Estudios de factores genéticos y epigenéticos sobre la expresión de la apomixis en Paspalum notatum

Paspalum notatum es una gramínea forrajera nativa de las praderas naturales de las regiones subtropicales de América. Los citotipos diploides son de reproducción sexual y los poliploides, en su mayoría tetraploides, son apomícticos de tipo apospórico. La manipulación de la apomixis, reproducción asexual por semillas, puede tener un gran impacto en la agricultura, principalmente porque su introducción en especies de gran cultivo permitiría la propagación indefinida de genotipos híbridos en forma clonal. En P. notatum, la aposporía, un componente de la apomixis, está controlada por un locus complejo localizado en un fragmento cromosómico de gran tamaño, que presenta supresión de la recombinación y apareamiento preferencial de cromosomas con uno de los cuatro homólogos del grupo. Los análisis de secuencias de marcadores moleculares 100 % asociados al carácter mostraron homologías con elementos repetitivos, genes gag/pol de maíz y sectores no codificantes. El objetivo general de este trabajo fue llevar a cabo un análisis de los factores genéticos y epigenéticos asociados a la aposporía en la especie. En este estudio se analizaron las frecuencias, los patrones y la variación en la metilación de citosinas del ADN, en genotipos diploides y tetraploides. La técnica utilizada (MSAP) (“Methylation Sensitive Amplification Polymorphism”) está basada en la técnica de AFLP (“Amplified Fragment Length Polymorphism”) incluyendo en la etapa de digestión del ADN dos enzimas de restricción diferencialmente sensibles a la metilación. Las proporciones de los sitios CCGG metilados variaron entre 40 - 42 % y 31 - 41 % en diploides y tetraploides, respectivamente. al analizar el número total de sitios blanco metilados y no metilados se obtuvo diferencia significativa entre grupos. Los análisis de similitud basados en los polimorfismos sensibles a metilación mostraron que los tetraploides fueron significativamente más diversos que los diploides. Se encontró una correlación significativa entre la variación epigenética y no epigenética en ambos grupos. Varios marcadores mostraron estados de metilación diferentes en los distintos niveles de ploidía. El agrupamiento basado en las similitudes en cuanto a la metilación de citosinas, incluyendo todos los genotipos mostró que los cuatro diploides y uno de los tetraploides experimentales de reproducción sexual conforman un solo grupo indicando una estructura epigenética común. Varios marcadores MSAP que mostraron polimorfismos en cuanto a su estado de metilación entre los individuos Q4188 y Q4117 fueron ensayados en una población segregante F1 derivada de ambos. Este análisis demostró que varios de estos sitios se transmiten a la descendencia en forma mendeliana como alelos en dosis simple. Un análisis similar que se llevó a cabo con el citotipo diploide C4-2x y su autotetraploide derivado C4-4x (ambos de origen experimental) mostró que las dos plantas son muy similares tanto a nivel epigenético como genético aunque se detectaron polimorfismos asociados al nivel de ploidía. Las secuencias derivadas de algunos marcadores MSAP presentaron homología con secuencias codificantes, transposones/retrotransposones y secuencias no codificantes. Los resultados obtenidos en esta parte del trabajo indican que aunque la proporción de sitios metilados entre los dos niveles de ploidía es comparable, el patrón y la variación de los mismos difieren entre los citotipos. Más aun, luego de la tetraploidización se observó la generación de nuevos “epialelos” en la especie. Análisis de RFLP con clones que mapean en el locus responsable de la aposporía en combinación con enzimas sensibles a metilación mostraron que la región genómica se encuentra metilada e incluso se observan diferencias en el estado de metilación de algunos loci entre los genotipos sexuales y apomícticos. Se desarrolló un marcador específico de secuencia ligado completamente a la aposporía. La disponibilidad de este marcador simplificará y acelerará la identificación de individuos apomícticos en poblaciones segregantes y permitirá el escrutinio debibliotecas genómicas en futuras estrategias de clonado de los genes relacionados. Otra importante cualidad de este marcador fue su consistencia en diferentes fondos genéticos. Este marcador fue ensayado en citotipos diploides de la especie derivados de una población natural y se encontró que su frecuencia en la población es del 0.17. Por otro lado, se aislaron secuencias adyacentes a los marcadores de AFLP 100 % ligados a la aposporía mediante estrategias de caminata cromosomal. Se aislaron secuencias con homología a genes relacionados con la síntesis proteica, metilación de especies de ARN, retrotransposones y proteínas de tipo quinasa. Asimismo, se identificó un nuevo marcador ligado completamente a la aposporía en la especie cuya secuencia corresponde a una proteína con repeticiones de anquirina. Los resultados presentados en esta tesis muestran que tanto factores genéticos como epigenéticos están asociados a la apomixis en Paspalum. En particular el carácter aposporía estaría controlado por un locus complejo que incluye secuencias codificantes y no codificantes, elementos repetitivos y metilación de citosinas.