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Ítem Acceso Abierto Caracterización molecular de genes localizados en el Locus responsable de la apomixis (ACL) en Paspalum notatum(Facultad de Ciencias Agrarias-Universidad Nacional de Rosario, 2020) Azzaro, Celeste Antonela; Ortiz, Juan Pablo; Siena, Lorena A.Paspalum notatum Flügge es una gramínea perenne rizomatosa ampliamente distribuida desde el centro-este de México e islas del Caribe hasta la Argentina. Las razas tetraploides se reproducen casi exclusivamente por apomixis de tipo apospórica. La apomixis en P. notatum está controlada por un locus simple dominante que presenta distorsión de la segregación y represión de la recombinación. El mismo se halla inserto en una región genómica de gran tamaño (apomixis controlling locus, ACL) que contiene secuencias codificantes, elementos repetitivos y metilación de citosinas consistentes con una región heterocromatinizada. Estudios de mapeo comparativo determinaron que un segmento de aproximadamente 5,8 cM del cromosoma 12 de arroz (comprendido entre los marcadores C1069 y C996) es sinténico al ACL en al menos cuatro especies del género Paspalum. Varias de las secuencias incluidas en este segmento muestran homologías con genes asociados a la señalización y el crecimiento (LOC_Os12g40770 - proteína con repeticiones de anquirina), el metabolismo de hormonas (LOC_Os12g40890 - proteína de la familia Aux/IAA de respuesta temprana a auxinas), y el desarrollo (LOC_Os12g41060 - proteína con dominio AP2). El objetivo general de este trabajo de tesis fue caracterizar las secuencias de P. notatum ortólogas a los genes localizados en el segmento de arroz sinténico al ACL, descriptas anteriormente, dado que por su anotación funcional podrían participar en alguno de los mecanismos de la reproducción en la especie. Una población de mapeo tipo F1 segregante por el modo de reproducción, desarrollada a partir del cruzamiento de una planta tetraploide completamente sexual (Q4188) (progenitor femenino) y un individuo natural apomíctico obligado (Q4117) (dador de polen), fue extendida a 50 individuos totales y reclasificada. La clasificación por el modo de reproducción a través de técnicas citoembriológicas y moleculares mostró 11 individuos apomícticos y 39 sexuales (relación 3,5 sex: 1 apo). La detección de secuencias de P. notatum similares a los genes de interés se llevó adelante utilizando un transcriptoma del desarrollo reproductivo sexual y apomíctico de la especie. El análisis del ligamiento de las secuencias identificadas con el ACL fue realizado mediante análisis BSA y posteriormente análisis de cosegregación utilizando la población de mapeo disponible. Asimismo, se realizó un mapeo físico sobre un borrador del genoma del citotipo diploide de la especie recientemente desarrollado en nuestro laboratorio. En primer lugar, se caracterizó el gen LOC_Os12g40770 codificante para una proteína con repeticiones de anquirina de la subfamilia ANK-TPR. A partir de búsquedas BLAST fue posible identificar cuatro miembros pertenecientes a la subfamilia ANK-TPR expresados durante el desarrollo reproductivo de P. notatum. Uno de estos, nombrado como PnANK-TPR3, presentó elevada homología con OsANK-TPR (codificada por LOC_Os12g40770). Los estudios de ligamiento no pudieron determinar la localización de PnANK-TPR3 en el ACL. Sin embargo, el mapeo in silico de PnANK-TPR3 sobre el borrador del genoma diploide de P. notatum, mostró que una secuencia altamente similar a esta última se posiciona en el supercontig utg001669l que contiene además una secuencia similar a la sonda heteróloga C1069, que mapea 100% ligada ACL en varias especies del género. Este resultado indica que PnANK TPR3 se localiza en el ACL. Estudios de expresión por PCR en tiempo real (qRT-PCR) en diferentes estadios del desarrollo reproductivo del genotipo Q4188 (sexual) y Q4117 (apomíctico) mostraron que PnANK-TPR3 se sobreexpresa significativamente en los estadios de meiosis y antesis durante el desarrollo reproductivo sexual, comparado con el apomíctico. Los resultados para el estadio de meiosis fueron corroborados empleando seis individuos (tres sexuales y tres apomícticos) de la población F1 (Q4188 x Q4117). Esto indica que PnANK TPR3 está