Examinando por Autor "Villanueva, Silvina Stella Maris"
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Ítem Acceso Abierto Efecto beneficioso de GLP-2 sobre la expresión y actividad de transportadores ABC intestinales en la endotoxemia experiemntal(Universidad Nacional de Rosario. Facultad de Ciencias Bioquímicas y Farmacéuticas., 2018-03-26) Arana, Maite Rocío; Mottino, Aldo D.; Villanueva, Silvina Stella MarisLa función de los transportadores ABC se ve afectada en varias enfermedades intestinales en los seres humanos, en particular las que cursan con inflamación local o sistémica. En el modelo de inflamación inducido por la administración de LPS a ratas (5 mg/kg de peso corporal por vía i.p.), confirmamos que a las 24 h se produce una disminución en la expresión y actividad de los transportadores Mrp2 y P-gp intestinales. Observamos que LPS, por un lado, disminuyó los niveles de ARNm de ambos transportadores y por otro, produjo la internalización de los transportadores en vesículas endocíticas. Estas observaciones señalan que los cambios a nivel proteico de los transportadores resultan complejos y dependen de una regulación a nivel transcripcional y postranscripcional. Determinamos también que IL-1β media la regulación postraduccional observada para Mrp2. Sin embargo, IL-1β no media la regulación de P-gp, ni la regulación a nivel transcripcional de Mrp2. Recientemente, a GLP-2 le fue asignado un papel clínico como potencial agente terapéutico debido a su capacidad para proteger al intestino en varios modelos de daño intestinal. Nos propusimos entonces estudiar la capacidad de GLP-2 de contrarrestar los efectos del LPS sobre ambos transportadores. Utilizamos dos tipos de protocolos de tratamiento con GLP-2. Uno que evalúe la capacidad preventiva de la hormona, administrándola antes de la inducción de la endotoxemia (7 dosis de 125 μg/kg de peso corporal por vía s.c. separadas cada 12 h en un total de 72 h consecutivas). Y otro que evalúe la capacidad de GLP-2 de revertir los efectos inducidos por LPS una vez instalados (2 dosis de 125 μg/kg de peso corporal por vía s.c. comenzando 3 h después de la inyección con LPS). Los resultados muestran que las alteraciones en la expresión y actividad de los transportadores producidas por LPS pudieron ser prevenidos mediante el tratamiento con GLP-2, siendo estos cambios al menos en parte dependientes de una regulación transcripcional. GLP-2 per se indujo los niveles de Mrp2 intestinal tanto a nivel de proteína como de ARNm, mientras que no ocurrió lo mismo para P-gp. En cambio, el tratamiento de reversión con GLP-2 fue ineficiente en recuperar los niveles de Mrp2 y P-gp (proteína y ARNm). En el caso particular de Mrp2, GLP-2 administrado sólo tampoco pudo producir cambios en la expresión de proteínas o ARNm, en contraste con la inducción observada para el protocolo de prevención. Claramente, más de dos dosis de GLP-2 son necesarias para modular la expresión de Mrp2. La observación de que GLP-2 induce Mrp2 a nivel de ARNm sugiere la posibilidad de una regulación transcripcional. GLP-2 actuaría presuntamente mediante su receptor asociado a proteína G, el cual activa adenilato ciclasa. Confirmamos la mediación de AMPc in vivo y en células Caco-2. Estudiamos la posible vía de señalización por la cual GLP-2 induce transcripcionalmente a MRP2 en células Caco-2 tratadas con db-AMPc, un análogo permeable del AMPc. Observamos que db-AMPc activó PKA, que luego fue capaz de activar de forma directa o indirecta por forforilación a ATF-2 y c-JUN. Luego estos factores formaron heterodímeros y se unieron a la región regulatoria proximal (−789/−603) del promotor de MRP2 que contiene sitios putativos AP-1 y CRE. De esta manera db-AMPc aumentaría la transcripción de MRP2 resultando en un aumento de la expresión del transportador en la membrana apical y en un aumento de su actividad. En conclusión, la modulación de estos importantes transportadores de eflujo apicales puede representar un efecto beneficioso adicional de GLP-2 bajo condiciones de inflamación, que contribuyen a restaurar la barrera transcelular, limitando así la absorción de compuestos potencialmente tóxicos.