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Ítem Acceso Abierto A conditional mutant of the fatty acid synthase unveils unexpected cross talks in mycobacterial lipid metabolism(Royal Society, 2017-02-22) Cabruja, Matías Ezequiel; Mondino, Sonia Soledad; Tsai, Yi-Ting; Lara, María Julia; Gramajo, Hugo Cesar; Gago, GabrielaÍtem Acceso Abierto Caracterización de la actividad ácido fosfatídico fosfatasa y su relevancia en la síntesis de triacilglicéridos en micobacterias(2020) Crotta Asis, Agostina; Gago, GabrielaLa tuberculosis continúa siendo la enfermedad infecciosa que provoca la mayor cantidad de muertes entre los adultos. Mycobacterium tuberculosis es el agente etiológico de esta enfermedad y el éxito de este patógeno se debe en gran medida a su notable capacidad para sobrevivir en el huésped infectado, donde puede persistir durante varias décadas. Las células huésped primarias del bacilo de la tuberculosis son los macrófagos pulmonares. En ellas, se replica activamente las primeras semanas de infección, hasta que la respuesta del sistema inmune surte efecto y ayuda al organismo a controlar la proliferación del patógeno. El reclutamiento continuo de linfocitos en el sitio de infección junto con la muerte de los macrófagos infectados lleva a la formación de una compleja estructura con una arquitectura muy organizada que es la característica distintiva de la infección con M. tuberculosis: el granuloma. M. tuberculosis puede persistir décadas dentro del granuloma, en un estado de dormancia referido como latencia. Una de las características más distintivas del granuloma es la presencia alrededor de la lesión de una población específica de macrófagos enriquecida en gotas lipídicas y conocidos como macrófagos espumosos. Dentro de estos macrófagos, M. tuberculosis disminuye su tasa de multiplicación y acumula inclusiones lipídicas intracitoplasmáticas en su propio citoplasma que consisten principalmente de triacilglicéridos. A pesar de la relevancia de este proceso, los mecanismos por los cuales M. tuberculosis induce la diferenciación de estos macrófagos espumosos y mediante los cuales puede acumular inclusiones lipídicas en su citoplasma dentro de las células infectadas todavía no se conocen. En parte, esto se debe al limitado conocimiento de la red de regulación involucrada en el mantenimiento de la homeostasis lipídica en micobacterias, particularmente a la regulación de la biosíntesis de triacilglicéridos en este género. Con el fin de elucidar el rol del paso enzimático clave que gobierna la decisión de M. tuberculosis de sintetizar triacilglicerol y, por lo tanto, enlentecer su crecimiento y entrar en el estado de dormancia, en este trabajo de tesis decidimos explorar el rol de las enzimas ácido fosfatídico fosfatasa (PAP). Las mismas son las encargadas de catalizar la formación de diacilglicerol, primera reacción específicamente dedicada a la síntesis de triacilglicéridos, sugiriendo un rol clave para la enzima PAP en la regulación del flujo del ácido fosfatídico hacia la síntesis de triacilglicéridos o de fosfolípidos de membrana. Utilizando a Mycobacterium smegmatis como modelo de estudio, trabajamos bajo la hipótesis de que enzimas ácido fosfatídico fosfatasas de tipo 2 (PAP2) serían responsables de defosforilar al intermediario ácido fosfatídico y generar así el diacilglicerol necesario para la síntesis de triacilglicéridos. A través de análisis informáticos fuimos capaces de identificar dos putativas proteínas con actividad PAP y estudios posteriores revelaron que ambas eran capaces de defosforilar ácido fosfatídico in vivo. A su vez, se construyeron cepas mutantes simples en ambos genes y una mutante doble y se analizó el crecimiento de éstas en distintas condiciones. El análisis de la composición lipídica de cada una estas cepas reveló que sólo la ausencia de las dos proteínas lleva a una reducción de los niveles de triacilglicerol cuando las densidades ópticas alcanzadas son bajas, equiparándose con los niveles de la cepa salvaje a densidades ópticas mayores. Estudios de crecimiento en forma de biofilm, ya sea como macrocolonias o como películas en interfaz líquido-aire, revelaron que la cepa doble mutante tiene afectada la capacidad de formar biofilm y este defecto se debe en parte a un cambio en la composición de la envoltura, en particular en la relación entre los ácidos micólicos (MAMES) y los metilésteres de ácidos grasos (FAMES). Fenotipos intermedios se observaron en las mutantes simples. Finalmente, ensayos de proteómica mostraron que existe un reordenamiento metabólico para suplir la ausencia de estas enzimas con el objetivo de mantener la producción de triacilglicéridos bajo condiciones de estrés. Cabe destacar que en este