Caracterización del secretoma del microalga Scenedesmus sp. y su participación en la degradación de celulosa

Las microalgas son microorganismos unicelulares o pluricelulares simples, que se extienden por todo el planeta ocupando tanto ecosistemas acuáticos como terrestres. Gracias a esta organización celular sencilla son capaces de vivir en condiciones ambientales adversas y proliferar rápidamente (do Nascimento, 2015). Junto con las cianobacterias, conforman la base de toda la cadena trófica. A pesar de su organización celular simple, tienen un metabolismo complejo, propio de los eucariotas, realizan fotosíntesis, sintetizan polímeros complejos, producen vitaminas y antioxidantes (Potvin, 2010). Las microalgas, especialmente las pertenecientes a las Chlorococales, se han utilizado tradicionalmente para la alimentación de especies acuáticas. En los últimos años, se ha renovado el interés por las mismas debido a su capacidad para producir numerosos compuestos de valor agregado, y al mejor entendimiento de su metabolismo y capacidad de generación de bioestimulantes, biofertilizantes, y biopesticidas en procesos altamente rentables, como la implementación de biorrefinerías. La generación de recursos energéticos renovables y la gestión de residuos son las principales preocupaciones del siglo XXI. Los residuos agrícolas y forestales lignocelulósicos son una materia prima prometedora para la producción de biocombustibles y productos de valor añadido debido a su alta disponibilidad y bajo costo (do Nascimento, 2015). Sin embargo, todavía no se ha publicado ningún proceso comercial para la hidrólisis enzimática de la celulosa. La razón principal es el alto costo de las enzimas necesarias, la baja actividad específica, la susceptibilidad a la inactivación y la dificultad de reciclaje (Potvin, 2010). La línea de investigación del laboratorio en la que se basa este trabajo tiene como objetivo combinar el potencial de crecimiento de las microalgas y su versatilidad, con el aprovechamiento de residuos agroindustriales. En mi trabajo de tesis comenzamos con el aislamiento e identificación de algas nativas del Rio Paraná para utilizarlas como fuente de nuevas enzimas y productos de interés industrial. Para ello, obtuvimos la autorización de la Dirección de Recursos Naturales de la provincia para la toma de muestra y la creación de un banco de microalgas regionales de la provincia de Santa Fe. En la primera recolección de muestras de agua, se aisló una cepa de microalga con actividad degradativa de celulosa, Scenedesmus sp. base de este plan de tesis. Scenedesmus es un género algal ampliamente distribuido en agua dulce, con un tamaño aproximado de 20 µm. Una característica distintiva de dicho género es el crecimiento en grupos (o coenobium) que van desde cuatro a diez o más células unidas. Sus células más externas pueden contener espinas, las cuales son un grupo de soportes largos unidos que permiten que el coenobium flote. Scenedesmus, como otros miembros de los Chlorococcales, contiene altas proporciones de proteínas y lípidos, y posee una excelente capacidad de tratamiento de aguas residuales, secuestro de CO2 y adaptación a condiciones ambientales extremas (Chng., 2016). Actualmente, el género Scenedesmus está siendo explotado eficientemente para obtener bioestimulantes a partir del tratamiento de aguas residuales o de purines de cerdo (Sánchez-Zurano, 2021). Sin embargo, la presencia de celulasas y la capacidad celulolítica de este género de algas es poco conocida. En 1970 Burczyk y colaboradores (Burczyk, 1970), informaron la presencia de celulasas extracelulares en Scenedesmus obliquus. Casi en simultáneo Dvořáková-Hladká (Dvořáková-Hladká, 1971) y colaboradores informaron actividad beta-glucosidasa en S. obliquus, que le permite crecer utilizando celobiosa como sustrato. En 2012, Blifernez-Klassen y colaboradores (Blifernez-Klassen, 2012) informaron que la microalga fotoheterótrofa Chlamydomonas reinhardtii, es capaz de degradar y asimilar celulosa exógena (Gan, 2003). Este interesante hallazgo nos