Ítem Acceso Abierto Función de la barrera intestinal. Implicancia en la enfermedad celíaca(Revista de la Facultad de Ciencias Médicas. Universidad Nacional de Rosario.) Villanueva, Silvina Stella Maris; Perdomo, Virginia Gabriela; García, FabianaÍtem Acceso Abierto Regulación aguda de la localización y actividad de la proteína asociada a resistencia a multidrogas (MRP2) intestinal por nutrientes(2019) Tocchetti, Guillermo Nicolás; Mottino, Aldo D.; Villanueva, Silvina Stella MarisLa proteína asociada a resistencia a multidrogas 2 (MRP2) es una bomba de eflujo perteneciente a la superfamilia de transportadores ABC. En el intestino, se localiza en la membrana apical del enterocito y tiene un rol clave limitando la absorción de xenobióticos. La regulación aguda de su actividad a través de cambios en la localización subcelular nunca fue estudiada. En este trabajo hipotetizamos que ciertos nutrientes, una vez que alcanzan la luz intestinal, son capaces de incrementar la densidad de MRP2 en la membrana apical (y por ende su actividad protectora) a través de un mecanismo mediado por la hormona intestinotrófica GLP-2. En la primera parte del trabajo demostramos que la localización y la actividad de MRP2 en sacos intestinales de rata son regulables de forma aguda. Para eso utilizamos estradiol-17β-D-glucurónido y dibutiril-AMP cíclico, dos agentes conocidos por producir internalización e inserción de MRP2 en modelos hepáticos. En la segunda parte del trabajo utilizamos un novedoso modelo in vivo para demostrar que la administración intrayeyunal de ácido oleico es capaz de inducir una inserción de MRP2 en la membrana apical y aumentar su actividad de transporte. Además, mediante diferentes estrategias experimentales, demostramos que GLP-2 es un mediador de ambos efectos, disparando una señal que viaja a través de la pared intestinal y culmina con un aumento en la producción extracelular de adenosina mediada por CD73. En la última parte del trabajo y utilizando la línea celular intestinal Caco-2 demostramos que MRP2 de origen humano también es susceptible de regulación aguda y que el tratamiento agudo con adenosina puede producir inserción y aumento de actividad de MRP2 en este modelo, en un proceso probablemente mediado por el eje A2BAR/cAMP/PKA. En conjunto, estos hallazgos representan un mecanismo fisiológico novedoso orientado a protegernos contra la absorción de tóxicos en períodos absortivos.Ítem Embargo Regulación de la expresión de la proteína asociada a resistencia a multidrogas 2 (mrp2) intestinal y su función de barrera bioquímica en un modelo experimental de síndrome metabólico(2020) Zecchinati, Felipe; Villanueva, Silvina Stella Maris; García, FabianaLa proteína asociada a resistencia a multidrogas 2 (Mrp2) es una bomba de eflujo perteneciente a la superfamilia de transportadores ABC. En el intestino, se localiza en la membrana apical del enterocito y limita la absorción de contaminantes dietarios y otros xenobióticos potencialmente tóxicos, actuando de esta manera como un componente esencial de la barrera bioquímica intestinal. Asimismo, Mrp2 presenta gran relevancia clínica ya que limita la absorción y distribución de diversos fármacos administrados por vía oral y, en consecuencia, determina su seguridad y eficacia. El síndrome metabólico (SM) es una condición patológica caracterizada por dislipidemia, hiperinsulinemia, insulinorresistencia, estrés oxidativo (EO) e inflamación crónica. En este trabajo, asumimos como hipótesis general que factores fisiopatológicos sistémicos y/o locales (inflamación intestinal, EO, desbalance hormonal) que se desarrollan en el SM, regulan negativamente la expresión de Mrp2 intestinal a nivel transcripcional y/o postranscripcional. En efecto, en una primera etapa, demostramos que condiciones similares al SM inducidas por la administración de fructosa en el agua de bebida (10% P/V, durante 21 días) a ratas, disminuyen la expresión (proteína y ARNm) y actividad de Mrp2 intestinal, así como también de la enzima metabolizadora glutatión-S-transferasa (GST). Por otra parte, observamos que en estas condiciones, la función de barrera intestinal ejercida por Mrp2 evaluada in vivo usando la droga sustrato valsartán, fue igualmente disminuida. Demostramos también que la administración de fructosa generó