Examinando por Autor "Menzella, Hugo G."
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Ítem Acceso Abierto An industrial scale process for the enzymatic removal of steryl glucosides from biodiesel(BMC (part of Springer Nature), 2015-12-21) Peirú, Salvador; Aguirre, Andrés; Eberhardt, María Florencia; Braia, Mauricio Javier; Cabrera, Rodolfo; Menzella, Hugo G.Background: Biodiesels produced from transesterification of vegetable oils have a major quality problem due to the presence of precipitates, which need to be removed to avoid clogging of filters and engine failures. These precipitates have been reported to be mostly composed of steryl glucosides (SGs), but so far industrial cost-effective methods to remove these compounds are not available. Here we describe a novel method for the efficient removal of SGs from biodiesel, based on the hydrolytic activity of a thermostable β-glycosidase obtained from Thermococcus litoralis. Results: A steryl glucosidase (SGase) enzyme from T. litoralis was produced and purified from Escherichia coli cultures expressing a synthetic gene, and used to treat soybean-derived biodiesel. Several optimization steps allowed for the selection of optimal reaction conditions to finally provide a simple and efficient process for the removal of SGs from crude biodiesel. The resulting biodiesel displayed filterability properties similar to distilled biodiesel according to the total contamination (TC), the cold soak filtration test (CSFT), filter blocking tendency (FBT), and cold soak filter blocking tendency (CSFBT) tests. The process was successfully scaled up to a 20 ton reactor, confirming its adaptability to industrial settings. Conclusions: The results presented in this work provide a novel path for the removal of steryl glucosides from biodiesel using a cost-effective, environmentally friendly and scalable enzymatic process, contributing to the adoption of this renewable fuel.Ítem Embargo Caracterización del secretoma del microalga Scenedesmus sp. y su participación en la degradación de celulosa(2023) Velázquez, María Belén; Menzella, Hugo G.; Peirú, SalvadorLas microalgas son microorganismos unicelulares o pluricelulares simples, que se extienden por todo el planeta ocupando tanto ecosistemas acuáticos como terrestres. Gracias a esta organización celular sencilla son capaces de vivir en condiciones ambientales adversas y proliferar rápidamente (do Nascimento, 2015). Junto con las cianobacterias, conforman la base de toda la cadena trófica. A pesar de su organización celular simple, tienen un metabolismo complejo, propio de los eucariotas, realizan fotosíntesis, sintetizan polímeros complejos, producen vitaminas y antioxidantes (Potvin, 2010). Las microalgas, especialmente las pertenecientes a las Chlorococales, se han utilizado tradicionalmente para la alimentación de especies acuáticas. En los últimos años, se ha renovado el interés por las mismas debido a su capacidad para producir numerosos compuestos de valor agregado, y al mejor entendimiento de su metabolismo y capacidad de generación de bioestimulantes, biofertilizantes, y biopesticidas en procesos altamente rentables, como la implementación de biorrefinerías. La generación de recursos energéticos renovables y la gestión de residuos son las principales preocupaciones del siglo XXI. Los residuos agrícolas y forestales lignocelulósicos son una materia prima prometedora para la producción de biocombustibles y productos de valor añadido debido a su alta disponibilidad y bajo costo (do Nascimento, 2015). Sin embargo, todavía no se ha publicado ningún proceso comercial para la hidrólisis enzimática de la celulosa. La razón principal es el alto costo de las enzimas necesarias, la baja actividad específica, la susceptibilidad a la inactivación y la dificultad de reciclaje (Potvin, 2010). La línea de investigación del laboratorio en la que se basa este trabajo tiene como objetivo combinar el potencial de crecimiento de las microalgas y su versatilidad, con el aprovechamiento de residuos agroindustriales. En mi trabajo de tesis comenzamos con el aislamiento e identificación de algas nativas del Rio Paraná para utilizarlas como fuente de nuevas