trabajo también se identificó una putativa enzima PAP en M. tuberculosis, la cual fue capaz de catalizar la defosforilación del ácido fosfatídico in vivo. A partir de los resultados obtenidos, hipotetizamos que, para sortear la ausencia de las enzimas PAP, podrían ocurrir una o más de estas situaciones en paralelo: (1) la sobreexpresión de la vía del glioxilato redirigiría el flujo del carbono hacia la síntesis de compuestos de reserva; (2) el MDAG podría estar siendo reciclado como fuente de diacilglicerol para la síntesis de triacilglicéridos explicando así la disminución de los ácidos micólicos y el fenotipo en la formación de biofilm; (3) y finalmente, el reciclado de fosfolípidos. Estos resultados dan cuenta de la relevancia que tiene la síntesis de triacilglicéridos en las micobacterias. Sin embargo, más estudios son necesarios para poder conectar la síntesis de triacilglicéridos con el reciclado de componentes de la envoltura celular como fosfolípidos y ácidos micólicos y lograr comprender de qué manera las micobacterias pueden obtener diacilglicerol para la síntesis de compuestos de reserva.Ítem Acceso Abierto Caracterización de los factores involucrados en la regulación del sistema FAS-I de micobacterias(Universidad Nacional de Rosario. Facultad de Ciencias Bioquímicas y Farmacéuticas., 2018-11-30) Cabruja, Matías Ezequiel; Gago, Gabriela; Gramajo, Hugo CesarLa tuberculosis continúa siendo una de las enfermedades infecciosas que provoca la mayor cantidad de muerte entre los adultos. Mycobacterium tuberculosis es el agente etiológico de la tuberculosis y el éxito de este patógeno se debe en gran medida a su notable capacidad para sobrevivir en el huésped infectado, donde puede persistir durante varias décadas; siendo su inusual pared celular un factor clave en esta supervivencia. Los ácidos micólicos (MA) son los componentes mayoritarios de su envoltura celular y los responsables de muchas de las características de esta bacteria, como ser, su patogenicidad y su alta resistencia a los antibióticos comúnmente utilizados en la clínica. La biosíntesis de los MA involucra dos sintasas de ácidos grasos (FAS) diferentes, denominadas FAS-I y FAS-II. A pesar de la relevancia de la co-existencia de los dos sistemas (FAS-I y FAS-II) en micobacterias, tanto por su rol en la síntesis de los MA y ácidos grasos (FA) de membrana y lípidos de reserva, como por ser el blanco de poderosas drogas antituberculosas, es muy poco lo que se sabe acerca de cómo se regula el funcionamiento de estas dos rutas biosintéticas. Es por esto que se en esta tesis se desarrollaron dos métodos utilizando LC-MS para analizar por un lado el perfil de acil-CoAs, metabolitos intermediarios en la síntesis de lípidos, y por otro un estudio detallado de los lípidos totales en micobacterias. Estas herramientas permitieron al laboratorio analizar en profundidad distintas mutantes en el sistema lipídico en micobacterias. Además, utilizando a M. smegmatis como modelo de estudio, se construyó en el laboratorio una mutante condicional en el gen fas para poder reducir los niveles de esta enzima y estudiar así la interacción entre los dos sistemas FAS. Al observarse que, a pesar de la expresión del sistema FAS-I encontrarse reducida, la producción de MA en la mutante condicional no se encontraba inhibida, decidimos analizar en profundidad el metabolismo lipídico en estas condiciones utilizando las herramientas desarrolladas. De esta manera, junto con un análisis de proteómica de cuantitativa de la mutante condicional, se pudo determinar los efectos de la depleción parcial del sistema FAS-I en el metabolismo lipídico general en M. smegmatis y de esta manera inferir como ambos sistemas FAS se encuentran co-regulados. Estos resultados ayudarán a entender la regulación involucrada en el mantenimiento de la homeostasis lipídica en micobacterias, la cual creemos que proveerá nuevas herramientas para desarrollar nuevos agentes antimicobacterianos.Ítem Embargo Caracterización del rol fisiológico de la enzima FabH en micobacterias: impacto en la síntesis de lípidos y viabilidad(2024) Savoretti, Franco; Gago, GabrielaLa tuberculosis continúa siendo una de las enfermedades infecciosas que provoca la mayor cantidad de muertes entre los adultos a nivel mundial. Mycobacterium tuberculosis es el agente etiológico de la tuberculosis y el éxito de este patógeno se debe en gran medida a su notable capacidad para sobrevivir en el huésped infectado, donde puede persistir durante varias décadas; siendo su inusual pared celular un factor clave en esta supervivencia. Los ácidos micólicos son los componentes mayoritarios de su envoltura celular y aportan a las características distintivas de esta bacteria, como son, su