simultáneamente EO e inflamación en el tejido intestinal, sugiriendo la participación de estos factores como posibles mediadores importantes de la afectación de Mrp2. En este orden de ideas, a continuación evaluamos el potencial efecto beneficioso del cotratamiento con geraniol y vitamina C, compuestos con propiedades antinflamatorias y antioxidantes, en la reversión de las alteraciones de Mrp2 inducidas por la administración de fructosa. Una vez establecidas las condiciones de SM, la coadministración de geraniol o vitamina C (14 días) fue capaz de revertir la disminución de la expresión de Mrp2, tanto a nivel de la proteína como del ARNm, en concordancia con la normalización de su actividad de transporte. Del mismo modo, el cotratamiento con geraniol o vitamina C normalizó el desbalance redox intestinal y la actividad de las enzimas antioxidantes, a la vez que ambos compuestos restablecieron los niveles elevados de IL-1β en el tejido intestinal. En conjunto, estos resultados contribuyen a confirmar que la inflamación local y el EO, generados en condiciones similares al SM, son mediadores claves de la regulación negativa de Mrp2 intestinal. Considerando estos resultados y teniendo en cuenta: 1) La relevancia del EO en la etiopatogenia del SM y en la fisiopatología de desórdenes gastrointestinales; y 2) La demostración previa de que el EO es un importante regulador de la expresión de Mrp2 en otras condiciones patológicas experimentales; planteamos como instancia final, evaluar el efecto directo del EO sobre Mrp2 intestinal. Es factible hipotetizar un mecanismo regulatorio postraduccional por EO, consistente de una internalización temprana y una degradación proteosomal subsiguiente de Mrp2, similar al descripto en hígado. Para su comprobación, inicialmente expusimos de forma aguda (30 min) sacos intestinales aislados a terc-butil hidroperóxido (TBH), un agente promotor de EO ampliamente aceptado. Primero confirmamos que TBH generó EO en el tejido intestinal, indicado por la alteración de los parámetros que lo estiman, entre ellos por una disminución del contenido de glutatión reducido (GSH) y de la relación GSH /glutatión oxidado (GSSG). En estas condiciones, observamos a su vez que la dosis de 250 μM de TBH produjo una redistribución de Mrp2 desde la membrana apical de ribete en cepillo (BBM) a membranas internas (MI), consistente con un proceso de internalización. En concordancia, su actividad de transporte disminuyó por el tratamiento con TBH, indicando que la internalización de Mrp2 tuvo un impacto funcional. El tratamiento subsecuente con N-acetil-cisteína (NAC), precursor de GSH, restableció los niveles intracelulares de este antioxidante endógeno y revirtió la alteración de la localización y función de barrera de Mrp2. A su vez, la incubación con Gö6976, inhibidor selectivo de isoformas de la proteína quinasa C de tipo clásica (cPKC), fue capaz de bloquear completamente la disminución de Mrp2 en BBM y su aumento en MI, así como el deterioro en su actividad de transporte, inducidos por TBH. A continuación, evaluamos el efecto de una exposición prolongada (24 horas) de EO sobre Mrp2 intestinal, incubando células Caco-2 de origen humano con 250 μM de TBH. Confirmada la inducción de EO, se observó una reducción concomitante de la expresión proteica total de MRP2. Interesantemente, esta reducción fue suprimida por el pretratamiento con el inhibidor proteosómico MG132. De este modo, demostramos por primera vez una regulación postraduccional de Mrp2 intestinal por EO, la que consistiría de dos procesos dependientes del tiempo: 1) Una rápida internalización de Mrp2 a MI por exposición aguda a EO, probablemente mediada por cPKC, que es reversiblemente regulada por el contenido intracelular de GSH y acompañada por el estado redox celular; 2) Si el estímulo prooxidante persiste en el tiempo, Mrp2 sufre un proceso de degradación proteosomal. En conjunto, ambos eventos conducirían finalmente a la disminución de la expresión proteica total de Mrp2 bajo condiciones de EO. En resumen, nuestros resultados demuestran que el EO y la inflamación intestinal, inducidos por una dieta rica en fructosa, regulan negativamente la expresión de Mrp2 intestinal. Esta regulación implicaría una combinación de mecanismos transcripcionales y postranscripcionales. Notablemente, el deterioro concomitante en la función de barrera de Mrp2 podría tener implicancia en la absorción y toxicidad de xenobióticos en condiciones de SM; con especial consecuencia en la eficacia y seguridad de los agentes terapéuticos administrados por vía oral. Al mismo tiempo, nuestro estudio tendría relevancia fisiopatológica al contribuir a la comprensión del mecanismo molecular que regula la expresión de Mrp2 intestinal en un gran número de condiciones patológicas donde coexisten EO y procesos inflamatorios.