enzimas y productos de interés industrial. Para ello, obtuvimos la autorización de la Dirección de Recursos Naturales de la provincia para la toma de muestra y la creación de un banco de microalgas regionales de la provincia de Santa Fe. En la primera recolección de muestras de agua, se aisló una cepa de microalga con actividad degradativa de celulosa, Scenedesmus sp. base de este plan de tesis. Scenedesmus es un género algal ampliamente distribuido en agua dulce, con un tamaño aproximado de 20 µm. Una característica distintiva de dicho género es el crecimiento en grupos (o coenobium) que van desde cuatro a diez o más células unidas. Sus células más externas pueden contener espinas, las cuales son un grupo de soportes largos unidos que permiten que el coenobium flote. Scenedesmus, como otros miembros de los Chlorococcales, contiene altas proporciones de proteínas y lípidos, y posee una excelente capacidad de tratamiento de aguas residuales, secuestro de CO2 y adaptación a condiciones ambientales extremas (Chng., 2016). Actualmente, el género Scenedesmus está siendo explotado eficientemente para obtener bioestimulantes a partir del tratamiento de aguas residuales o de purines de cerdo (Sánchez-Zurano, 2021). Sin embargo, la presencia de celulasas y la capacidad celulolítica de este género de algas es poco conocida. En 1970 Burczyk y colaboradores (Burczyk, 1970), informaron la presencia de celulasas extracelulares en Scenedesmus obliquus. Casi en simultáneo Dvořáková-Hladká (Dvořáková-Hladká, 1971) y colaboradores informaron actividad beta-glucosidasa en S. obliquus, que le permite crecer utilizando celobiosa como sustrato. En 2012, Blifernez-Klassen y colaboradores (Blifernez-Klassen, 2012) informaron que la microalga fotoheterótrofa Chlamydomonas reinhardtii, es capaz de degradar y asimilar celulosa exógena (Gan, 2003). Este interesante hallazgo nos llevó a buscar celulasas en nuestro organismo de estudio. Las celulasas hidrolizan los enlaces β-1,4 glucosídicos del polímero de glucosa por dos vías diferentes, las endoglucanasas cortan posiciones aleatorias a lo largo de la cadena de celulosa, y las exoglucanasas actúan progresivamente sobre los extremos terminales del polímero, liberando moléculas de glucosa, o celobiosa. Finalmente, las moléculas de celobiosa producidas son convertidas en glucosa por las betaglucosidasas intra y extracelulares (EC 3.2.1.21), las celudextrinasas (EC 3.2.1.4) y las celudextrinas fosforilasas (EC 2.4.1.49), dependiendo de las características de cada especie celulolítica (Gan, 2003). Aparte de estar presentes en heterótrofos, las celulasas pertenecientes a la familia de las glicósido hidrolasas (GH9) también se han descrito en plantas superiores. Sin embargo, se ha informado que las celulasas de las plantas participan en la biosíntesis y remodelación de la celulosa más que en su degradación (Imoto, 2005). En este trabajo de tesis se describen los pasos realizados para la identificación del género y especie del organismo en estudio. Resultando un aislamiento de una Scenedesmus que corresponde a una cepa de S. quadricauda que denominamos, S. quadricauda SFE-03. Hemos puesto a punto los parámetros óptimos de crecimiento del alga para la secreción de celulasas a escala de laboratorio. Purificamos las enzimas responsables de esta actividad hidrolítica, y caracterizaremos su eficiencia y estabilidad enzimática en condiciones estándar y ante la adición de compuestos usualmente presentes en la hidrólisis industrial de la lignocelulosa. Hemos probado sustratos naturales (cascarilla de soja, rastrojo de trigo, cascara de girasol) observando actividad sobre los mismos y hemos escalado la producción hasta reactores de 10 litros. Los cultivos líquidos de la cepa nativa de S. quadricauda SFE-03, se crecieron fototróficamente en tres medios distintos: B3N, MM con alto contenido en sal y mixotróficamente en TAP o B3N, añadiendo diferentes fuentes de carbono, en ciclos de luz/oscuridad 12:12 y en oscuridad continua sin burbujeo. Para evaluar las condiciones óptimas para la secreción de celulasa, las algas se cultivaron a diferentes temperaturas (T) y pH, en placas de agar con carboximetilcelulosa (CMC) y celobiosa (CB) al 0.1 % (p/v). El mayor crecimiento de las algas se produjo a un pH igual a 7 en el medio B3N + CB a una temperatura de 24 °C. Por otro lado, al ensayar actividades hidrolíticas frente a distintos sustratos, se obtuvo una actividad mayoritaria en zimogramas y en medio líquido in vitro sobre celobiosa, sugiriendo la presencia de actividad β-glucosidasa en el sobrenadante de nuestra cepa. Se secuenció el genoma y transcriptoma de nuestra cepa nativa mediante secuenciación Illumina Novoseq en la empresa Novogen de Estados Unidos, con una cobertura de 100x y una longitud de fragmentos igual a 350pb de extremos apareados. Luego del análisis y curado de la calidad de las lecturas, realizamos el ensamblado del genoma y el transcriptoma junto con la predicción de productos génicos. Se encontraron 45540 ORF completos en la transcriptómica. Las proteínas fueron predichas con Blast2go (Götz, 2008) y realizamos búsquedas de glucosilhidrolasas de diferentes familias presentes en otros miembros del clado Viridiplantae. Se encontraron homólogos de GH1, GH5, GH9 y GH10. Hemos identificado genes de celulasas (GH1, GH5 y GH9) en la secuencia del genoma de S. quadricauda LWG002611 que no habían sido reportados a la fecha, y de S.quadricauda SFE-03. Además, hemos realizado un análisis bioinformático comparativo en varios genomas de algas Scenedesmaceae disponibles (S. obliquus EN0004 v1.0, S. obliquus UTEX B 3031, S. obliquus var. DOE0013 v1., S. sp. NREL 46B-D3 v1.0, Tetradesmus deserticola SNI-2 v1.0). La mayoría de las secuencias estudiadas presentaban una mayor similitud de secuencia con enzimas de invertebrados, hongos, bacterias y otras microalgas que con celulasas de plantas; y los datos de modelado 3D obtenidos mostraron que tanto las principales estructuras de las proteínas modeladas como los principales residuos de aminoácidos implicados en la catálisis y la unión a sustrato están bien conservados en las enzimas de S. quadricauda SFE-03. Con el propósito de caracterizar la pared de S. quadricauda SFE-03 generamos algas transgénicas de nuestra cepa nativa. Se obtuvieron dos clones de algas transformadas con el plásmido pChlamy_3 (Invitrogen) al que se le clonó la secuencia de direccionamiento a pared de una GP2 de C. reinhardtii (Accession Number CAJ98661.1fusionada a la secuencia de uno de los dominios de unión a almidón de la SSIII del mismo alga, SBD3 (Accession Number DQ019314) y luego de su caracterización morfológica mediante tinciones, microscopía confocal y microscopía electrónica de barrido, se ensayó el contenido de pectinas solubles. Las algas transgénicas obtenidas presentan un tamaño celular mayor que las de tipo salvaje y su relación superficie-volumen se ve afectada; este mayor tamaño favorece su floculación. Además, poseen alterados los componentes de la pared celular, en concreto la capa de pectina, que aumenta la unión entre células formando un conglomerado. Observamos una mayor laxitud de la pared celular y un aumento de aproximadamente tres veces la cantidad de pectinas, hecho que concuerda con el fenotipo obtenido en las plantas transgénicas. El estudio del crecimiento en fotobiorreactores es clave para aumentar la productividad en las microalgas. A finales del año 2021, resulté beneficiada con una beca de investigación con perspectiva de género nacional e internacional de la provincia de Santa Fe, para viajar a Almería España a la mayor planta de producción de biomasa algal en Europa con proyectos financiados por la Unión Europea. La estadía, para completar mi trabajo de tesis doctoral, amplió mi conocimiento en este campo, aún no explotado en Argentina, adquirí los conocimientos necesarios para el manejo y puesta a punto de cultivos a gran escala de microalgas y el manejo de fotobiorreactores, cosechadoras y concentradores industriales. Este trabajo presenta la optimización de un medio de cultivo económico (considerando volúmenes de hasta 12 000 litros) para el crecimiento de Tetraselmis chuii (una cepa recientemente aprobada para consumo humano) considerando una intensidad de luz e inyección de CO2 específicas. Además, para esta alga y Spirulina platensis (Artrospira) y Chlorella vulgaris se estudió la