regulado negativamente al momento de la meiosis en los individuos apospóricos analizados. Sumado a esto, PnANK-TPR3 mostró muy bajos niveles de expresión en tejido somático (hoja y raíz). Por otro lado, se detectó una proteína quinesina como interactora directa de OsANK-TPR. Este tipo de proteínas juegan un papel fundamental en el control del ciclo celular. Los resultados obtenidos para PnANK-TPR3 indican que podría formar parte de una cascada de señalización involucrada en la determinación del destino de las células de la nucela y su posible canalización hacia la gametogénesis. Posteriormente, se caracterizó el gen relacionado al LOC_Os12g40890, codificante para una proteína miembro de la familia Aux/IAA de respuesta temprana a auxinas. A través de búsquedas BLAST se detectaron 22 miembros de dicha familia expresados durante el desarrollo reproductivo de P. notatum. Uno de estos miembros, renombrado como PnIAA30, mostró ser ortólogo a LOC_Os12g40890 (OsIAA30). Los análisis de ligamiento determinaron que una forma alélica de PnIAA30 se encuentra genéticamente ligada al ACL a una distancia de recombinación aproximada de r = 0,30. Sumado a esto, el mapeo in silico de PnIAA30 sobre el borrador del genoma diploide de P. notatum, mostró que una secuencia altamente similar a esta última se posiciona en el mismo supercontig (utg001669l) que las secuencias homólogas a PnANK-TPR3 y a la sonda heteróloga C1069 100% ligada al ACL de P. notatum. Esos resultados marcan una evidencia consistente de que PnIAA30 es el ortólogo de OsIAA30, está efectivamente localizado cerca del ACL y que su disposición génica, la de PnANK-TPR3 y el marcador C1069 en esta región de P. notatum, es colineal con la región del cromosoma 12 de arroz. Por otra parte, los estudios de expresión por qRT-PCR para PnIAA30 mostraron que los transcriptos de este gen están significativamente más expresados durante el desarrollo sexual (Q4188) que el apomíctico (Q4117) al momento de la antesis. Estos resultados se repitieron en cinco individuos (tres sexuales y dos apomícticos) de la población F1 (Q4188 x Q4117). Además, se observó que la expresión de PnIAA30 se asocia negativamente con el grado de expresividad de la aposporía, lo cual está en línea con la teoría del surgimiento de la apomixis como una desregulación en la expresión de los genes involucrados en la vía canónica sexual. Por otro lado, mediante experimentos RT-PCR se determinó que PnIAA30 presenta mayor expresión durante la embriogénesis en el genotipo sexual respecto del apomíctico. Este resultado sugiere que PnIAA30 podría estar relacionado al control del desarrollo del embrión sexual. Experimentos de hibridación in situ de tejidos, mostraron una expresión contrastante entre el genotipo sexual y el apomíctico. PnIAA30 parece estar activo en la CMM del genotipo apomíctico y se expresa fuertemente en la nucela de plantas sexuales. Esta expresión localizada, podría estar relacionada con una diferente regulación de los destinos celulares. En el estadio de antesis, los experimentos de hibridación in situ mostraron que PnIAA30 se sobreexpresa en la nucela, núcleos polares y aparato oosférico del megagametófito del genotipo sexual comparado con el apomíctico, donde la actividad de PnIAA30 es casi imperceptible. Estos últimos resultados señalan un posible rol de PnIAA30 en la señalización involucrada en la partenogénesis. Sumado a eso la red de proteínas interactoras de OsIAA30 determinó una relación directa con factores de transcripción ARFs (Auxin Response Factors) asociados a la megaesporogénesis de arroz, al igual que OsIAA30 ortólogo de PnIAA30. Por otro lado, se identificaron mediante búsquedas BLASTP, nueve proteínas miembros de la superfamilia AP2/ERF expresadas durante el desarrollo reproductivo de P. notatum. Cuatro de estas con elevada homología a miembros representativos del grupo de proteínas BBM (BABY BOOM) pertenecientes al clado euANT y cinco homólogas a miembros del clado euAP2 perteneciente a la familia AP2-like (APETALA2-LIKE). PnAP2-like, ortólogo putativo de APL25 (Oryza sativa) y SiAP2-like (Setaira itálica), presenta un alelo especifico del genotipo materno sexual que cosegrega ligado al modo reproductivo sexual. La identidad de los fragmentos de PnAP2-like