Ítem Acceso Abierto Regulación de la expresión de transportadores ABC intestinales y de su función de barrera bioquímica en un modelo de obesidad : Implicancia tóxico-farmacológica.(Universidad Nacional de Rosario. Facultad de Ciencias Médicas., 2023-07) Barranco, María Manuela; García, Fabiana; Villanueva, Silvina Stella MarisLa proteína asociada a resistencia a multidrogas 2 (Mrp2) y la P-glicoproteína (P-gp) son bombas de eflujo localizadas en la membrana apical de los enterocitos, Mrp2 está predominantemente en yeyuno y P-gp en íleon; y junto con las enzimas metabolizadoras de fase I y II, constituyen la barrera bioquímica intestinal al disminuir la absorción de xenobióticos y fármacos incorporados oralmente, limitando su biodisponibilidad. La expresión y/o actividad de Mrp2 y P-gp puede alterarse en patologías inflamatorias, como en el síndrome metabólico (SM). La obesidad es uno de los determinantes del SM y de la generación de inflamación crónica sistémica. El objetivo de esta tesis fue evaluar la expresión y actividad de Mrp2 y P-gp intestinales, en un modelo murino de obesidad e indagar en los mecanismos regulatorios involucrados y las implicancias tóxico-farmacológicas de un sustrato. Primeramente, se evaluó la expresión y actividad de Mrp2 y P-gp intestinales y el perfil inflamatorio localmente desarrollado en ratones macho adultos C57BL/6; que se dividieron en grupo control (C57-C) alimentado con dieta estándar y grupo HFD (high fat diet, C57-HFD) alimentado con dieta estándar enriquecida con 40% de grasa bovina, por 16 semanas. Al finalizar, C57-HFD incrementó el peso corporal, el índice adiposo, los niveles de glucemia, colesterolemia, trigliceridemia y presentó insulinorresistencia respecto a C57-C. La obesidad inducida por la dieta disminuyó la expresión y actividad de Mrp2 y P-gp y aumentó la expresión de TNF-α, IL-1β e IL-6 intestinales. Posteriormente se estudió la influencia de la vía de señalización del receptor 1 de TNF-α (TNFR1, asociado a genes proinflamatorios) en la disminución de Mrp2 y P-gp, utilizando ratones knockout para este receptor; que se dividieron en R1KO-C y R1KO-HFD (40% de grasa). Luego de 16 semanas, R1KO-HFD aumentó su peso corporal, el tejido adiposo epididimal, los niveles de colesterolemia y trigliceridemia respecto a R1KO-C. No se hallaron diferencias en las glucemias o insulinorresistencia en R1KO-HFD respecto de R1KO-C. Sin embargo, los transportadores mostraron diferente comportamiento, Mrp2 disminuyó en R1-HFD respecto a R1KO-C. Contrariamente, en R1KO-HFD la expresión y actividad intestinal de P-gp fue similar a R1KO-C. Esto implicaría una probable regulación de P-gp por la vía de señalización de TNFR1. Finalmente, se evaluó la implicancia tóxico-farmacológica asociada a la disminución de Mrp2 y P-gp intestinales en ratones en condiciones de obesidad portadores de un adenocarcinoma mamario sometidos a quimioterapia metronómica (QTM) con ciclofosfamida (Cy). Se utilizaron ratones CBi macho adulto, que se dividieron en CBi-C o CBi-HFD (40% de grasa). A las 16 semanas de dieta, se les inoculó el tumor e inició la QTM con Cy (30 mg/kg/día) en el agua de bebida. Los ratones CBi-HFD+Cy presentaron leucopenia y descenso del peso corporal en más del 20%. Además la QTM fue menos efectiva en CBi-HFD. Conclusión, el modelo de obesidad generado por HFD disminuye la expresión y actividad de Mrp2 y P-gp intestinales. La respuesta inflamatoria mediada por TNF-α/TNFR1 sería parcialmente responsable de las alteraciones de P-gp. La alteración de la barrera bioquímica intestinal producida por la dieta alta en grasa generaría toxicidad farmacológica.