eficiencia fotosintética, a irradiancia fija y variable, así como las cantidades de proteínas, carbohidratos, lípidos y clorofilas en diferentes días de cultivo a escala de laboratorio. El análisis de la eficiencia del transporte de electrones de las tres cepas nos permitió concluir que T. chuii es una buena cepa para el cultivo externo en fotobiorreactores abiertos y además, los rendimientos cuánticos fueron similares a los de C. vulgaris, cepa actualmente utilizada en los mercados actuales. Además, se espera que el rendimiento proteico de esta cepa sea similar al de S. platensis, lo que podría ser de interés, tanto para consumo humano como acuícola o para la obtención de aminoácidos para producir biofertilizantes. Además, como parte de dos experimentos que se estaban llevando a cabo en Almería, se pudo demostrar un gran porcentaje de remoción de la materia orgánica, fosfatos y nitratos presentes en los purines de cerdo, por parte de la cepa de S. almeriensis. Por otro lado, en la puesta a punto del tratamiento de aguas residuales, se demostró un buen crecimiento algal en los reactores raceway de volúmenes de hasta 12000 litros con ese medio de cultivo. En dichos procesos operé los reactores de capa fina de 500 litros de cultivo y raceway, de 12 000 litros totales, realizando las medidas de viabilidad y cantidad de nutrientes de cada uno. En nuestro instituto, se pusieron en marcha dos biorreactores de diseño propio, tipo columnas de 10 y 50 litros, con inyección de CO2, y seguimiento de temperatura, oxígeno disuelto, poder redox y pH por un sistema de arduino programado en CEFOBI.Ítem Acceso Abierto Correction to: Low cost and sustainable hyaluronic acid production in a manufacturing platform based on Bacillus subtilis 3NA strain(Springer, 2021) Cerminati, Sebastián; Leroux, Mélanie; Anselmi, Pablo Ariel; Peirú, Salvador; Alonso, Juan C.; Priem, Bernard; Menzella, Hugo G.Ítem Embargo Desarrollo de fosfolipasas y procesos sustentables para el tratamiento de aceites vegetales(2023) Val, Diego S.; Menzella, Hugo G.; Peirú, SalvadorLa creciente demanda de alimentos y biocombustibles exige a la industria de aceites vegetales tecnologías sustentables para mitigar la contaminación causada por los procesos de refinación química. En las últimas dos décadas, varios métodos enzimáticos han demostrado ser eficientes en la reducción de los residuos generados. Sin embargo, todavía es necesario mejorar la relación costo-beneficio de dichos procesos para lograr la adopción generalizada de estas tecnologías. En particular, el desgomado enzimático con fosfolipasas tipo C (PLCs) es una tecnología innovadora que provee un beneficio económico inmediato, al extraer cantidades adicionales de aceite desgomado. No obstante, las PLCs naturales no son activas en las condiciones en las que operan las plantas de refinación de aceite, por lo que estas necesitan ser modificadas insertando operaciones unitarias adicionales. A pesar de los beneficios evidentes de este proceso amigable con el medio ambiente la necesidad de invertir en equipos previo a su implementación y los gastos operativos asociados al proceso son una barrera para su adopción masiva. Una solución a este desafío podría ser el diseño de enzimas con características especialmente adaptadas a las condiciones físicas en las que operan las plantas actuales de la industria aceitera. En este trabajo de tesis se seleccionaron y analizaron secuencias homólogas a la enzima modelo fosfolipasa C de Bacillus cereus (CePLC) de diferentes fuentes y se eligióun subconjunto de ejemplos para expresar y caracterizar. A continuación, utilizando un conjunto de 13 secuencias homólogas se obtuvo una secuencia no natural (ChPLC) aplicando la estrategia de diseño de secuencia consenso. Las enzimas se expresaron en el hospedador C. glutamicum y se comparó la actividad y estabilidad de las enzimas a distintas temperaturas. La enzima sintética ChPLC exhibió los mejores resultados tanto en parámetros cinéticos como en ensayos de estabilidad térmica en medio acuoso. En ensayos de desgomado en aceite crudo de soja, ChPLC demostró ser eficiente a altas temperaturas. En base a estos resultados se elaboró un análisis de secuencias