amplificados sobre ADN genómico del genotipo sexual y apomíctico, arrojaron homología con una secuencia codificantes AP2-like de Setaria viridis, y dos secuencias TARGE OF EAT3 (TOE3) de Setaria italica y Panicum halli. Los genes TOE son reguladores postrancripcionales y parecen jugar un rol importante en la identidad de los órganos florales, junto a APETALA2 y AGAMOUS. PnBBM-like, mostró una representación posiblemente diferencial entre los transcriptomas de C4-4x (sexual) y Q4117 (apomíctico). El gen PsASGR-BABYBOOM-like fue asociado a la partenogénesis en Pennisetum glaucum (especie apospórica), por lo que podríamos pensar un posible rol de PnBBM-like en la partenogénesis de especies apospóricas como Paspalum notatum. Los resultados obtenidos en esta Tesis permitieron detectar secuencias expresadas durante el desarrollo reproductivo de P. notatum, homólogas a genes correspondientes a la región del cromosoma 12 de arroz sinténica al ACL de la especie bajo estudio. Se detectaron los genes ortólogos de P. notatum y su localización en los genomas diploide y tetraploide. El mapeo in silico sobre el borrador del genoma diploide mostró una colinealidad entre las secuencias de P. notatum y de la región estudiada de arroz. Paralelamente, se pudo demostrar que tanto PnANK-TPR3 como PnIAA30 están regulados diferencialmente durante el desarrollo reproductivo sexual y apomíctico. Por otro lado, se determinó que un alelo de PnAP2-like cosegrega con la sexualidad y que PnBBM-like se encuentra regulado diferencialmente según la base global del transcripto del desarrollo reproductivo de P. notatum. Estos resultados aportan evidencia de que los genes relacionados con la señalización y el crecimiento celular, el metabolismo de hormonas y el desarrollo, localizados en el ACL, presentan una alteración en sus patrones de expresión durante el desarrollo sexual y apomíctico que probablemente derive de la estructura de dicha región genómica y se relacione con el cambio del modo reproductivo sexual al apomíctico.Ítem Acceso Abierto Estudios citogenéticos en citotipos apomícticos y sexuales de paspalum notatum y caracterización molecular de secuencias asociadas a la aposporía(FCA-UNR, 2012) Podio, Maricel; Ortiz, Juan PabloPaspalum notatum Flügge es una gramínea rizomatosa perenne ampliamente difundida en las regiones tropicales y subtropicales de Sudamérica. Las razas tetraploides naturales de esta especie se reproducen casi exclusivamente por apomixis de tipo apospórica. La aposporía (un componente de la apomixis apospórica) en P. notatum es controlada por un locus único (denominado ACL) que presenta segregación distorsionada y supresión de la recombinación. La presencia de inversiones u otras alteraciones cromosómicas fueron propuestas para explicar el tipo de herencia observado para la aposporía. La determinación de la estructura cromosómica que contiene al ACL puede aportar conocimiento sobre la transmisión del carácter a la progenie y contribuir a la identificación de secuencias codificantes asociadas con su expresión. Por otro lado, varios marcadores moleculares completamente ligados a la aposporía y transcriptos de ARNm diferencialmente expresados en inflorescencias de plantas apomícticas y sexuales fueron identificados en P. notatum y otras especies de gramíneas. Sin embargo, hasta el momento solo unos pocos de ellos han sido estudiados en detalle a nivel genético y funcional. El objetivo general de este trabajo de Tesis fue profundizar los estudios tendientes a determinar las características citogenéticas y moleculares del locus responsable de la aposporía en P. notatum y caracterizar genes cuya expresión fue asociadas a la apomixis en gramíneas así como secuencias genómicas localizadas específicamente en el locus de la aposporía. En el Capítulo I se describen los estudios citogenéticos realizados en meiocitos de plantas apomícticas y sexuales de P. notatum. Como material vegetal fueron incluidas cinco accesiones apomícticas naturales, tres individuos sexuales obtenidos experimentalmente y 16 híbridos F1 clasificados por el modo de reproducción. Las observaciones citogenéticas revelaron que tanto las plantas apomícticas como las sexuales presentaron algunas anormalidades meióticas como, cromosomas