patogenicidad y su alta resistencia a los antibióticos comúnmente utilizados en la clínica. La biosíntesis de los ácidos micólicos involucra dos sintasas de ácidos grasos (FAS) diferentes, denominadas FAS I y FAS II. FAS I realiza la síntesis de novo de ácidos grasos, mientras que el sistema FAS II elonga los productos de FAS I. El producto del sistema FAS II es el meromicolil-ACP, uno de los sustratos utilizados para la síntesis de ácidos micólicos. Mediante una reacción de condensación entre el meromicolil-ACP y un acil-CoA producido por el sistema FAS I se forman los ácidos micólicos. Los componentes de esta vía han sido estudiados en profundidad no sólo por su relevancia para la síntesis de los ácidos micólicos, ácidos grasos de membrana, lípidos de reserva y lípidos complejos, sino también por ser el blanco de las principales drogas antituberculosas utilizadas para combatir la enfermedad. Sin embargo, aún hay componentes de esta vía que no han sido descriptos en profundidad. Este es el caso del paso metabólico que conecta a ambos sistemas FAS, es decir, la introducción de los productos del sistema FAS I en la vía FAS II. Es por esto que en esta tesis nos centramos en el estudio del rol fisiológico de la enzima FabH. Esta enzima es la única postulada hasta el momento con el rol de interconectar a los sistemas FAS. FabH cataliza una reacción de condensación entre un acil-CoA, producido por el sistema FAS I, con malonil-ACP para dar lugar a un βcetoacil-ACP. El producto de reacción de la enzima FabH inicia la síntesis en el sistema FAS II, por lo tanto, el rol postulado para FabH sería tomar los productos de FAS I para introducirlos e iniciar la síntesis en el sistema FAS II. Luego de varios ciclos de elongación en el sistema FAS II se da lugar a la cadena meromicolato, que junto con un acil-CoA proveniente del sistema FAS I, dan lugar a los ácidos micólicos. Por lo tanto, la enzima FabH tiene un rol clave en la síntesis de los ácidos micólicos, siendo un punto de unión entre ambos sistemas FAS. La función de la enzima FabH fue estudiada previamente por otros grupos de investigación mediante ensayos in vitro y también mediante la obtención de la estructura cristalográfica de la proteína unida a su sustrato. Sin embargo, hasta el momento no se ha estudiado in vivo el rol de FabH en la síntesis de ácidos micólicos. Por esta razón, en esta tesis construimos una cepa mutante ΔfabH en la cepa avirulenta Mycobacterium tuberculosis H37Ra. Confirmamos que la enzima FabH tiene un rol en la síntesis de ácidos micólicos, que se evidenció como una leve disminución en la síntesis de ácidos micólicos en la cepa ΔfabH. Además, la cepa ΔfabH es más sensible que la cepa salvaje al estrés ácido en medio sólido y líquido y a los compuestos isoniacida y cerulenina en medio sólido. No obstante, el gen no resultó ser esencial para el crecimiento de M. tuberculosis H37Ra in vitro y a pesar de la leve disminución observada en la síntesis de ácidos micólicos, la cepa mutante fue capaz de sintetizar estos componentes clave de la envoltura. Este resultado indicaría que existiría una vía o proteína alternativa a FabH capaz de iniciar la síntesis de la cadena meromicolato en el sistema FAS II que permite sostener la síntesis de ácidos micólicos. Para responder a esta hipótesis, realizamos un experimento de proteómica cuantitativa mediante LC-MS/MS, con el objetivo de identificar alguna proteína o vía cuya expresión se viera alterada en la cepa ΔfabH. En este ensayo encontramos que los niveles de la proteína EchA6 estaban aumentados 3.6 veces en la cepa ΔfabH. En un reporte previo realizado por otro grupo de investigación, se demostró que una cepa mutante en echA6 resultó ser deficiente en la síntesis de ácidos micólicos. Además, mediante doble híbrido se vio que EchA6 interacciona con KasA, una enzima del sistema FAS II, y que es capaz de unir acil-CoAs de cadena larga, el mismo sustrato que utiliza la enzima FabH. La combinación de nuestros resultados con este reporte nos condujo a hipotetizar que la enzima KasA podría tomar acil-CoAs de EchA6, de manera alternativa a su sustrato natural los acilAcpM, y de esta manera iniciar la síntesis en el sistema FAS II. En el análisis proteómico también encontramos que varias enzimas relevantes para la síntesis de lípidos complejos y triacilglicéridos se encontraron disminuidas en la cepa ΔfabH, sugiriendo un reordenamiento en el metabolismo de lípidos más global. Entre estas se encuentran cuatro enzimas triacilglicérido sintasa y cinco enzimas (MbtC, FadD26, FadD29, FadD21, y Ag85B) involucradas en la síntesis de distintos lípidos complejos, importantes tanto para la composición de la envoltura como para la patogenicidad de M. tuberculosis. La