y modelado estructural que permitió identificar los sitios con mayor probabilidad de ser responsables del aumento de estabilidad. Se demostró experimentalmente que mutaciones puntuales en estos sitios alteran el proceso de desplegado de ChPLC, desestabilizando la enzima consenso. Para que ChPLC sea comercializada en el mercado local e internacional, es necesario producir la enzima a costos competitivos en comparación con las alternativas comerciales actuales. Con este objetivo, se optimizó la producción de ChPLC en cultivos de alta densidad en Corynebacterium glutamicum, el hospedador inicial que se eligió para su producción en el laboratorio, logrando un título de 1,2 g/L. Se demostró mediante un sencillo análisis de costos que los títulos obtenidos en la producción de la enzima en este trabajo doctoral deben mejorarse hasta diez veces para que la producción de la misma sea rentable. A continuación, se demostró que la enzima ChPLC posee la estabilidad térmica y la eficiencia necesarias para establecer un proceso que se ajuste al corto tiempo de residencia y a la alta temperatura que se utiliza en el proceso de desgomado con agua en las plantas de refinación tradicionales. Además, se demostró que con el 60 % de la dosis recomendada para las fosfolipasas comerciales, la enzima sintética genera un 2 % de aceite adicional. En base a estos resultados, y mediante un análisis tecno-económico, se predijo que la enzima ChPLC sería capaz de reducir los costos del desgomado enzimático en un 58 %. Esto proporciona la solución necesaria para promover la adopción global de esta tecnología por parte de refinerías de todos los tamaños sin inversiones de capital. Se espera que esta tecnología tenga especial impacto en mercados como el de nuestro país, donde el 90 % de las refinerías realizan desgomado acuoso. Su implementación en nuestro país generaría 180 mil toneladas de aceite de soja adicionales, con un valor exportable para Argentina superior a los 200 millones de dólares, al precio actual del aceite de soja. El proceso presentado en esta tesis fue concebido para que sea accesible a todos los productores de aceite vegetal, independientemente de su capacidad de procesamiento y ubicación geográfica, trayendo un potencial beneficio anual para la economía global en el rango de mil millones de dólares, considerando únicamente su aplicación en el refinado de aceite de soja.Ítem Acceso Abierto Desarrollo de herramientas para la producción de proteínas recombinantes en Corynebacterium glutamicum(Universidad Nacional de Rosario. Facultad de Ciencias Bioquímicas y Farmacéuticas, 2016-03-04) Ravasi, Pablo; Menzella, Hugo G.El uso de herramientas de biología sintética permite realizar una contribución significativa para el avance de la ingeniería genética, mediante la reducción de los tiempos de desarrollo de organismos recombinantes. Sin embargo, la mayoría de las herramientas de biología sintética has sido obtenidas para E. coli. En este proyecto se ha desarrollado una plataforma para modificar genéticamente de manera rápida un microorganismo de alto interés industrial como C. glutamicum. En este trabajo fue diseñado un vector sintético denominado pTGR, en el cual todos sus componentes se encuentran flanqueados por sitios de restricción únicos. El mismo permite el rápido intercambio de secuencias regulatorias así como la obtención de construcciones que permiten la expresión de varios genes simultáneamente. La plataforma que provee el sistema del pTGR contribuye a la exploración de partes involucradas en la expresión génica y facilita el rápido ensamblado de circuitos genéticos el cual permite realizar ingeniería metabólica en C. glutamicum. El sistema fue validado utilizando genes reporteros para ensayar promotores y RBSs y para el ensamblado de operones duales y clústers que contienen dos unidades transcripcionales. Por otro lado se estudiaron estrategias alternativas, que no dependen de elementos reguladores de la transcripción. En este sentido, se determinó que tanto la variación la concentración del inductor así como el intercambio de orígenes de replicación con distinto número de copias, también pueden ser utilizados como herramientas