Caracterización de la actividad ácido fosfatídico fosfatasa y su relevancia en la síntesis de triacilglicéridos en micobacterias

La tuberculosis continúa siendo la enfermedad infecciosa que provoca la mayor cantidad de muertes entre los adultos. Mycobacterium tuberculosis es el agente etiológico de esta enfermedad y el éxito de este patógeno se debe en gran medida a su notable capacidad para sobrevivir en el huésped infectado, donde puede persistir durante varias décadas. Las células huésped primarias del bacilo de la tuberculosis son los macrófagos pulmonares. En ellas, se replica activamente las primeras semanas de infección, hasta que la respuesta del sistema inmune surte efecto y ayuda al organismo a controlar la proliferación del patógeno. El reclutamiento continuo de linfocitos en el sitio de infección junto con la muerte de los macrófagos infectados lleva a la formación de una compleja estructura con una arquitectura muy organizada que es la característica distintiva de la infección con M. tuberculosis: el granuloma. M. tuberculosis puede persistir décadas dentro del granuloma, en un estado de dormancia referido como latencia. Una de las características más distintivas del granuloma es la presencia alrededor de la lesión de una población específica de macrófagos enriquecida en gotas lipídicas y conocidos como macrófagos espumosos. Dentro de estos macrófagos, M. tuberculosis disminuye su tasa de multiplicación y acumula inclusiones lipídicas intracitoplasmáticas en su propio citoplasma que consisten principalmente de triacilglicéridos. A pesar de la relevancia de este proceso, los mecanismos por los cuales M. tuberculosis induce la diferenciación de estos macrófagos espumosos y mediante los cuales puede acumular inclusiones lipídicas en su citoplasma dentro de las células infectadas todavía no se conocen. En parte, esto se debe al limitado conocimiento de la red de regulación involucrada en el mantenimiento de la homeostasis lipídica en micobacterias, particularmente a la regulación de la biosíntesis de triacilglicéridos en este género. Con el fin de elucidar el rol del paso enzimático clave que gobierna la decisión de M. tuberculosis de sintetizar triacilglicerol y, por lo tanto, enlentecer su crecimiento y entrar en el estado de dormancia, en este trabajo de tesis decidimos explorar el rol de las enzimas ácido fosfatídico fosfatasa (PAP). Las mismas son las encargadas de catalizar la formación de diacilglicerol, primera reacción específicamente dedicada a la síntesis de triacilglicéridos, sugiriendo un rol clave para la enzima PAP en la regulación del flujo del ácido fosfatídico hacia la síntesis de triacilglicéridos o de fosfolípidos de membrana. Utilizando a Mycobacterium smegmatis como modelo de estudio, trabajamos bajo la hipótesis de que enzimas ácido fosfatídico fosfatasas de tipo 2 (PAP2) serían responsables de defosforilar al intermediario ácido fosfatídico y generar así el diacilglicerol necesario para la síntesis de triacilglicéridos. A través de análisis informáticos fuimos capaces de identificar dos putativas proteínas con actividad PAP y estudios posteriores revelaron que ambas eran capaces de defosforilar ácido fosfatídico in vivo. A su vez, se construyeron cepas mutantes simples en ambos genes y una mutante doble y se analizó el crecimiento de éstas en distintas condiciones. El análisis de la composición lipídica de cada una estas cepas reveló que sólo la ausencia de las dos proteínas lleva a una reducción de los niveles de triacilglicerol cuando las densidades ópticas alcanzadas son bajas, equiparándose con los niveles de la cepa salvaje a densidades ópticas mayores. Estudios de crecimiento en forma de biofilm, ya sea como macrocolonias o como películas en interfaz líquido-aire, revelaron que la cepa doble mutante tiene afectada la capacidad de formar biofilm y este defecto se debe en parte a un cambio en la composición de la envoltura, en particular en la relación entre los ácidos micólicos (MAMES) y los metilésteres de ácidos grasos (FAMES). Fenotipos intermedios se observaron en las mutantes simples. Finalmente, ensayos de proteómica mostraron que existe un reordenamiento metabólico para suplir la ausencia de estas enzimas con el objetivo de mantener la producción de triacilglicéridos bajo condiciones de estrés. Cabe destacar que en este trabajo también se identificó una putativa enzima PAP en M. tuberculosis, la cual fue capaz de catalizar la defosforilación del ácido fosfatídico in vivo. A partir de los resultados obtenidos, hipotetizamos que, para sortear la ausencia de las enzimas PAP, podrían ocurrir una o más de estas situaciones en paralelo: (1) la sobreexpresión de la vía del glioxilato redirigiría el flujo del carbono hacia la síntesis de compuestos de reserva; (2) el MDAG podría estar siendo reciclado como fuente de diacilglicerol para la síntesis de triacilglicéridos explicando así la disminución de los ácidos micólicos y el fenotipo en la formación de biofilm; (3) y finalmente, el reciclado de fosfolípidos. Estos resultados dan cuenta de la relevancia que tiene la síntesis de triacilglicéridos en las micobacterias. Sin embargo, más estudios son necesarios para poder conectar la síntesis de triacilglicéridos con el reciclado de componentes de la envoltura celular como fosfolípidos y ácidos micólicos y lograr comprender de qué manera las micobacterias pueden obtener diacilglicerol para la síntesis de compuestos de reserva.