cepa ΔfabH posee alteraciones fenotípicas, como son la mayor sensibilidad al estrés ácido y la leve disminución en la síntesis de ácidos micólicos. Además, en el análisis proteómico se vio una disminución en la abundancia de enzimas implicadas en la síntesis de lípidos importantes para la patogenicidad. Por todo esto, creemos que una cepa mutante ΔfabH en M. tuberculosis H37Rv es una excelente candidata para la obtención de una cepa atenuada para la virulencia. Para evaluar si la proteína EchA6 tiene un rol en la síntesis de ácidos micólicos, utilizando la herramienta CRISPRi construimos las cepas echA6KD y ΔfabH-echA6KD, en las cuales los niveles de expresión de echA6 son reprimidos ante el agregado de anhidrotetraciclina. En primer lugar, observamos que EchA6 no es esencial para la viabilidad de M. tuberculosis H37Ra, a diferencia de lo reportado para la proteína de M. bovis BCG. Además, al analizar la síntesis de ácidos micólicos en ambas cepas mediante cromatografía en capa delgada, pudimos concluir que la proteína EchA6 no estaría implicada en la síntesis de ácidos micólicos en M. tuberculosis H37Ra en las condiciones estudiadas. Por lo tanto, a pesar de los esfuerzos realizados en este trabajo de tesis por buscar algún mecanismo alternativo a FabH por el cual se inicie la síntesis de la cadena meromicolato en el sistema FAS II, esta pregunta aún continúa abierta. A pesar de que los componentes de los sistemas FAS I y FAS II están ampliamente estudiados, la interconexión entre estos dos sistemas aún no está totalmente descripta. Además, la leve disminución observada para la síntesis de ácidos micólicos en la cepa ΔfabH no corresponde con el rol que se le asigna a FabH, como la única enzima que interconecta a los sistemas FAS I y FAS II. A partir de los resultados de esta tesis podemos concluir entonces que aún existen componentes no identificados en el modelo de síntesis de ácidos micólicos y, por lo tanto, es necesario profundizar los estudios respecto al mecanismo que interconecta ambos sistemas FAS para coordinar la síntesis de ácidos grasos y ácidos micólicos.Ítem Acceso Abierto Caracterización molecular de los factores involucrados en la regulación de la biosíntesis de ácidos micólicos en Mycobacterium tuberculosis(Universidad Nacional de Rosario. Facultad de Ciencias Bioquímicas y Farmacéuticas., 2017-03-30) Lara, María Julia; Gramajo, Hugo Cesar; Gago, GabrielaLa tuberculosis continúa siendo una de las enfermedades infecciosas que provoca la mayor cantidad de muerte entre los adultos. Mycobacterium tuberculosis es el agente etiológico de la tuberculosis y el éxito de este patógeno se debe en gran medida a su notable capacidad para sobrevivir en el huésped infectado, donde puede persistir durante varias décadas; siendo su inusual pared celular un factor clave en esta supervivencia. Los ácidos micólicos son los componentes mayoritarios de su envoltura celular y los responsables de muchas de las características de esta bacteria, como ser, su patogenicidad y su alta resistencia a los antibióticos comúnmente utilizados en la clínica. La biosíntesis de los ácidos micólicos involucra dos sintasas de ácidos grasos diferentes, denominadas FAS I y FAS II. A pesar de la relevancia de la co-existencia de los dos sistemas (FAS I y FAS II) en micobacterias, tanto por su rol en la síntesis de los ácidos grasos de membrana y de los ácidos micólicos, como por ser el blanco de poderosas drogas antituberculosas, es muy poco lo que se sabe acerca de cómo se regula el funcionamiento de estas dos rutas biosintéticas y cuáles serían las señales regulatorias que permiten la correcta interacción entre ambos sistemas metabólicos. En nuestro laboratorio nos propusimos estudiar cómo se regulan a nivel transcripcional los sistemas de síntesis de ácidos grasos y ácido micólicos en micobacterias y caracterizar cuál es la señal a la cual responden. Es así que se ha caracterizado un factor transcripcional de M. tuberculosis denominado FasR (Fatty acid synthase Regulator), al que llamamos FasRMT. Se determinó que esta proteína es un activador transcripcional esencial para la síntesis de ácidos grasos en Mycobacterium smegmatis, y que regula la expresión de los genes del operón fas-acpS mediante su unión a la región promotora de ese operón. De esta manera modula la biosíntesis de novo de ácidos grasos, cuyo destino final son los fosfolípidos de membrana y los triacilglicéridos, como así también los sustratos del sistema FAS II para producir los ácidos micólicos. Además, a partir de una mutante de FasRMT en M. tuberculosis, se ha demostrado que la disminución de FasRMT genera una cepa notablemente afectada en su virulencia. Los resultados de dicha investigación representaron