llevó a buscar celulasas en nuestro organismo de estudio. Las celulasas hidrolizan los enlaces β-1,4 glucosídicos del polímero de glucosa por dos vías diferentes, las endoglucanasas cortan posiciones aleatorias a lo largo de la cadena de celulosa, y las exoglucanasas actúan progresivamente sobre los extremos terminales del polímero, liberando moléculas de glucosa, o celobiosa. Finalmente, las moléculas de celobiosa producidas son convertidas en glucosa por las betaglucosidasas intra y extracelulares (EC 3.2.1.21), las celudextrinasas (EC 3.2.1.4) y las celudextrinas fosforilasas (EC 2.4.1.49), dependiendo de las características de cada especie celulolítica (Gan, 2003). Aparte de estar presentes en heterótrofos, las celulasas pertenecientes a la familia de las glicósido hidrolasas (GH9) también se han descrito en plantas superiores. Sin embargo, se ha informado que las celulasas de las plantas participan en la biosíntesis y remodelación de la celulosa más que en su degradación (Imoto, 2005). En este trabajo de tesis se describen los pasos realizados para la identificación del género y especie del organismo en estudio. Resultando un aislamiento de una Scenedesmus que corresponde a una cepa de S. quadricauda que denominamos, S. quadricauda SFE-03. Hemos puesto a punto los parámetros óptimos de crecimiento del alga para la secreción de celulasas a escala de laboratorio. Purificamos las enzimas responsables de esta actividad hidrolítica, y caracterizaremos su eficiencia y estabilidad enzimática en condiciones estándar y ante la adición de compuestos usualmente presentes en la hidrólisis industrial de la lignocelulosa. Hemos probado sustratos naturales (cascarilla de soja, rastrojo de trigo, cascara de girasol) observando actividad sobre los mismos y hemos escalado la producción hasta reactores de 10 litros. Los cultivos líquidos de la cepa nativa de S. quadricauda SFE-03, se crecieron fototróficamente en tres medios distintos: B3N, MM con alto contenido en sal y mixotróficamente en TAP o B3N, añadiendo diferentes fuentes de carbono, en ciclos de luz/oscuridad 12:12 y en oscuridad continua sin burbujeo. Para evaluar las condiciones óptimas para la secreción de celulasa, las algas se cultivaron a diferentes temperaturas (T) y pH, en placas de agar con carboximetilcelulosa (CMC) y celobiosa (CB) al 0.1 % (p/v). El mayor crecimiento de las algas se produjo a un pH igual a 7 en el medio B3N + CB a una temperatura de 24 °C. Por otro lado, al ensayar actividades hidrolíticas frente a distintos sustratos, se obtuvo una actividad mayoritaria en zimogramas y en medio líquido in vitro sobre celobiosa, sugiriendo la presencia de actividad β-glucosidasa en el sobrenadante de nuestra cepa. Se secuenció el genoma y transcriptoma de nuestra cepa nativa mediante secuenciación Illumina Novoseq en la empresa Novogen de Estados Unidos, con una cobertura de 100x y una longitud de fragmentos igual a 350pb de extremos apareados. Luego del análisis y curado de la calidad de las lecturas, realizamos el ensamblado del genoma y el transcriptoma junto con la predicción de productos génicos. Se encontraron 45540 ORF completos en la transcriptómica. Las proteínas fueron predichas con Blast2go (Götz, 2008) y realizamos búsquedas de glucosilhidrolasas de diferentes familias presentes en otros miembros del clado Viridiplantae. Se encontraron homólogos de GH1, GH5, GH9 y GH10. Hemos identificado genes de celulasas (GH1, GH5 y GH9) en la secuencia del genoma de S. quadricauda LWG002611 que no habían sido reportados a la fecha, y de S.quadricauda SFE-03. Además, hemos realizado un análisis bioinformático comparativo en varios genomas de algas Scenedesmaceae disponibles (S. obliquus EN0004 v1.0, S. obliquus UTEX B 3031, S. obliquus var. DOE0013 v1., S. sp. NREL 46B-D3 v1.0, Tetradesmus deserticola SNI-2 v1.0). La mayoría de las secuencias estudiadas presentaban una mayor similitud de secuencia con enzimas de invertebrados, hongos, bacterias y otras microalgas que con celulasas de plantas; y los datos de modelado 3D obtenidos mostraron