Impacto de la síntesis de ácidos grasos insaturados y de la movilización de colesterol en la biología de Caenorhabditis elegans

El interés en el metabolismo lipídico ha aumentado significativamente en los últimos años, especialmente desde que desregulaciones en el mismo se han asociado con patologías como obesidad, ateroesclerosis, diabetes, enfermedades neurodegenerativas y cardiovasculares. Según la Organización Mundial de la Salud, estás ultimas son la principal causa de muerte en el mundo, siendo uno de sus factores de riesgo principales la alimentación poco saludable. Por este motivo, comprender el papel activo que desempeñan los lípidos en la fisiología celular y su influencia en la regulación de la homeostasis energética se ha vuelto particularmente relevante. Un modelo animal atractivo para estudiar metabolismo lipídico es el gusano redondo Caenorhabditis elegans. Mejor conocido por su utilidad para análisis genéticos, este organismo modelo es de fácil mantenimiento en el laboratorio, su genoma está completamente secuenciado y tiene un ciclo de vida corto que, entre otras características, lo convierten en un organismo ideal para comprender procesos biológicos como aquellos relacionados con la salud humana. Si bien los nemátodos son capaces de sintetizar diferentes tipos de lípidos, muchos de ellos aún son desconocidos. Hasta la fecha, la investigación en el campo de los lípidos en C. elegans se ha enfocado principalmente en la caracterización de los genes involucrados en la biosíntesis, almacenamiento y degradación, así como aquellos que cumplen funciones regulatorias. Además, se han estudiado las consecuencias neurológicas que surgen cuando algunos de estos compuestos no se sintetizan correctamente. Por este motivo, en este trabajo nos propusimos entender el rol que desempeñan los ácidos grasos y el colesterol sobre la biología de C. elegans. Los ácidos grasos insaturados (UFAs) pueden ser monoinsaturados (MUFAs) conteniendo un doble enlace C-C, o poliinsaturados (PUFAs) conteniendo dos o más dobles enlaces C-C. El nemátodo C. elegans se diferencia de la mayoría de los animales por tener la capacidad de producir una gran variedad de UFAs empleando acetil-CoA como precursor. La biosíntesis de UFAs depende de la conversión de ácidos grasos saturados a insaturados mediada por la actividad de las enzimas desaturasas ∆9. Los nemátodos cuentan con 3 genes que codifican para estas enzimas, fat-5 (palmitoil-CoA ∆9 desaturasa), fat-6 y fat-7 (estearoil-CoA ∆9 desaturasas). La vía de síntesis de UFAs en C. elegans comienza con el ácido palmítico (16:0), obtenido de la dieta de E. coli o sintetizado de novo, el cual es convertido en ácido palmitoleico (16:1 ∆9) por FAT-5. El ácido palmítico (16:0) también puede ser elongado a ácido esteárico (SA, 18:0), el sustrato para la desaturación por FAT-6 y FAT-7 hacia ácido oleico (OA, 18:1 ∆9), siendo este último el precursor de todos los PUFAs que produce C. elegans. Debido a que la actividad desaturasa ∆9 es esencial, un nemátodo mutante fat-6-(-); fat-5-(-);fat-7-(-) es inviable, por lo que en nuestro laboratorio desarrollamos una mutante condicional que puede ser depletada de UFAs en el estadio larval deseado. Para la construcción de esta mutante empleamos el sistema degron inducible por auxina (AID), originario de Arabidopsis thaliana, que recientemente fue adaptado para su uso en C. elegans. Para esto, sobre un trasfondo genético fat-6-(-);fat-5-(-) editamos el gen fat-7, mediante CRISPR-Cas9, adicionándole una secuencia de reconocimiento para su degradación en el proteasoma que es inducible por auxina. De esta manera, suplementando el medio de crecimiento con esta hormona vegetal podemos interrumpir la síntesis de UFAs en el soma de esta cepa, que llamamos DDM6. Para poder entender las consecuencias fisiológicas de la falta de UFAs realizamos una caracterización funcional de DDM6. Descubrimos que la depleción de estos lípidos produce arresto larval en los estadios L1 y L2, pero no en