Caracterización molecular de genes localizados en el Locus responsable de la apomixis (ACL) en Paspalum notatum

Paspalum notatum Flügge es una gramínea perenne rizomatosa ampliamente distribuida desde el centro-este de México e islas del Caribe hasta la Argentina. Las razas tetraploides se reproducen casi exclusivamente por apomixis de tipo apospórica. La apomixis en P. notatum está controlada por un locus simple dominante que presenta distorsión de la segregación y represión de la recombinación. El mismo se halla inserto en una región genómica de gran tamaño (apomixis controlling locus, ACL) que contiene secuencias codificantes, elementos repetitivos y metilación de citosinas consistentes con una región heterocromatinizada. Estudios de mapeo comparativo determinaron que un segmento de aproximadamente 5,8 cM del cromosoma 12 de arroz (comprendido entre los marcadores C1069 y C996) es sinténico al ACL en al menos cuatro especies del género Paspalum. Varias de las secuencias incluidas en este segmento muestran homologías con genes asociados a la señalización y el crecimiento (LOC_Os12g40770 - proteína con repeticiones de anquirina), el metabolismo de hormonas (LOC_Os12g40890 - proteína de la familia Aux/IAA de respuesta temprana a auxinas), y el desarrollo (LOC_Os12g41060 - proteína con dominio AP2). El objetivo general de este trabajo de tesis fue caracterizar las secuencias de P. notatum ortólogas a los genes localizados en el segmento de arroz sinténico al ACL, descriptas anteriormente, dado que por su anotación funcional podrían participar en alguno de los mecanismos de la reproducción en la especie. Una población de mapeo tipo F1 segregante por el modo de reproducción, desarrollada a partir del cruzamiento de una planta tetraploide completamente sexual (Q4188) (progenitor femenino) y un individuo natural apomíctico obligado (Q4117) (dador de polen), fue extendida a 50 individuos totales y reclasificada. La clasificación por el modo de reproducción a través de técnicas citoembriológicas y moleculares mostró 11 individuos apomícticos y 39 sexuales (relación 3,5 sex: 1 apo). La detección de secuencias de P. notatum similares a los genes de interés se llevó adelante utilizando un transcriptoma del desarrollo reproductivo sexual y apomíctico de la especie. El análisis del ligamiento de las secuencias identificadas con el ACL fue realizado mediante análisis BSA y posteriormente análisis de cosegregación utilizando la población de mapeo disponible. Asimismo, se realizó un mapeo físico sobre un borrador del genoma del citotipo diploide de la especie recientemente desarrollado en nuestro laboratorio. En primer lugar, se caracterizó el gen LOC_Os12g40770 codificante para una proteína con repeticiones de anquirina de la subfamilia ANK-TPR. A partir de búsquedas BLAST fue posible identificar cuatro miembros pertenecientes a la subfamilia ANK-TPR expresados durante el desarrollo reproductivo de P. notatum. Uno de estos, nombrado como PnANK-TPR3, presentó elevada homología con OsANK-TPR (codificada por LOC_Os12g40770). Los estudios de ligamiento no pudieron determinar la localización de PnANK-TPR3 en el ACL. Sin embargo, el mapeo in silico de PnANK-TPR3 sobre el borrador del genoma diploide de P. notatum, mostró que una secuencia altamente similar a esta última se posiciona en el supercontig utg001669l que contiene además una secuencia similar a la sonda heteróloga C1069, que mapea 100% ligada ACL en varias especies del género. Este resultado indica que PnANK TPR3 se localiza en el ACL. Estudios de expresión por PCR en tiempo real (qRT-PCR) en diferentes estadios del desarrollo reproductivo del genotipo Q4188 (sexual) y Q4117 (apomíctico) mostraron que PnANK-TPR3 se sobreexpresa significativamente en los estadios de meiosis y antesis durante el desarrollo reproductivo sexual, comparado con el apomíctico. Los resultados para el estadio de meiosis fueron corroborados empleando seis individuos (tres sexuales y tres apomícticos) de la población F1 (Q4188 x Q4117). Esto indica que PnANK TPR3 está regulado negativamente al momento de la meiosis en los individuos apospóricos analizados. Sumado a esto, PnANK-TPR3 mostró muy bajos niveles de expresión en tejido somático (hoja y raíz). Por otro lado, se detectó una proteína quinesina como interactora directa de OsANK-TPR. Este tipo de proteínas juegan un papel fundamental en el control del ciclo celular. Los resultados obtenidos para PnANK-TPR3 indican que podría formar parte de una cascada de señalización involucrada en la determinación del destino de las células de la nucela y su posible canalización hacia la gametogénesis. Posteriormente, se caracterizó el gen relacionado al LOC_Os12g40890, codificante para una proteína miembro de la familia Aux/IAA de respuesta temprana a auxinas. A través de búsquedas BLAST se detectaron 22 miembros de dicha familia expresados durante el desarrollo reproductivo de P. notatum. Uno de estos miembros, renombrado como PnIAA30, mostró ser ortólogo a LOC_Os12g40890 (OsIAA30). Los análisis de ligamiento determinaron que una forma alélica de PnIAA30 se encuentra genéticamente ligada al ACL a una distancia de recombinación