rezagados, puentes de cromatina y micronúcleos. Sin embargo, un análisis cuantitativo de éstas reveló diferencias significativas entre las accesiones apomícticas y sexuales. Asimismo, el análisis de los híbridos confirmó las diferencias observadas en los progenitores con diferente modo de reproducción. Un estudio de FISH reveló que el ACL se encuentra en hemicigosis, muy próximo a regiones ricas en heterocromatina. Los resultados presentados en este Capítulo demostraron que las plantas apomícticas presentan un mayor número de anormalidades meióticas en la anafase I que las sexuales y que estas anormalidades se transmiten a la descendencia asociadas con el modo de reproducción. Asimismo fue posible determinar que el locus responsable de la aposporía se transmite solo a uno de los productos de la meiosis I. Esta estructura cromosómica podría explicar la distorsión de la segregación y la supresión de la recombinación asociada a la transmisión de la apomixis en la especie. En el Capítulo II se describe la caracterización molecular de los genes SERK y EXS en P. notatum. El gen SERK (somatic embryogenesis receptor like kinase) fue asociado a la apomixis en Poa pratensis. A partir del apilamiento de secuencias conocidas fue posible aislar dos secuencias genómicas de P. notatum con alta similitud a genes SERK: PnSERK1 (1750 pb) y PnSERK2 (2050pb). Al menos 3 copias de PnSERK están presentes en el genoma de P. notatum. Estudios de expresión por PCR en tiempo real (qRT-PCR) en diferentes estadios del desarrollo reproductivo del genotipo Q4188 (sexual) y Q4117 (apomíctico) mostraron que PnSERK2 se expresa a niveles superiores de PnSERK1 y que muestra diferencias significativas en los estadios de premeiosis, postmeiosis y antesis entre ambos genotipos. Experimentos de hibridación in situ de tejidos, mostraron una expresión contrastante entre el genotipo sexual y el apomíctico. Los resultados obtenidos indican que PnSERK2 presenta una expresión diferencial entre plantas apomícticas y sexuales y podría formar parte de la cascada de genes asociados a la expresión de la apomixis en P. notatum. Se analizó también el gen EXS. Una secuencia codificante para el dominio EXS fue identificada en un clon de BAC conteniendo marcadores moleculares completamente ligados a la aposporía en P. simplex. Mediante experimentos similares a los descriptos anteriormente se aisló un fragmento de 2298 pb con alta similitud al gen EXS de arroz y maíz de los genotipos Q4188 y Q4117. El análisis del número de copias reveló que existen entre 2 y 4 secuencias homólogas en el genoma de P. notatum. Estudios de expresión por qRT-PCR no mostraron diferencias significativas entre los genotipos sexuales y apomícticos en distintos estadios del desarrollo reproductivo. Sin embargo, estudios de hibridación in situ de tejido mostraron expresión de EXS en tejido ovárico del genotipo sexual mientras que solo se observó expresión en células que rodean a los sacos embrionarios en el genotipo apomíctico. El análisis de mapeo in silico, indicó que PnEXS se localiza en regiones que ya han sido reportadas como asociadas a la aposporía. Estos resultados indican que PnEXS podría estar diferencialmente regulado en plantas apomícticas y sexuales. En el Capítulo III se presentan los estudios realizados en la caracterización de secuencias específicas del ACL en P. notatum y el mapeo de transcriptos de ARNm asociados con el modo de reproducción. Varias de las secuencias correspondientes al ACL mostraron similitud con elementos repetitivos, proteínas hipotéticas, proteínas ribosomales y dominios codificantes. El mapeo de seis transcriptos expresados diferencialmente entre plantas apomícticas y sexuales mostró que N54 resultó ligado en repulsión al ACL. Los resultados obtenidos en esta Tesis permitieron detectar la presencia de un rearreglo cromosomal que se trasmite a la progenie asociado a la aposporía. Además, se logró localizar el ACL en un único cromosoma de P. notatum y determinar su condición hemicigota. Paralelamente, se pudo demostrar que PnSERK2 se encuentra funcionalmente asociado a la aposporía y que PnEXS estaría regulado diferencialmente en plantas apomícticas y sexuales. El análisis de marcadores 100% ligados al carácter puso en evidencia la presencia de secuencias codificantes que podrían estar asociadas a la aposporía.