Desarrollo de fosfolipasas y procesos sustentables para el tratamiento de aceites vegetales

La creciente demanda de alimentos y biocombustibles exige a la industria de aceites vegetales tecnologías sustentables para mitigar la contaminación causada por los procesos de refinación química. En las últimas dos décadas, varios métodos enzimáticos han demostrado ser eficientes en la reducción de los residuos generados. Sin embargo, todavía es necesario mejorar la relación costo-beneficio de dichos procesos para lograr la adopción generalizada de estas tecnologías. En particular, el desgomado enzimático con fosfolipasas tipo C (PLCs) es una tecnología innovadora que provee un beneficio económico inmediato, al extraer cantidades adicionales de aceite desgomado. No obstante, las PLCs naturales no son activas en las condiciones en las que operan las plantas de refinación de aceite, por lo que estas necesitan ser modificadas insertando operaciones unitarias adicionales. A pesar de los beneficios evidentes de este proceso amigable con el medio ambiente la necesidad de invertir en equipos previo a su implementación y los gastos operativos asociados al proceso son una barrera para su adopción masiva. Una solución a este desafío podría ser el diseño de enzimas con características especialmente adaptadas a las condiciones físicas en las que operan las plantas actuales de la industria aceitera. En este trabajo de tesis se seleccionaron y analizaron secuencias homólogas a la enzima modelo fosfolipasa C de Bacillus cereus (CePLC) de diferentes fuentes y se eligióun subconjunto de ejemplos para expresar y caracterizar. A continuación, utilizando un conjunto de 13 secuencias homólogas se obtuvo una secuencia no natural (ChPLC) aplicando la estrategia de diseño de secuencia consenso. Las enzimas se expresaron en el hospedador C. glutamicum y se comparó la actividad y estabilidad de las enzimas a distintas temperaturas. La enzima sintética ChPLC exhibió los mejores resultados tanto en parámetros cinéticos como en ensayos de estabilidad térmica en medio acuoso. En ensayos de desgomado en aceite crudo de soja, ChPLC demostró ser eficiente a altas temperaturas. En base a estos resultados se elaboró un análisis de secuencias y modelado estructural que permitió identificar los sitios con mayor probabilidad de ser responsables del aumento de estabilidad. Se demostró experimentalmente que mutaciones puntuales en estos sitios alteran el proceso de desplegado de ChPLC, desestabilizando la enzima consenso. Para que ChPLC sea comercializada en el mercado local e internacional, es necesario producir la enzima a costos competitivos en comparación con las alternativas comerciales actuales. Con este objetivo, se optimizó la producción de ChPLC en cultivos de alta densidad en Corynebacterium glutamicum, el hospedador inicial que se eligió para su producción en el laboratorio, logrando un título de 1,2 g/L. Se demostró mediante un sencillo análisis de costos que los títulos obtenidos en la producción de la enzima en este trabajo doctoral deben mejorarse hasta diez veces para que la producción de la misma sea rentable. A continuación, se demostró que la enzima ChPLC posee la estabilidad térmica y la eficiencia necesarias para establecer un proceso que se ajuste al corto tiempo de residencia y a la alta temperatura que se utiliza en el proceso de desgomado con agua en las plantas de refinación tradicionales. Además, se demostró que con el 60 % de la dosis recomendada para las fosfolipasas comerciales, la enzima sintética genera un 2 % de aceite adicional. En base a estos resultados, y mediante un análisis tecno-económico, se predijo que la enzima ChPLC sería capaz de reducir los costos del desgomado enzimático en un 58 %. Esto proporciona la solución necesaria para promover la adopción global de esta tecnología por parte de refinerías de todos los tamaños sin inversiones de capital. Se espera que esta tecnología tenga especial impacto en mercados como el de nuestro país, donde el 90 % de las refinerías realizan desgomado acuoso. Su implementación en nuestro país generaría 180 mil toneladas de aceite de soja adicionales, con un valor exportable para Argentina superior a los 200 millones de dólares, al precio actual del aceite de soja. El proceso presentado en esta tesis fue concebido para que sea accesible a todos los productores de aceite vegetal, independientemente de su capacidad de procesamiento y ubicación geográfica, trayendo un potencial beneficio anual para la economía global en el rango de mil millones de dólares, considerando únicamente su aplicación en el refinado de aceite de soja.