aproximada de r = 0,30. Sumado a esto, el mapeo in silico de PnIAA30 sobre el borrador del genoma diploide de P. notatum, mostró que una secuencia altamente similar a esta última se posiciona en el mismo supercontig (utg001669l) que las secuencias homólogas a PnANK-TPR3 y a la sonda heteróloga C1069 100% ligada al ACL de P. notatum. Esos resultados marcan una evidencia consistente de que PnIAA30 es el ortólogo de OsIAA30, está efectivamente localizado cerca del ACL y que su disposición génica, la de PnANK-TPR3 y el marcador C1069 en esta región de P. notatum, es colineal con la región del cromosoma 12 de arroz. Por otra parte, los estudios de expresión por qRT-PCR para PnIAA30 mostraron que los transcriptos de este gen están significativamente más expresados durante el desarrollo sexual (Q4188) que el apomíctico (Q4117) al momento de la antesis. Estos resultados se repitieron en cinco individuos (tres sexuales y dos apomícticos) de la población F1 (Q4188 x Q4117). Además, se observó que la expresión de PnIAA30 se asocia negativamente con el grado de expresividad de la aposporía, lo cual está en línea con la teoría del surgimiento de la apomixis como una desregulación en la expresión de los genes involucrados en la vía canónica sexual. Por otro lado, mediante experimentos RT-PCR se determinó que PnIAA30 presenta mayor expresión durante la embriogénesis en el genotipo sexual respecto del apomíctico. Este resultado sugiere que PnIAA30 podría estar relacionado al control del desarrollo del embrión sexual. Experimentos de hibridación in situ de tejidos, mostraron una expresión contrastante entre el genotipo sexual y el apomíctico. PnIAA30 parece estar activo en la CMM del genotipo apomíctico y se expresa fuertemente en la nucela de plantas sexuales. Esta expresión localizada, podría estar relacionada con una diferente regulación de los destinos celulares. En el estadio de antesis, los experimentos de hibridación in situ mostraron que PnIAA30 se sobreexpresa en la nucela, núcleos polares y aparato oosférico del megagametófito del genotipo sexual comparado con el apomíctico, donde la actividad de PnIAA30 es casi imperceptible. Estos últimos resultados señalan un posible rol de PnIAA30 en la señalización involucrada en la partenogénesis. Sumado a eso la red de proteínas interactoras de OsIAA30 determinó una relación directa con factores de transcripción ARFs (Auxin Response Factors) asociados a la megaesporogénesis de arroz, al igual que OsIAA30 ortólogo de PnIAA30. Por otro lado, se identificaron mediante búsquedas BLASTP, nueve proteínas miembros de la superfamilia AP2/ERF expresadas durante el desarrollo reproductivo de P. notatum. Cuatro de estas con elevada homología a miembros representativos del grupo de proteínas BBM (BABY BOOM) pertenecientes al clado euANT y cinco homólogas a miembros del clado euAP2 perteneciente a la familia AP2-like (APETALA2-LIKE). PnAP2-like, ortólogo putativo de APL25 (Oryza sativa) y SiAP2-like (Setaira itálica), presenta un alelo especifico del genotipo materno sexual que cosegrega ligado al modo reproductivo sexual. La identidad de los fragmentos de PnAP2-like amplificados sobre ADN genómico del genotipo sexual y apomíctico, arrojaron homología con una secuencia codificantes AP2-like de Setaria viridis, y dos secuencias TARGE OF EAT3 (TOE3) de Setaria italica y Panicum halli. Los genes TOE son reguladores postrancripcionales y parecen jugar un rol importante en la identidad de los órganos florales, junto a APETALA2 y AGAMOUS. PnBBM-like, mostró una representación posiblemente diferencial entre los transcriptomas de C4-4x (sexual) y Q4117 (apomíctico). El gen PsASGR-BABYBOOM-like fue asociado a la partenogénesis en Pennisetum glaucum (especie apospórica), por lo que podríamos pensar un posible rol de PnBBM-like en la partenogénesis de especies apospóricas como Paspalum notatum. Los resultados obtenidos en esta Tesis permitieron detectar secuencias expresadas durante el desarrollo reproductivo de P. notatum, homólogas a genes correspondientes a la región del cromosoma 12 de arroz sinténica al ACL de la especie bajo estudio. Se detectaron los genes ortólogos de P. notatum y su localización en los genomas diploide y tetraploide. El mapeo in silico sobre el borrador del genoma diploide mostró una colinealidad entre las secuencias de P. notatum y de la región estudiada de arroz. Paralelamente, se pudo demostrar que tanto PnANK-TPR3 como PnIAA30 están regulados diferencialmente durante el desarrollo reproductivo sexual y apomíctico. Por otro lado, se determinó que un alelo de PnAP2-like cosegrega con la sexualidad y que PnBBM-like se encuentra regulado diferencialmente según la base global del transcripto del desarrollo reproductivo de P. notatum. Estos resultados aportan evidencia de que los genes relacionados con la señalización y el crecimiento celular, el metabolismo de hormonas y el desarrollo, localizados en el ACL, presentan una alteración en sus patrones de expresión durante el desarrollo sexual y apomíctico que probablemente derive de la estructura de dicha región genómica y se relacione con el cambio del modo reproductivo sexual al apomíctico.