que tanto las principales estructuras de las proteínas modeladas como los principales residuos de aminoácidos implicados en la catálisis y la unión a sustrato están bien conservados en las enzimas de S. quadricauda SFE-03. Con el propósito de caracterizar la pared de S. quadricauda SFE-03 generamos algas transgénicas de nuestra cepa nativa. Se obtuvieron dos clones de algas transformadas con el plásmido pChlamy_3 (Invitrogen) al que se le clonó la secuencia de direccionamiento a pared de una GP2 de C. reinhardtii (Accession Number CAJ98661.1fusionada a la secuencia de uno de los dominios de unión a almidón de la SSIII del mismo alga, SBD3 (Accession Number DQ019314) y luego de su caracterización morfológica mediante tinciones, microscopía confocal y microscopía electrónica de barrido, se ensayó el contenido de pectinas solubles. Las algas transgénicas obtenidas presentan un tamaño celular mayor que las de tipo salvaje y su relación superficie-volumen se ve afectada; este mayor tamaño favorece su floculación. Además, poseen alterados los componentes de la pared celular, en concreto la capa de pectina, que aumenta la unión entre células formando un conglomerado. Observamos una mayor laxitud de la pared celular y un aumento de aproximadamente tres veces la cantidad de pectinas, hecho que concuerda con el fenotipo obtenido en las plantas transgénicas. El estudio del crecimiento en fotobiorreactores es clave para aumentar la productividad en las microalgas. A finales del año 2021, resulté beneficiada con una beca de investigación con perspectiva de género nacional e internacional de la provincia de Santa Fe, para viajar a Almería España a la mayor planta de producción de biomasa algal en Europa con proyectos financiados por la Unión Europea. La estadía, para completar mi trabajo de tesis doctoral, amplió mi conocimiento en este campo, aún no explotado en Argentina, adquirí los conocimientos necesarios para el manejo y puesta a punto de cultivos a gran escala de microalgas y el manejo de fotobiorreactores, cosechadoras y concentradores industriales. Este trabajo presenta la optimización de un medio de cultivo económico (considerando volúmenes de hasta 12 000 litros) para el crecimiento de Tetraselmis chuii (una cepa recientemente aprobada para consumo humano) considerando una intensidad de luz e inyección de CO2 específicas. Además, para esta alga y Spirulina platensis (Artrospira) y Chlorella vulgaris se estudió la eficiencia fotosintética, a irradiancia fija y variable, así como las cantidades de proteínas, carbohidratos, lípidos y clorofilas en diferentes días de cultivo a escala de laboratorio. El análisis de la eficiencia del transporte de electrones de las tres cepas nos permitió concluir que T. chuii es una buena cepa para el cultivo externo en fotobiorreactores abiertos y además, los rendimientos cuánticos fueron similares a los de C. vulgaris, cepa actualmente utilizada en los mercados actuales. Además, se espera que el rendimiento proteico de esta cepa sea similar al de S. platensis, lo que podría ser de interés, tanto para consumo humano como acuícola o para la obtención de aminoácidos para producir biofertilizantes. Además, como parte de dos experimentos que se estaban llevando a cabo en Almería, se pudo demostrar un gran porcentaje de remoción de la materia orgánica, fosfatos y nitratos presentes en los purines de cerdo, por parte de la cepa de S. almeriensis. Por otro lado, en la puesta a punto del tratamiento de aguas residuales, se demostró un buen crecimiento algal en los reactores raceway de volúmenes de hasta 12000 litros con ese medio de cultivo. En dichos procesos operé los reactores de capa fina de 500 litros de cultivo y raceway, de 12 000 litros totales, realizando las medidas de viabilidad y cantidad de nutrientes de cada uno. En nuestro instituto, se pusieron en marcha dos biorreactores de diseño propio, tipo columnas de 10 y 50 litros, con inyección de CO2, y seguimiento de temperatura, oxígeno disuelto, poder redox y pH por un sistema de arduino programado en CEFOBI.