la caracterización de un regulador clave en M. tuberculosis y sentaron las bases para el desarrollo del trabajo de tesis aquí presentado. En este trabajo se presentan los resultados de los experimentos biofísicos y moleculares llevados a cabo para el análisis de la interacción entre FasRMT y las señales regulatorias a las cuales responde por unión específica y directa, los acil-CoA de cadena larga, y la región del ADN que reconoce en el promotor del operón fas-acpS. Además, se validó el modelo de regulación transcripcional propuesto para esta proteína mediante análisis de transcripción in vitro. Se resolvió la estructura tridimensional de una forma truncada del activador transcripcional de la síntesis de ácidos grasos, FasR33MT, como así también la estructura de FasR33MT en presencia de una de sus moléculas ligando, C20-CoA. A partir de la resolución de estas estructuras, se llevó a cabo el análisis de las mismas para comenzar a comprender los mecanismos moleculares por los cuales la proteína FasRMT modula su actividad. Aún no podemos precisar en detalle cuáles son los cambios que se producen sobre FasRMT y cómo se propagan a partir de la unión al ligando para modular su afinidad por el ADN específico. Sin embargo, se observan características asociadas a la unión del ligando que apoyan un modelo mecanístico de acuerdo al cual, la unión de moléculas de acil-CoA de cadena larga en un túnel hidrofóbico de la proteína desestabilizan la unión de FasRMT al ADN. Considerando que este regulador es esencial para la sobrevida de Mycobacterium, la resolución de la estructura tridimensional de esta proteína permite iniciar la búsqueda y el diseño racional de inhibidores que actúen como nuevos agentes antimicobacterianos.Ítem Embargo Caracterización y análisis de los componentes involucrados en la regulación transcripcional de la síntesis de ácidos micólicos en micobacterias(Universidad Nacional de Rosario. Facultad de Ciencias Bioquímicas y Farmacéuticas., 2018-02-28) Tsai, Yi-Ting; Gramajo, Hugo Cesar; Gago, GabrielaLa tuberculosis (TB) es una enfermedad infecciosa causada por Mycobacterium tuberculosis y se ha convertido en una emergencia sanitaria en los últimos años provocando más de un millón de muertes al año. El éxito de M. tuberculosis como patógeno se debe en gran medida a su notable capacidad de evadir las respuestas inmunes del húesped y así sobrevivir en el individuo infectado. Para ello, M. tuberculosis ha desarrollado un amplio espectro de lípidos específicos que interactúan activamente con el sistema inmune receptor, entre los cuales podemos mencionar a los ácidos micólicos, uno de los principales lípidos bioactivos presentes en la pared celular de esta bacteria, el cual es esencial para su viabilidad y crucial para su patogenidad. Se sabe que la isoniazida (INH), uno de los fármacos más utilizados para el tratamiento de la TB actúa inhibiendo la biosíntesis de los ácidos micólicos, llevada a cabo por la acción concertada de dos sistemas de sintasa de ácidos grasos presentes en las micobacterias (FAS-I y FAS-II). El sistema FAS-I está involucrado en la biosíntesis de novo de ácidos grasos, liberando acil-CoAs como productos de condensación. Estos compuestos sirven como sustratos para la biosíntesis de los fosfolípidos de la membrana plasmática y los triacilglicéridos de reserva, o pueden ser tomados por el sistema FAS-II para la biosíntesis de ácidos micólicos. Por lo tanto, una correcta interacción entre los dos sistemas FAS sería de vital importancia para las micobacterias a fin de mantener la homeostasis lipídica estrictamente regulada. Los componentes genéticos del sistema FAS-II han sido identificados en M. tuberculosis y se encuentran agrupados en tres unidades transcripcionales principales: fabD-acpM-kasA-kasB (operón fasII), mabA-inhA y hadA-hadB-hadC. Estudios de microarreglos demostraron que el tratamiento de M. tuberculosis con diversos antibióticos que afectan la síntesis de ácidos micólicos, inducen la transcripción de los genes de operón fasII. Esta información condujo a nuestro grupo de investigación a la búsqueda de reguladores transcripcionales que pudieran estar involucrados en la regulación de la homeostasis lipídica de las micobacterias. De esta manera, utilizando el microorganismo modelo M. smegmatis nuestro laboratorio descubrió dos reguladores transcripcionales que controlan el metabolismo lipídico: FasR, un regulador transcripcional que activa el operón que codifica para la enzima FAS-I y MabR, un segundo regulador transcripcional que regula específicamente la expresión del operón fasII. Ambos reguladores mostraron ser esenciales para la viabilidad de las micobacterias, sugiriendo que una regulación estricta del metabolismo