Estudio del rol de la Aquaporina-1 en la progresión del colangiocarcinoma

El colangiocarcinoma (CCA) constituye un grupo heterogéneo de tumores de hígado que se originan en las células epiteliales del árbol biliar o colangiocitos. El CCA es asintomático en estadios iniciales, por lo que usualmente se diagnostica en etapas avanzadas, siendo las opciones terapéuticas escasas y el pronóstico de la enfermedad ominoso. Su incidencia y mortalidad se han incrementado en las últimas décadas mundialmente, constituyendo un problema de salud global. A pesar de los avances en la biología del tumor, en su diagnóstico y tratamiento, el pronóstico de los pacientes no ha mejorado sustancialmente en la última década. Por esta razón, existe una necesidad imperiosa de identificar los mecanismos que regulan la progresión del tumor para poder transformarlos en dianas terapéuticas, desarrollar herramientas dirigidas a estos blancos, utilizarlas en pacientes y mejorar el pronóstico de la enfermedad. Las aquaporinas (AQPs) conforman una familia de canales de membrana que facilitan el transporte osmótico de agua como así también la difusión de algunas moléculas pequeñas. La AQP1 fue identificada en 1992 por el Dr. Peter Agre, premio Nobel en Química 2003. Diversas AQPs se expresan en el hígado, específicamente, en colangiocitos se expresan las AQPs 1, 4 y 11. Se ha involucrado a las AQPs en diferentes procesos de las células tumorales, tales como, proliferación, migración, invasión y angiogénesis. No obstante, su rol en el CCA ha sido muy poco estudiado y además, los resultados son controvertidos. Sobre esta base, el Objetivo General de este Trabajo de Tesis fue estudiar el rol de la AQP1 en la progresión del CCA y si su modulación modifica el comportamiento tumoral. Inicialmente se correlacionaron los niveles de expresión de AQP1 con la sobrevida global de un grupo de pacientes con CCA. Los pacientes con menores niveles de expresión de AQP1, presentaron una sobrevida global significativamente inferior. Para los estudios in vitro, utilizamos una línea de CCA intrahepático humana (HuCCT1) en la que se confirmó la expresión intracelular de AQP1 mediante fraccionamiento subcelular e inmunobloting. Luego, desarrollamos un modelo de esta línea celular AQP1 knock-out (KO) mediante la técnica CRISPR/Cas9 y evaluamos posibles efectos en el fenotipo tumoral, mediante ensayos de proliferación y migración en tiempo real. Encontramos que las células AQP1 KO presentaron un aumento significativo tanto en la proliferación como en la migración, sugiriendo una función crucial de la AQP1 en la progresión del tumor. Posteriormente, para dilucidar los mecanismos mediante los cuales la ausencia de AQP1 modifica la agresividad de las células neoplásicas, decidimos hacer un estudio de “Next-Generation Sequencing”. Encontramos 500 genes regulados negativamente y 1083 genes regulados positivamente en las células AQP1 KO. A continuación, estudiamos algunas de las biofunciones identificadas. Basándonos en estudios de otros grupos en los que se asocian las AQPs con la transición epiteliomesénquima (EMT), decidimos focalizarnos en este programa celular. Mediante PCR de tiempo real e inmunobloting, detectamos pérdida de expresión de marcadores epiteliales y sobreexpresión de marcadores mesenquimales en las células AQP1 KO, confirmando una activación de la EMT. Seguidamente, decidimos explorar las vías de señalización involucradas en estos cambios del fenotipo tumoral. Basándonos en nuestros resultados de “Nextgeneration Sequencing” y en publicaciones, estudiamos el eje ‘insulin-like growth factor 2/insulin receptor pathway/insulin-like growth factor receptor 1” (IGF2/IR/IGFR1) como ruta de señalización potencialmente involucrada en proliferación y migración. Mediante la evaluación de la expresión por PCR en tiempo real de la expresión de ciertos genes relacionados con la ruta de señalización y utilizando la técnica de inmunobloting para analizar los niveles de fosforilación de los receptores, observamos un aumento significativo en la activación de la vía en las células AQP1 KO. El tratamiento con Linsitinib redujo la proliferación en estas células, lo que respalda la importancia de esta vía. Finalmente, se realizó un modelo de xenotransplante en ratones utilizando células AQP1 KO, que mostraron un crecimiento tumoral más rápido y una menor expresión del marcador epitelial CDH1, confirmando la agresividad de estas células. En resumen, las células de CCA deficientes en AQP1 presentan un fenotipo más agresivo in vitro; se confirmó una disminución de los marcadores epiteliales y un aumento de los marcadores mesenquimales, lo cual indica que la falta de AQP1 activa el programa de EMT, y por lo tanto aumentado su capacidad metastásica. Estos hallazgos fueron reproducidos en un modelo de xenotransplante in vivo. Cuando se analizó una cohorte de pacientes con CCA se comprobó una correlación entre expresión de AQP1 y sobrevida global. En conclusión, este estudio sugiere que AQP1 desempeña un papel crucial en la supresión de la tumorigenicidad en células de CCA intrahepático. Los resultados respaldan la importancia de investigar y comprender los mecanismos subyacentes en el CCA para mejorar las opciones de tratamiento y el pronóstico de los pacientes.