para regular los niveles de expresión de proteínas recombinantes en C. glutamicum. Utilizando las ventajas que provee la plataforma pTGR se estudiaron distintas secuencias de secreción del sistema Tat en C. glutamicum reportadas en la bibliografía, demostrando que la correspondiente a la proteína PhoD de B. subtilis resultó la más eficiente al momento de secretar el gen reportero mCherry. Además, aprovechando la versatilidad que brinda esta herramienta, se sobre-expresaron los traslocadores de la vía Tat, desde el vector pTGR, demostrando que es posible lograr un aumento de la eficiencia de secreción mediante esta estrategia. A continuación se busco emplear la herramienta genética creada para su utilización en sistemas de expresión de proteínas de interés industrial. Así, se utilizaron diferentes péptidos señales evaluados con el sistema pTGR para expresar y secretar la fosfolipasa C de B. cereus (BC-PLC). Esta enzima es un candidato atractivo para el proceso de desgomado enzimático, de aceites consumibles, debido a su capacidad de degradar fosfolípidos. Durante el refinamiento del aceite los fosfolípidos capturan los triacilglicéridos disminuyendo el rendimiento del proceso. Entre las distintas secuencias señales ensayadas, la salvaje de la BC-PLC que utiliza la vía general Sec, fue la que demostró la mayor eficiencia de secreción. A partir de la misma se obtuvieron 0.12 g/L de enzima en sobrenadante de cultivos en Batch de C. glutamicum. En la última etapa del trabajo con el fin de obtener un proceso industrial económicamente viable para la manufactura de la BC-PLC, se evaluó un proceso de Fed-batch a partir de la cepa de C. glutamicum previamente desarrollada para la producción y secreción de esta enzima. Utilizando un medio semi definido y una estrategia de alimentación con flujos escalonados, se alcanzó una concentración final de 5.5 g/L luego de 55 h de proceso. La misma corresponde a una productividad volumétrica de 0.1 g/L.h, siendo hasta el momento el valor más alto reportado de expresión de una enzima heteróloga en esta especie. Finalmente a partir de ensayos de RMN, se demostró que la enzima recombinante fue capaz de hidrolizar completamente los fosfolípidos mayoritarios del aceite crudo de soja fosfatidilcolina y fosfatidiletanolamina, demostrando su capacidad para el proceso de desgomado enzimático.Ítem Acceso Abierto Desarrollo de un proceso de fermentación para la producción de EGasa1, una enzima capaz de mejorar la calidad del biodiesel(Universidad Nacional de Rosario. Facultad de Ciencias Bioquímicas y Farmacéuticas., 2017-03-16) Eberhardt, María Florencia; Menzella, Hugo G.; Aguirre, AndrésEl biodiesel producido por transesterificación de aceites vegetales tiene un importante problema de calidad debido a la presencia de precipitados insolubles, compuestos en su mayoría por esteril glucósidos (EG). Recientemente nuestro grupo de trabajo ha desarrollado un método enzimático para la eliminación eficiente de los EG del biodiesel, basado en la actividad de una β-glucosidasa de la bacteria Thermococcus litoralis. A partir de estos resultados, el presente trabajo, se basa en la optimización de un sistema de expresión en E. coli de la enzima EGasa1, enzima que hidroliza completamente los estéril glucósidos presentes en el biodiesel, mejorando notablemente su calidad. Se describe el correspondiente proceso de fermentación a alta densidad celular, de un método de recuperación de la enzima EGasa1 y finalmente el tratamiento enzimático de biodiesel. La enzima hidroliza completamente los estéril glucósidos presentes en el biodiesel, mejorando notablemente su calidad. En el primer capítulo se describe la ingenieria de E. coli para obtener una elevada producion específica de la enzima EGasa1. Inicialmente se optimizó el uso de codones del gen sintético egasa1 mediante el software Optimizer y se evaluó la expresión de dicho gen a partir de una biblioteca de promotores con distinta actividad. Los resutados obtenidos permitieron seleccionar al promotor pBAD, a partir del cual se evidenció un aumento del 40% de la actividad obtenida con respeto a la actividad inicial generada desde el promotor T7, a expensas de un inductor económico