Ítem Acceso Abierto Estudios de factores genéticos y epigenéticos sobre la expresión de la apomixis en Paspalum notatum(FCA-UNR, 2010) Rodriguez Romero, María Pía; Ortiz, Juan PabloPaspalum notatum es una gramínea forrajera nativa de las praderas naturales de las regiones subtropicales de América. Los citotipos diploides son de reproducción sexual y los poliploides, en su mayoría tetraploides, son apomícticos de tipo apospórico. La manipulación de la apomixis, reproducción asexual por semillas, puede tener un gran impacto en la agricultura, principalmente porque su introducción en especies de gran cultivo permitiría la propagación indefinida de genotipos híbridos en forma clonal. En P. notatum, la aposporía, un componente de la apomixis, está controlada por un locus complejo localizado en un fragmento cromosómico de gran tamaño, que presenta supresión de la recombinación y apareamiento preferencial de cromosomas con uno de los cuatro homólogos del grupo. Los análisis de secuencias de marcadores moleculares 100 % asociados al carácter mostraron homologías con elementos repetitivos, genes gag/pol de maíz y sectores no codificantes. El objetivo general de este trabajo fue llevar a cabo un análisis de los factores genéticos y epigenéticos asociados a la aposporía en la especie. En este estudio se analizaron las frecuencias, los patrones y la variación en la metilación de citosinas del ADN, en genotipos diploides y tetraploides. La técnica utilizada (MSAP) (“Methylation Sensitive Amplification Polymorphism”) está basada en la técnica de AFLP (“Amplified Fragment Length Polymorphism”) incluyendo en la etapa de digestión del ADN dos enzimas de restricción diferencialmente sensibles a la metilación. Las proporciones de los sitios CCGG metilados variaron entre 40 - 42 % y 31 - 41 % en diploides y tetraploides, respectivamente. al analizar el número total de sitios blanco metilados y no metilados se obtuvo diferencia significativa entre grupos. Los análisis de similitud basados en los polimorfismos sensibles a metilación mostraron que los tetraploides fueron significativamente más diversos que los diploides. Se encontró una correlación significativa entre la variación epigenética y no epigenética en ambos grupos. Varios marcadores mostraron estados de metilación diferentes en los distintos niveles de ploidía. El agrupamiento basado en las similitudes en cuanto a la metilación de citosinas, incluyendo todos los genotipos mostró que los cuatro diploides y uno de los tetraploides experimentales de reproducción sexual conforman un solo grupo indicando una estructura epigenética común. Varios marcadores MSAP que mostraron polimorfismos en cuanto a su estado de metilación entre los individuos Q4188 y Q4117 fueron ensayados en una población segregante F1 derivada de ambos. Este análisis demostró que varios de estos sitios se transmiten a la descendencia en forma mendeliana como alelos en dosis simple. Un análisis similar que se llevó a cabo con el citotipo diploide C4-2x y su autotetraploide derivado C4-4x (ambos de origen experimental) mostró que las dos plantas son muy similares tanto a nivel epigenético como genético aunque se detectaron polimorfismos asociados al nivel de ploidía. Las secuencias derivadas de algunos marcadores MSAP presentaron homología con secuencias codificantes, transposones/retrotransposones y secuencias no codificantes. Los resultados obtenidos en esta parte del trabajo indican que aunque la proporción de sitios metilados entre los dos niveles de ploidía es comparable, el patrón y la variación de los mismos difieren entre los citotipos. Más aun, luego de la tetraploidización se observó la generación de nuevos “epialelos” en la especie. Análisis de RFLP con clones que mapean en el locus responsable de la aposporía en combinación con enzimas sensibles a metilación mostraron que la región genómica se encuentra metilada e incluso se observan diferencias en el estado de metilación de algunos loci entre los genotipos sexuales y apomícticos. Se desarrolló un marcador específico de secuencia ligado completamente a la aposporía. La disponibilidad de este marcador simplificará y acelerará la