lipídico sería fundamental para el desarrollo normal de estas bacterias. Con el fin de profundizar en la caracterización de la red reguladora involucrada en el mantenimiento de la homeostasis lipídica micobacteriana, en este trabajo de tesis construímos un mutante condicional en el gen mabR y demostramos que la presencia de niveles sub-fisiológicos de este regulador transcripcional conduce a una disminución en la expresión del operón fasII, lo cual nos permitió determinar el rol de MabR como activador transcripcional de dicho operón. Esta disminución en la expresión de MabR se tradujo a su vez en una clara inhibición de la biosíntesis de los ácidos micólicos y una merma en el contenido celular de lípidos complejos que contienen residuos de ácidos micólicos. Además, se observó un aumento notable en el porcentaje de fosfatidil inositol en la membrana plasmática. Todos estos resultados respaldan una activa comunicación entre los dos sistemas FAS. También demostramos que la activación del operón fasII ante el tratamiento con INH es dependiente de MabR y que la afinidad de MabR por la región promotora del operón fasII es modulada in vivo por los acil-CoAs de cadena larga, productos del sistema FAS-I. Por lo tanto, MabR sería un sensor de la composición de acil-CoA en las micobacterias, el cual articula la interacción entre FAS-I y FAS-II para un correcto funcionamiento de la maquinaria lipídica. Finalmente, vimos que ante una deficiencia de los productos de condensación del sistema FAS-I, el sistema FAS-II funciona normalmente utilizando los acil-CoAs provenientes de la degradación de TAG como sustrato alternativo para la biosíntesis de ácidos micólicos. En conclusión, los resultados obtenidos en el presente trabajo de tesis, junto con aquellos previamente publicados por nuestro grupo, sugieren que los dos sistemas FAS deben estar estrictamente co-regulados a nivel transcripcional para mantener la homeostasis lipídica en las micobacterias, y que la disrupción o alteración de dicha comunicación conduce a un microorganismo altamente comprometido en su viabilidad.Ítem Acceso Abierto Characterization of key enzymes involved in triacylglycerol biosynthesis in mycobacteria(Scientific Reports, 2021-06-24) Crotta Asis, Agostina; Savoretti, Franco; Cabruja, Matías Ezequiel; Gramajo, Hugo Cesar; Gago, GabrielaÍtem Acceso Abierto FasR regulates fatty acid biosynthesis and is essential for virulence of Mycobacterium tuberculosis(Frontiers Media, 2020-10-27) Mondino, Sonia Soledad; Vázquez, Cristina L.; Cabruja, Matías Ezequiel; Sala, Claudia; Cazenave-Gassiot, Amaury; Blanco, Federico C.; Wenk, Markus R.; Bigi, Fabiana; Cole, Stewart T.; Gramajo, Hugo Cesar; Gago, GabrielaÍtem Acceso Abierto Formation of foamy macrophages by tuberculous pleural effusions is triggered by the interleukin-10/Signal transducer and activator of transcription 3 axis through ACAT upregulation(Frontiers Media, 2018-03-09) Genoula, Melanie; Marín Franco, José Luis; Dupont, Maeva; Kviatcovsky, Denise; Milillo, Ayelén; Schierloh, Pablo; Moraña, Eduardo Jose; Poggi, Susana; Palmero, Domingo; Mata-Espinosa, Dulce; González-Domínguez, Erika; León Contreras, Juan Carlos; Barrionuevo, Paula; Rearte, Bárbara; Córdoba Moreno, Marlina Olyissa; Fontanals, Adriana; Crotta Asis, Agostina; Gago, Gabriela; Cougoule, Céline; Neyrolles, Olivier; Maridonneau-Parini, Isabelle; Sánchez-Torres, Carmen; Hernández-Pando, Rogelio; Vérollet, Christel; Lugo-Villarino, Geanncarlo; Sasiain, María del Carmen; Balboa, LucianaÍtem Acceso Abierto Mycobacterium tuberculosis FasR senses long fatty acyl-CoA through a tunnel and a hydrophobic transmission spine(Springer Nature, 2020-07-24) Lara, María Julia; Diacovich, Lautaro; Trajtenberg, Felipe; Larrieux, Nicole; Malchiodi, Emilio L.; Fernández, Marisa M.; Gago, Gabriela; Gramajo, Hugo Cesar; Buschiazzo, Alejandro; https://orcid.org/0000-0002-3339-0100; https://orcid.org/0000-0003-0427-5549; https://orcid.org/0000-0001-7501-3330; https://orcid.org/0000-0001-7668-0119; https://orcid.org/0000-0002-2509-6526Mycobacterium tuberculosis is a pathogen with a unique cell envelope including very long fatty acids, implicated in bacterial resistance and host immune modulation. FasR is a TetR-like transcriptional activator that plays a central role in sensing mycobacterial long-chain fatty acids and regulating lipid biosynthesis. Here we disclose crystal structures of M. tuberculosis FasR in complex with acyl effector ligands and with DNA, uncovering its molecular sensory and switching mechanisms. A long tunnel traverses the entire effector-binding domain, enabling long fatty acyl effectors to bind. Only when the tunnel is entirely occupied, the protein dimer adopts a rigid configuration with its DNA-binding domains in an open state, leading to DNA dissociation. The protein-folding hydrophobic core connects the two domains, and is completed into a continuous spine when the effector binds. Such a transmission spine is conserved in a large number of TetR-like regulators, offering insight into effector-triggered allosteric functional control.