como la L-arabinosa. Dado que, gran parte de la proteína permanecía en la fracción insoluble, se evaluaron diferentes combinaciones de chaperonas moleculares con la finalidad de mejorar el plegamiento. Entre ellos se seleccionó el sistema GroES-GroEL, el cual permitió incrementar tres veces la actividad final de la enzima en la fracción soluble obtenida en cultivos en lote. El paso siguiente fue optimizar las condiciones de crecimiento. Con este fin se analizaron variaciones en la temperatura y DO600 de inducción y en la concentración de L-Arabinosa. Así, se determinó que los mejores niveles de actividad se obtuvieron cuando la cepa con los plásmidos pGro7 y pKCN-BAD-EGasa1 se indujeron en la fase exponencial de crecimiento con 0,5 g/L de L-arabinosa, a 37ºC. El Capítulo 2 tiene como punto de partida a una cepa capaz de expresar de manera soluble y eficiente la EGasa1, pero con una productividad específica (mg de EGasa1/g PS células) que aún puede ser mejorada. Con lo cual el paso siguiente fue el desarrollo del crecimiento en lote alimentado, el cual permite obtener cultivos de altas densidades celulares (HCDC, high cell density culture). Este proceso permitió incrementar el título del producto (U de EGasa1/ml) y la productividad específica (mg de EGasa1/g PS). Inicialmente se ensayó la construcción de operones que incluyan los genes que codifican para EGasa1, el sistema de chaperonas seleccionado previamente, GroES/EL, junto a genes accesorios (un transportador de glicerol (GlpF) y una enzima clave para la biosíntesis de ácidos nucleídos y aminoácidos (PrsA). La incorporación de estos genes accesorios no contribuyó significativamente a aumentar la actividad EGasa1/ml de cultivo en los ensayos realizados con respecto a la cepa que expresa a las chaperonas desde otro plásmido. Los resultados obtenidos permitieron determinar que la mejor cepa para la producción de EGasa1 a gran escala es la variante que expresa la proteína EGasa1 a partir del plásmido pKCN-BAD-EGasa1, y el sistema de chaperonas GroES-GroEL a partir del plásmido pGro7, los cuales poseen orígenes de replicación compatibles e inducibles por agregado de L-arabinosa. El siguiente objetivo fue seleccionar la fuente de carbono que optimice el rendimiento de los lotes alimentados y disminuya los costos de producción. Los sustratos seleccionados fueron: glucosa, la fuente de carbono preferida para las fermentaciones industriales de E. coli, sacarosa, una materia prima económica proveniente de la caña de azúcar y glicerol, el subproducto más importante de la industria del biodiesel. Para poder utilizar la sacarosa como fuente de carbono, previamente se incorporó el operón metabólico cscAKB a la cepa E. coli BL21 AI. Se obtuvo así la cepa NK5 que crece eficientemente a expensas de sacarosa. Si bien los resultados de las diferentes fermentaciones muestran mayores rendimientos al utilizar glucosa; si se analiza la relación costo/rendimiento, resulta conveniente el uso de glicerol como fuente de carbono para obtener el menor costo de manufactura. El paso siguiente fue modificar el medio salino HM, con la finalidad de obtener un medio más simple y reducir los costos de producción. Para ello se eliminó el extracto de levadura y se reformuló el medio con el fin de minimizar la cantidad de componentes responsables de aportar fosfato, potasio, sodio y nitrógeno, resultando como formulación final: KH2PO4 y NaOH (27,8g/L y 1,32g/L respectivamente). El nitrógeno es aportado por el NH4OH utilizado para mantener en pH 7 el medio a lo largo del proceso de fermentación. En la siguiente etapa del proyecto se buscó determinar las condiciones de post-inducción que permitan obtener la máxima productividad volumétrica (U de EGasa1/ml/h). En primer lugar se analizaron perfiles de post-inducción típicamente utilizados en procesos industriales de producción de enzimas recombinantes: flujo constante 8 g/L/h y 12 g/L/h, flujo lineal (inicial 10 g/L/h, pendiente 0,7 g/L/h2), y un flujo proporcional a la densidad óptica (10 g/L/h para DO=100). Se determinó que el flujo de alimentación más adecuado para producir la enzima EGasa1 a partir de un lote alimentado de E. coli BL21 AI es el constante