identificación de individuos apomícticos en poblaciones segregantes y permitirá el escrutinio debibliotecas genómicas en futuras estrategias de clonado de los genes relacionados. Otra importante cualidad de este marcador fue su consistencia en diferentes fondos genéticos. Este marcador fue ensayado en citotipos diploides de la especie derivados de una población natural y se encontró que su frecuencia en la población es del 0.17. Por otro lado, se aislaron secuencias adyacentes a los marcadores de AFLP 100 % ligados a la aposporía mediante estrategias de caminata cromosomal. Se aislaron secuencias con homología a genes relacionados con la síntesis proteica, metilación de especies de ARN, retrotransposones y proteínas de tipo quinasa. Asimismo, se identificó un nuevo marcador ligado completamente a la aposporía en la especie cuya secuencia corresponde a una proteína con repeticiones de anquirina. Los resultados presentados en esta tesis muestran que tanto factores genéticos como epigenéticos están asociados a la apomixis en Paspalum. En particular el carácter aposporía estaría controlado por un locus complejo que incluye secuencias codificantes y no codificantes, elementos repetitivos y metilación de citosinas.Ítem Acceso Abierto Implementación de un sistema modelo diploide/tetraploide para el estudio genético y molecular de la apomixis en Paspalum rufum(FCA-UNR, 2020-03) Soliman, Mariano; Delgado, Luciana; Ortiz, Juan PabloLa apomixis es un modo de reproducción asexual por semillas que genera progenies genéticamente idénticas a la planta madre. Esta característica es común en especies del género Paspalum, donde las poblaciones naturales se organizan en complejos agámicos multiploides. En estos sistemas, el citotipo diploide se reproduce por sexualidad, mientras que los polipoloides, generalmente triploides y tetraploides, se reproducen por apomixis gametofítica de tipo apospórica pseudógama. A pesar de esto, en varias especies del género, en especial en P. rufum, se detectaron individuos diploides que producen sacos embrionarios apospóricos (SEA) e incluso algunos son capaces de completar la apomixis. El objetivo de este trabajo fue establecer un sistema de estudio de la apomixis a nivel diploide y tetraploide en P. rufum. Para esto se trabajó en la generación y caracterización del material vegetal, se estableció un sistema comparativo y se desarrollaron herramientas moleculares para futuros estudios sobre los genes asociados al control de los componentes del carácter. En primer lugar, se realizó una caracterización de la transmisión de los componentes de la apomixis, aposporía (SEA) y partenogénesis al nivel diploide. Se trabajó con una población segregante F1 proveniente del cruzamiento entre dos genotipos diploides naturales, ambos capaces de producir SEA en proporciones similares (5,77 %SEA y 13 %SEA) y con capacidad diferencial de completar la partenogénesis (0% y 15%). Los análisis de segregación del carácter “aposporía”, realizados mediante observaciones citoembriológicas, ajustaron a un modelo dominante controlado por dos loci independientes. La determinación del %SEA en la progenie F1 (entre 0% y 35,8 %SEA) reveló que la hibridación puede aumentar significativamente la expresividad del carácter. Por otro lado, se confirmó que el grado de expresividad de la aposporía se transmite desde los parentales a las progenies (F2) y es un carácter estable para un mismo genotipo a lo largo del tiempo, sin embargo varía en diferentes ambientes. La capacidad de formar semillas por apomixis fue evaluada en varios individuos mediante citometría de flujo y se demostró que si bien algunos producen semillas apomícticas, la mayor expresividad de la aposporía no se correlaciona con esta capacidad. Además, se analizó la influencia del aumento de ploidía, en genotipos tetraploides artificiales, sobre la expresividad de la aposporía y la apomixis. Estos análisis mostraron que la duplicación genómica permite incrementar el %SEA y la apomixis aunque esta no prevalece sobre la sexualidad. Para avanzar con el desarrollo de herramientas moleculares se utilizó la población F1 para generar un mapa de ligamiento genético a nivel diploide. Se construyeron dos mapas de ligamiento mediante la inclusión de 627 