Ítem Acceso Abierto Pleiotropic effect of AccD5 and AccE5 depletion in acyl-coenzyme a carboxylase activity and in lipid biosynthesis in mycobacteria(Public Library of Science, 2014-06-20) Bazet Lyonnet, Bernardo; Diacovich, Lautaro; Cabruja, Matías Ezequiel; Bardou, Fabienne; Quémard, Annaïk; Gago, Gabriela; Gramajo, Hugo CesarMycobacteria contain a large variety of fatty acids which are used for the biosynthesis of several complex cell wall lipids that have been implicated in the ability of the organism to resist host defenses. The building blocks for the biosynthesis of all these lipids are provided by a fairly complex set of acyl-CoA carboxylases (ACCases) whose subunit composition and roles within these organisms have not yet been clearly established. Previous biochemical and structural studies provided strong evidences that ACCase 5 from Mycobacterium tuberculosis is formed by the AccA3, AccD5 and AccE5 subunits and that this enzyme complex carboxylates acetyl-CoA and propionyl-CoA with a clear substrate preference for the latest. In this work we used a genetic approach to unambiguously demonstrate that the products of both accD5 and accE5 genes are essential for the viability of Mycobacterium smegmatis. By obtaining a conditional mutant on the accD5-accE5 operon, we also demonstrated that the main physiological role of this enzyme complex was to provide the substrates for fatty acid and mycolic acid biosynthesis. Furthermore, enzymatic and biochemical analysis of the conditional mutant provided strong evidences supporting the notion that AccD5 and/or AccE5 have an additional role in the carboxylation of long chain acylCoA prior to mycolic acid condensation. These studies represent a significant step towards a better understanding of the roles of ACCases in mycobacteria and confirm ACCase 5 as an interesting target for the development of new antimycobacterial drugs.Ítem Acceso Abierto Regulación de la síntesis de ácidos grasos en micobacterias(Universidad Nacional de Rosario. Facultad de Ciencias Bioquímicas y Farmacéuticas., 2014-03-07) Mondino, Sonia Soledad; Gago, Gabriela; Gramajo, Hugo CesarEntre las enfermedades infecciosas, la tuberculosis (TB) continúa siendo una de las principales causas de muerte entre los adultos. Algunos años atrás se pensó que esta enfermedad estaba controlada y que sería erradicada a mediano plazo. Sin embargo, hoy en día la TB está restablecida debido a diversos factores, entre ellas la aparición del SIDA. Mycobacterium tuberculosis, el agente etiológico de la tuberculosis, presenta una pared celular inusual, característica de todas las micobacterias. Esta envoltura celular resulta esencial para la viabilidad y supervivencia de las mismas en ambientes hostiles y consiste de una capa altamente impermeable de ácidos micólicos de 70-90 átomos de carbono unidos covalentemente al peptidoglicano (PG) a través de un polisacárido conector, el arabinogalactano (AG). Los ácidos micólicos son los componentes mayoritarios de la envoltura celular de las micobacterias y juegan un rol crucial en su compleja arquitectura y en su impermeabilidad. La biosíntesis de los ácidos micólicos requiere de dos tipos de sintasas de ácidos grasos (FAS): la enzima multifuncional FAS-I, similar a la presente en eucariotas, y el sistema dependiente de la proteína transportadora de acilos (ACP), FAS-II, el cual consiste de una serie de enzimas donde cada una cataliza un paso en la vía de elongación de acil-CoAs de cadena mediana C12-C16, previamente sintetizados por FAS-I. Los componentes genéticos del sistema FAS-II han sido identificados en M. tuberculosis y se encuentran agrupados en tres unidades transcripcionales principales: fabD-acpM-kasA-kasB-accD6 (operón fasII), mabA-inhA y hadA-hadB-hadC. Análisis de microarreglos demostraron que el tratamiento de M. tuberculosis con diversos antibióticos que afectan la síntesis de ácidos micólicos, como isoniacida (INH), etionamida (ETH) o tiolactomicina (TLM), inducen la transcripción de los genes de operón fasII. A su vez fas, el gen que codifica para la enzima multifuncional FAS-I, también se induce tras el tratamiento de M. tuberculosis con INH, sugiriendo la existencia de señales regulatorias comunes a los dos sistemas FAS. Esta información junto al concepto general sobre la existencia de sistemas reguladores que controlan la homeostasis lipídica en la