de 12 g/L/h. Utilizando este flujo se obtiene la mayor productividad (13,7 U/ml/h) luego de 6 horas de inducción a 37ºC. Finalmente se determinó que la relación molar carbono-nitrógeno (C:N) óptima en la solución de alimentación es 5. Con la misma se obtuvo el mayor valor de actividad EGasa1, 466 U/ml. Todos los resultados obtenidos sugieren que las condiciones de fermentación: medio de cultivo, fuente de carbono, método de alimentación post-inducción y relación carbono nitrógeno post inducción son factores importantes que afectan la producción de EGasa1 de E. coli. En en el último capítulo de este trabajo se escaló exitosamente la fermentación a 1000L. También se diseñó el procesamiento de los cultivos y posterior purificación de EGasa1. Para esto se tuvieron en cuenta las características de la enzima: proteína termofílica y asociada a membrana. De esta manera se establecieron las condiciones óptimas de lisis: calentamiento a 80ºC durante 20 minutos, con el agregado de 1% de alcohol láurico etoxilado (7 moles). Finalmente, se determinaron las condiciones de hidrólisis enzimática de EG en biodiesel. Los datos obtenidos permitieron determinar que la temperatura y pH óptimos de hidrólisis fueron 6,75 y 65ºC respectivamente. Se redujo la cantidad de enzima necesaria a 7μg por gramo de biodiesel para la eliminación completa de los EG, y la cantidad de agua utilizada en la hidrólisis al 4,5% del volumen de biodiesel tratado, lo que disminuyó la cantidad de agua residual que se genera. Además, la concentración de iones presentes en el buffer de hidrólisis se redujo, disminuyendo la concentración del buffer fosfato a 10 mM y la del NaCl a 20 mM. El proceso de tratamiento se escaló exitosamente hasta 20 toneladas usando un reactor agitado, en el cual 7g de EGasa1 por tonelada de biodiesel eliminaron por completo las 75 ppm de EG presentes en la muestra en aproximadamente 2 h. Las pruebas de calidad internacionales TC, CSFT, FBT y CSFBT realizadas con el biodiesel tratado con EGasa1 indicaron que la calidad de este biodiesel es comparable a la del biodiesel destilado.Ítem Acceso Abierto Expression of codon optimized genes in microbial systems: current industrial applications and perspectives(Frontiers Media, 2014-02-14) Elena, Claudia; Ravasi, Pablo; Castelli, María Eugenia; Peirú, Salvador ; Menzella, Hugo G.The efficient production of functional proteins in heterologous hosts is one of the major bases of modern biotechnology. Unfortunately, many genes are difficult to express outside their original context. Due to their apparent “silent” nature, synonymous codon substitutions have long been thought to be trivial. In recent years, this dogma has been refuted by evidence that codon replacement can have a significant impact on gene expression levels and protein folding. In the past decade, considerable advances in the speed and cost of gene synthesis have facilitated the complete redesign of entire gene sequences, dramatically improving the likelihood of high protein expression. This technology significantly impacts the economic feasibility of microbial-based biotechnological processes by, for example, increasing the volumetric productivities of recombinant proteins or facilitating the redesign of novel biosynthetic routes for the production of metabolites. This review discusses the current applications of this technology, particularly those regarding the production of small molecules and industrially relevant recombinant enzymes. Suggestions for future research and potential uses are provided as well.Ítem Acceso Abierto Low cost and sustainable hyaluronic acid production in a manufacturing platform based on Bacillus subtilis 3NA strain(Springer, 2021-04-05) Cerminati, Sebastián; Leroux, Mélanie; Anselmi, Pablo Ariel; Peirú, Salvador; Alonso, Juan C.; Priem, Bernard; Menzella, Hugo G.Ítem Acceso Abierto Practical considerations to establish a validated platform for pooled detection of SARS-CoV-2 by droplet digital PCR(Public Library of Science, 2022-11-04) Heckel, Sofía; Pacini, Antonella; Paredes, Franco; Petreli, María Victoria; Perez, Marilina; Adriani, Natalia; Ibarra, Guadalupe; Menzella, Hugo G.; Colaneri, Alejandro; Sesma, Juliana