estudiaron las mismas seis mutaciones que buscamos en nuestro trabajo lograron también identificar el 90 % de sus 109 portadores beta talasémicos. Si bien las mutaciones más frecuentes resultaron ser CD39 (39,45 %) e IVS-I-nt-l10 (23,85 %), el porcentaje de la primera fue distinto del nuestro probablemente debido a una mayor proporción de descendientes del norte de Italia presentes en nuestra población. La misma consideración puede hacerse con respecto a los valores de las mutaciones más predominantes publicados por Soria y col en una población de Córdoba. Nuestra mayor concordancia es con el trabajo publicado por Roldán y col. que en una población de Bs. As, encontraron que los cuatro defectos más comunes (CD 39, 47%; IVS-I nt 110, 22,4%; IVS-I nt 1, 9,4% y IVS-I nt 6, 5,9%) se detectaron en el 84,7% de los alelos talasémicos. Debido a que no fue posible poner de manifiesto la mutación en el 7,4 % de los casos y a la gran variedad de asociaciones -talasemia y hemoglobinopatías concluimos de la complejidad del estudio molecular en nuestros pacientes con -talasemia. Por ello los estudios de Biología Molecular son trascendentales para dar el adecuado consejo genético y establecer el diagnóstico prenatal. Entre los pacientes en los que no se pudo detectar la mutación responsable del fenotipo talasémico se hallaron cuatro hombres, cuatro mujeres y un niño. Todos eran de origen italiano, excepto uno, griego. Todos presentaron fenotipo hematológico dentro de lo esperado para pacientes portadores de talasemia. Los niveles de Hb A2 estuvieron por encima del 4% y los de Hb F por debajo del 5%. Los valores del metabolismo férrico y de ferritina sérica fueron normales. Cuando se estudiaron por PCR-ARMS las seis mutaciones anteriormente mencionadas, todos presentaron banda de amplificación con el oligonucleótido normal, no así con el mutado. Ningún paciente presentó asociación con alfa talasemia (deleción 3,7 kb) ni con triplicación de genes alfa (alfa alfa alfa anti 3,7 kb). En estos casos sería necesario investigar la presencia de mutaciones muy poco frecuentes en nuestro medio (menos del 2 %) o proceder a la secuenciación del gen beta. También tener en cuenta que hay estudios poblacionales que han mostrado que aproximadamente el 1% de los genes beta talasémicos en el mundo permanecen sin caracterizar a pesar de un exhaustivo análisis de los genes globina incluyendo las regiones flanqueantes. Se ha postulado que en estos casos la mutación puede ser hallada en el upstream LCR o en la región enhancer 700-1000 pb 3´del gen globina. Sin embargo, en varias familias, análisis de ligamiento, demostraron que el fenotipo -talasémico se segrega independientemente del cluster globina, implicando que la determinante genética puede actuar en trans. Para el estudio comparativo de los genotipos talasémicos 0 y + en hombres, mujeres 50 años y de 50 años y niños, se aplicó la técnica de Análisis de la Variancia a dos criterios de clasificación (Talasemia y grupo) para seis variables de interés, correspondiente a un diseño no balanceado dado que los tamaños de las muestras eran diferentes para las combinaciones de Talasemia y Grupo, mientras que para el estudio comparativo de las mutaciones de los genotipos talasémicos estudiados se utilizó la técnica Análisis de la Variancia a un criterio de clasificación para cinco variables de interés correspondiente a un diseño balanceado. De la aplicación de las comparaciones múltiples se concluye que los promedios de GR Hb, y Hto para hombres y mujeres mayores de 50 años son iguales y significativamente mayores que los promedios de los GR de las mujeres menores de 50 años y niños, los cuales no difieren, el promedio de VCM y HCM para niños es significativamente menor que para las mujeres menores de 50 años, siendo estos dos grupos los únicos que difieren entre sí. También se concluye que el promedio de Hb A2 para los niños es significativamente mayor que para las mujeres mayores de 50 años, siendo estos dos grupos los únicos que difieren entre sí. En lo que respecta a la Hb F no se encontraron diferencias estadísticamente significativas entre genotipos de talasemia ni entre grupos en estudio. No se encontraron diferencias estadísticamente significativas entre los promedios de cada una de las variables estudiadas para las seis mutaciones consideradas. Existen diferencias levemente significativas (p0,10) entre los valores promedios de HCM para las distintas mutaciones consideradas. Al aplicar comparaciones múltiples de Newman-Keuls para el 10% se concluye que el promedio de HCM para el genotipo + I-6 es marginalmente superior que para el genotipo + II-745, no existiendo diferencias significativas entre los restantes cuatro genotipos estudiados. Las diferencias fenotípicas en portadores talasémicos que presentan la misma mutación se observaron en: 1. Asociación con talasemia (deleción -3,7): el fenotipo hematimétrico en los pacientes que presentan rasgo beta talasémico asociado con alfa deleción heterocigota tiende a normalizarse. 2. Asociación con triplicación de genes alfa ( anti 3,7): el fenotipo hematimétrico de los pacientes que presentan rasgo beta talasémico asociado con alfa triplicación se desvía por debajo de los valores esperados para un portador de talasemia. 3. talasemia: en el caso del portador de talasemia en que se encontró la mutación 0 39 el fenotipo hematológico fue similar a los portadores talasémicos. El estudio convencional de hemoglobinas fue distinto al característico del portador talasémico. 4. Doble heterocigosis 0 39 / Hb S: en este caso se observaron diferencias tanto en el fenotipo hematológico cuanto en el estudio convencional de hemoglobinas. 5. Asociación con otra mutación para talasemia: en nuestro único caso, la doble heterocigosis para talasemia dio lugar a un paciente con anemia de Cooley.