mayoría de los organismos, llevó a que nuestro grupo de investigación se propusiera estudiar quién y cómo se regulan a nivel transcripcional los sistemas de síntesis de ácidos grasos en micobacterias. Es así que fuimos capaces de identificar y caracterizar una proteína reguladora del operón fasII, a quien llamamos MabR (por sus siglas en inglés, Mycolic acid biosynthesis Regulator). Los resultados de esta investigación representaron la primera caracterización de un regulador clave para el metabolismo de ácidos grasos en M. tuberculosis y sentaron las bases para el desarrollo del trabajo de tesis aquí presentado. Los estudios de microarreglos y proteómica antes detallados, junto con la evidencia de que la transcripción del gen fas se veía afectada cuando alterábamos los niveles fisiológicos de MabR, sugirieron la existencia de un mecanismo de regulación coordinado entre los dos sistemas FAS mediado por MabR. La identificación de una repetición invertida en la secuencia promotora del gen fas, similar a la reconocida por MabR en la región promotora del operón fasII, nos llevó a pensar que MabR podría estar regulando de manera directa la transcripción del mismo. Sin embargo, la incapacidad de evidenciar esta interacción in vitro nos condujo a la búsqueda de un nuevo regulador transcripcional del sistema FAS-I. Para alcanzar los objetivos propuestos, en el presente trabajo de tesis se caracterizó la región promotora del gen fas de M. tuberculosis y Mycobacterium smegmatis, comprobando que este gen forma parte de un operón al que denominamos operón fas-acpS. Se identificó y purificó una proteína reguladora de dicho operón, denominada FasR (por sus siglas en inglés, Fatty acid synthase Regulator), la cual fue caracterizada mediante diversos análisis bioquímicos y genéticos. Pudimos determinar que FasR se une a tres repeticiones de una secuencia operadora conservada, en la región promotora del operón fas-acpS. Estudios in vitro e in vivo demostraron que FasR es un activador transcripcional esencial en M. smegmatis, cuya afinidad por la región promotora del operón fas-acpS es modulada por acil-CoAs de cadena larga, productos del sistema FAS-I. La mayoría de los experimentos realizados en este trabajo de tesis utilizaron a M. smegmatis como sistema modelo, elección que responde a razones prácticas. En conclusión, los resultados obtenidos en el presente trabajo de tesis, junto con aquellos previamente publicados por nuestro grupo, sugieren que los dos sistemas FAS deben estar estrictamente co-regulados a nivel transcripcional para mantener la homeostasis lipídica en las micobacterias, y que la disrupción o alteración de dicha comunicación conduce a un microorganismo altamente comprometido en su viabilidad y/o capacidad infectiva.Ítem Acceso Abierto Role of long-chain acyl-CoAs in the regulation of mycolic acid biosynthesis in mycobacteria(Royal Society, 2017-07-19) Tsai, Yi-Ting; Salzman, Valentina; Cabruja, Matías Ezequiel; Gago, Gabriela; Gramajo, Hugo CesarÍtem Acceso Abierto The pleiotropic transcriptional regulator NlpR contributes to the modulation of nitrogen metabolism, lipogenesis and triacylglycerol accumulation in oleaginous rhodococci(Wiley, 2016-11-25) Hernández, Martín Alejandro; Lara, María Julia; Gago, Gabriela; Gramajo, Hugo Cesar; Álvarez, Héctor ManuelThe regulatory mechanisms involved in lipogenesis and triacylglycerol (TAG) accumulation are largely unknown in oleaginous rhodococci. In this study a regulatory protein (here called NlpR: Nitrogen lipid Regulator), which contributes to the modulation of nitrogen metabolism, lipogenesis and triacylglycerol accumulation in oleaginous rhodococci was identified. Under nitrogen deprivation conditions, in which TAG accumulation is stimulated, the nlpR gene was significantly upregulated, whereas a significant decrease of its expression and TAG accumulation occurred when cerulenin was added. The nlpR disruption negatively affected the nitrate/nitrite reduction as well as lipid biosynthesis under nitrogen-limiting conditions. In contrast, its overexpression increased TAG production during cultivation of cells in nitrogen-rich media. A putative ‘NlpR-binding motif’ upstream of several genes related to nitrogen and lipid metabolisms was found. The nlpR disruption in RHA1 strain led to a reduced transcription of genes involved in nitrate/nitrite assimilation, as well as in fatty acid and TAG biosynthesis. Purified NlpR was able to bind to narK, nirD, fasI, plsC and atf3 promoter regions. It was suggested that NlpR acts as a pleiotropic transcriptional regulator by activating of nitrate/nitrite assimilation genes and others genes involved in fatty acid and TAG biosynthesis, in response to nitrogen deprivation.