Regulación de la expresión de la proteína asociada a resistencia a multidrogas 2 (mrp2) intestinal y su función de barrera bioquímica en un modelo experimental de síndrome metabólico

La proteína asociada a resistencia a multidrogas 2 (Mrp2) es una bomba de eflujo perteneciente a la superfamilia de transportadores ABC. En el intestino, se localiza en la membrana apical del enterocito y limita la absorción de contaminantes dietarios y otros xenobióticos potencialmente tóxicos, actuando de esta manera como un componente esencial de la barrera bioquímica intestinal. Asimismo, Mrp2 presenta gran relevancia clínica ya que limita la absorción y distribución de diversos fármacos administrados por vía oral y, en consecuencia, determina su seguridad y eficacia. El síndrome metabólico (SM) es una condición patológica caracterizada por dislipidemia, hiperinsulinemia, insulinorresistencia, estrés oxidativo (EO) e inflamación crónica. En este trabajo, asumimos como hipótesis general que factores fisiopatológicos sistémicos y/o locales (inflamación intestinal, EO, desbalance hormonal) que se desarrollan en el SM, regulan negativamente la expresión de Mrp2 intestinal a nivel transcripcional y/o postranscripcional. En efecto, en una primera etapa, demostramos que condiciones similares al SM inducidas por la administración de fructosa en el agua de bebida (10% P/V, durante 21 días) a ratas, disminuyen la expresión (proteína y ARNm) y actividad de Mrp2 intestinal, así como también de la enzima metabolizadora glutatión-S-transferasa (GST). Por otra parte, observamos que en estas condiciones, la función de barrera intestinal ejercida por Mrp2 evaluada in vivo usando la droga sustrato valsartán, fue igualmente disminuida. Demostramos también que la administración de fructosa generó simultáneamente EO e inflamación en el tejido intestinal, sugiriendo la participación de estos factores como posibles mediadores importantes de la afectación de Mrp2. En este orden de ideas, a continuación evaluamos el potencial efecto beneficioso del cotratamiento con geraniol y vitamina C, compuestos con propiedades antinflamatorias y antioxidantes, en la reversión de las alteraciones de Mrp2 inducidas por la administración de fructosa. Una vez establecidas las condiciones de SM, la coadministración de geraniol o vitamina C (14 días) fue capaz de revertir la disminución de la expresión de Mrp2, tanto a nivel de la proteína como del ARNm, en concordancia con la normalización de su actividad de transporte. Del mismo modo, el cotratamiento con geraniol o vitamina C normalizó el desbalance redox intestinal y la actividad de las enzimas antioxidantes, a la vez que ambos compuestos restablecieron los niveles elevados de IL-1β en el tejido intestinal. En conjunto, estos resultados contribuyen a confirmar que la inflamación local y el EO, generados en condiciones similares al SM, son mediadores claves de la regulación negativa de Mrp2 intestinal. Considerando estos resultados y teniendo en cuenta: 1) La relevancia del EO en la etiopatogenia del SM y en la fisiopatología de desórdenes gastrointestinales; y 2) La demostración previa de que el EO es un importante regulador de la expresión de Mrp2 en otras condiciones patológicas experimentales; planteamos como instancia final, evaluar el efecto directo del EO sobre Mrp2 intestinal. Es factible hipotetizar un mecanismo regulatorio postraduccional por EO, consistente de una internalización temprana y una degradación proteosomal subsiguiente de Mrp2, similar al descripto en hígado. Para su comprobación, inicialmente expusimos de forma aguda (30 min) sacos intestinales aislados a terc-butil hidroperóxido (TBH), un agente promotor de EO ampliamente aceptado. Primero confirmamos que TBH generó EO en el tejido intestinal, indicado por la alteración de los parámetros que lo estiman, entre ellos por una disminución del contenido de glutatión reducido (GSH) y de la relación GSH /glutatión oxidado (GSSG). En estas condiciones, observamos a su vez que la dosis de 250 μM de TBH produjo una redistribución de Mrp2 desde la membrana apical de ribete en cepillo (BBM) a membranas internas (MI), consistente con un proceso de internalización. En concordancia, su actividad de transporte disminuyó por el tratamiento con TBH, indicando que la internalización de Mrp2 tuvo un impacto funcional. El tratamiento subsecuente con N-acetil-cisteína (NAC), precursor de GSH, restableció los niveles intracelulares de este antioxidante endógeno y revirtió la alteración de la localización y función de barrera de Mrp2. A su vez, la incubación con Gö6976, inhibidor selectivo de isoformas de la proteína quinasa C de tipo clásica (cPKC), fue capaz de bloquear completamente la disminución de Mrp2 en BBM y su aumento en MI, así como el deterioro en su actividad de transporte, inducidos por TBH. A continuación, evaluamos el efecto de una exposición prolongada (24 horas) de EO sobre Mrp2 intestinal, incubando células Caco-2 de origen humano con 250 μM de TBH. Confirmada la inducción de EO, se observó una reducción concomitante de la expresión proteica total de MRP2. Interesantemente, esta reducción fue suprimida por el pretratamiento con el inhibidor proteosómico MG132. De este modo, demostramos por primera vez una regulación postraduccional de Mrp2 intestinal por EO, la que consistiría de dos procesos dependientes del tiempo: 1) Una rápida internalización de Mrp2 a MI por exposición aguda a EO, probablemente mediada por cPKC, que es reversiblemente regulada por el contenido intracelular de GSH y acompañada por el estado redox celular; 2) Si el estímulo prooxidante persiste en el tiempo, Mrp2 sufre un proceso de degradación proteosomal. En conjunto, ambos eventos conducirían finalmente a la disminución de la expresión proteica total de Mrp2 bajo condiciones de EO. En resumen, nuestros resultados demuestran que el EO y la inflamación intestinal, inducidos por una dieta rica en fructosa, regulan negativamente la expresión de Mrp2 intestinal. Esta regulación implicaría una combinación de mecanismos transcripcionales y postranscripcionales. Notablemente, el deterioro concomitante en la función de barrera de Mrp2 podría tener implicancia en la absorción y toxicidad de xenobióticos en condiciones de SM; con especial consecuencia en la eficacia y seguridad de los agentes terapéuticos administrados por vía oral. Al mismo tiempo, nuestro estudio tendría relevancia fisiopatológica al contribuir a la comprensión del mecanismo molecular que regula la expresión de Mrp2 intestinal en un gran número de condiciones patológicas donde coexisten EO y procesos inflamatorios.