marcadores de AFLP. Cada mapa quedó formado por 10 grupos de ligamiento (GL) cubriendo una longitud total de 1071,8 cM y 914 cM con una distancia promedio entre marcadores de 4,78 cM y 4,53 cM y una distancia máxima entre dos marcadores de 28,74 y 34,8 cM para el parental femenino y masculino, respectivamente. La variación observada para la expresividad de la aposporía en la población nos llevó a realizar una búsqueda de regiones asociadas a la misma mediante análisis de regresión simple. Se comprobó la existencia de más de una región genómica asociada al carácter, localizadas principalmente en dos GL. Si bien se desconocen las vías moleculares que controlan la apomixis se ha postulado que su expresión es posible gracias a la desregulación de los mismos genes que participan en el desarrollo sexual y provocan una heterocronía en los procesos de desarrollo reproductivo. Con el objetivo de probar esta hipótesis se comparó el desarrollo reproductivo sexual y apomíctico entre los citotipos diploide y tetraploide, ambos con sexualidad y apomixis en diferentes proporciones. Se evaluó la evolución de la esporogénesis y la gametogénesis femenina y masculina, el crecimiento del ovario y la diferenciación de las células iniciales de la aposporía (IA). Estos análisis mostraron diferente coordinación entre los procesos de desarrollo sexual y apomíctico en el citotipo diploide respecto del tetraploide, observándose principalmente un retraso de la meiosis femenina en los tetraploides. Se postula que esta característica podría estar favoreciendo al desarrollo apomíctico al nivel poliploide. Considerando la relación que existe entre las modificaciones epigenéticas y la expresión de la apomixis se realizó un análisis comparativo de los perfiles de metilación entre genotipos diploides, de la población F1, con diferentes %SEA, utilizando espiguillas en premeiosis y postmeiosis. Se aplicó una técnica desarrollada recientemente denominada MCSeEd. Este análisis reveló la presencia de cambios en la metilación asociados a los diferentes comportamientos reproductivos. Se verificó además que varias de las secuencias diferencialmente metiladas poseen homología con genes relacionados con procesos de crecimiento y desarrollo reproductivo. Los resultados obtenidos en la presente tesis permitieron caracterizar exhaustivamente el desarrollo de la apomixis a nivel diploide y tetraploide en la especie P. rufum. Se desarrolló el material vegetal diploide y tetraploide para continuar con los estudios moleculares de la apomixis y comprender su control, así como la influencia que ejercen los aumentos en los niveles de ploidía. Se construyó un mapa de ligamiento que será el punto de partida para localizar los componentes de la apomixis en el genoma diploide. Por último, se implementó el sistema diploide para un primer estudio comparativo a nivel molecular identificándose variaciones epigenéticas relacionadas con el cambio del comportamiento reproductivo. Además, se generó una base de datos de secuencias que serán de gran utilidad en estudios posteriores para la identificación de los genes que intervienen en la regulación de la apomixis a nivel diploide.Ítem Acceso Abierto Paspalum notatum Flüggé: una alternativa forrajera para mejorar los bajos inundables en el sur de la provincia de Santa Fe(Secretaría de Extensión Universitaria, Facultad de Ciencias Agrarias. Universidad Nacional de Rosario, 2015-08) Anibalini, Verónica; Galleano, Andrés; Siena, Lorena; Ortiz, Juan Pablo; Martín, BeatrizÍtem Acceso Abierto Transferencia de marcadores EST-SSR y COS desde especies modelo a Paspalum notatum y estudios de mapeo comparativo(2011) Siena, Lorena Adelina; Ortiz, Juan Pablo; Pessino, SilvinaPaspalum es un género perteneciente a la familia de las Poaceae que cuenta con más de 300 especies. Las mismas muestran una gran variación en los niveles de ploidía y modos de reproducción. En general, los citotipos diploides son sexuales y los poliploides sexuales o apomícticos. Dada su complejidad, el género ha sido dividido en subgéneros y grupos informales. Varias especies representan importantes recursos forrajeros de las regiones tropicales y subtropicales de América. En particular, P. notatum Flüggé es una gramínea rizomatosa perenne cuyas razas tetraploides se reproducen casi exclusivamente por apomixis de tipo apospórica. La aposporía en P. notatum está controlada por un locus simple dominante con segregación distorsionada. Trabajos previos posibilitaron el desarrollo de mapas genéticos al nivel tetraploide y la identificación de la región genómica responsable de la aposporía. A partir de los proyectos de secuenciación masiva de genomas se han desarrollado distintos tipos de marcadores moleculares de secuencia conocida. Los microsatélites génicos (EST-SSR) derivan de secuencias expresadas que contienen repeticiones microsatélites (SSR) internas. Los marcadores COS provienen de genes que contienen regiones conservadas entre especies poco relacionadas. Estos tipos de marcadores son relativamente simples de desarrollar y han mostrado un alto nivel de polimorfismo y transferibilidad entre especies. Los objetivos de este trabajo de tesis fueron transferir marcadores de secuencia conocida (EST-SSR, SSR genómicos y COS) a P. notatum y caracterizar los grupos de ligamiento de la especie por medio de análisis comparativos. Asimismo, se realizaron estudios para determinar la utilidad de estos marcadores en otras especies del género y su aptitud para la realización de estudios de filogenia. Como material vegetal se emplearon los genotipos tetraploides de P. notatum Q4188 (sexual) y Q4117 (apomíctico) y una población F1, derivada de ambos. Además fueron incluidas 33 accesiones correspondientes a 11 especies y seis grupos taxonómicos diferentes. Marcadores EST-SSR de trigo y SSR genómicos de P. notatum fueron ensayados sobre los genotipos Q4188 y Q4117. Paralelamente se desarrollaron marcadores COS a partir de genes asociados a componentes de la apomixis en gramíneas. Los marcadores obtenidos fueron localizados en los mapas de Q4188 y Q4117 utilizando los programas de mapeo Mapmaker 3.0/exp y JoinMap 3.0. Cuarenta y cuatro y 66 nuevos marcadores fueron integrados a los mapas de Q4188 y Q4117, respectivamente. Los marcadores Resumen x incorporados extendieron las distancias genéticas cubiertas por ambos mapas y posibilitaron la identificación de nuevos grupos de ligamiento. Las secuencias de varios EST-SSR de P. notatum mostraron similitudes con los clones originales de trigo (de los cuales derivan) y confirmaron la identificación de secuencias ortólogas entre ambas especies. Paralelamente un análisis de mapeo in silico permitió determinar la localización de los marcadores empleados en los genomas de arroz y maíz. Los estudios comparativos detectaron varios segmentos cromosómicos conservados entre P. notatum, arroz y maíz. En especial, se determinó que 12 marcadores resultaron asociados a los grupos de ligamiento relacionados con la aposporía. Los marcadores Ksum206dd y Ksum219bd fueron localizados a ambos lados del locus responsable del carácter. La utilidad de los marcadores EST-SSR y SSR genómicos en otras especies del género y su capacidad para realizar estudios de filogenia fueron analizadas. Como control externo se utilizó trigo pan (Triticum aestivum L.) cv. Federal. Los marcadores EST-SSR generaron 166 fragmentos con un promedio de 6,16 fragmentos polimórficos por grupo. Los SSR genómicos produjeron 104 fragmentos totales con un promedio de 4,39 fragmentos polimórficos por grupo. Los análisis de agrupamiento permitieron discriminar entre grupos taxonómicos y especies dentro de cada grupo. Los resultados presentados en esta tesis demuestran la factibilidad de transferir marcadores EST-SSR y COS a P. notatum y contribuyen al conocimiento de la estructura genómica de las razas tetraploides de la especie. En particular, la identificación de secuencias ortólogas entre P. notatum, arroz y maíz permitió detectar varios segmentos cromosómicos conservados en las tres especies e iniciar estudios de mapeo comparativo. La localización de varios marcadores en los grupos de ligamiento asociados a la aposporía permitió una mejor caracterización de esta región genómica y la definición de un segmento del genoma de arroz que contendría genes candidatos a controladores del carácter. Se demostró asimismo la posibilidad de emplear estos marcadores en varias especies del género y su utilidad para la realización de estudios de filogenia.