L3 o L4 que logran alcanzar la adultez, sugiriendo un rol esencial de la síntesis de OA para la transición a la adultez desde los primeros estadios larvales. Mediante GC-MS y RMN de extractos de lípidos demostramos que la reducción observada en los UFAs que exhiben los gusanos tratados con auxina se debe a una disminución acentuada de los PUFAs más que de los MUFAs. Además, esta depleción de FAT-7 interfiere con los depósitos de grasas al disminuir el tamaño y la cantidad de triacilgliceroles almacenados en las gotas lipídicas, lo cual evidenciamos mediante microscopía de fluorescencia y RMN de gusanos vivos enriquecidos isotópicamente con 13C. Finalmente, mostramos que la exposición a auxina de los gusanos DDM6 induce esterilidad de manera reversible, lo cual se demuestra por la marcada reducción en la progenie producida autónomamente por los gusanos hermafroditas. Con el fin de entender las causas biológicas responsables de la reducción en la fertilidad observada en gusanos DDM6 expuestos a auxina, realizamos una serie de ensayos bioquímicos que nos facilitaron evaluar ciertos marcadores de desarrollo germinal. Encontramos que la deficiencia de UFAs induce alteraciones mitóticas y meióticas en la línea germinal. Por otro lado, mediante ensayos de inmunohistoquímica descubrimos que un contexto de baja desaturación ∆9 conduce a la formación de estructuras de membrana aberrantes y altera la correcta formación del complejo de poro nuclear en la línea germinal. Sin embargo, no encontramos evidencia de que la falta de UFAs induzca apoptosis o alterare la correcta segregación de los cromosomas homólogos en la línea germinal. Por último, en este proyecto de tesis nos propusimos entender como el transporte de colesterol influye sobre la fisiología de C. elegans. El colesterol, además de ser un componente estructural de las membranas celulares, es el precursor de hormonas esteroideas y ácidos biliares, volviéndolo esencial para el desarrollo y la salud. Debido a que tanto el exceso como la falta de colesterol son perjudiciales para la salud, gran cantidad de procesos regulatorios han evolucionado para controlar vías metabólicas de involucran esteroles. A diferencia de lo que ocurre con mamíferos, C. elegans es auxótrofo para colesterol por lo que requiere un suplemento dietario constante para sobrevivir. En los nemátodos este esterol es requerido para el crecimiento y la progresión por los diferentes estadios larvales. Además, el colesterol regula el ingreso a un estadio de diapausa especializado que permite la supervivencia bajo condiciones desfavorables llamado larva dauer. Los esteroles que regulan la formación de la larva dauer son moléculas similares a los ácidos biliares denominados ácidos dafacrónicos (ADs). Estos inhiben el estado dauer al unirse a un receptor hormonal nuclear llamado DAF-12, que en ausencia de ADs activa el programa dauer. Tras la ingesta de colesterol, la distribución vesicular de este lípido en C. elegans es mediada por varios sistemas de transporte, incluyendo las vitelogeninas. Después de la endocitosis mediada por receptores de los transportadores de colesterol, este es transportado a través del sistema endolisosomal y dirigido a otros compartimentos celulares con la ayuda de los homólogos del transportador tipo Niemann-Pick C1 (NPC1), NCR-1;NCR-2. A pesar del conocimiento actual sobre estos circuitos, varios aspectos de las vías involucradas en el transporte y la distribución del colesterol en C. elegans aún no se han elucidado. Durante la última década, estudios en líneas celulares o fibroblastos, han mostrado que transportadores como las proteínas esteroidogénicas reguladoras agudas (StAR) y los dominios de transferencia de lípidos relacionados con StAR (START) en los sitios de contacto de membrana proporcionan una vía importante para la transferencia de colesterol del sistema endosomal-lisosomal a otras organelas celulares. Para mejorar nuestra comprensión del transporte de esteroles en C. elegans, realizamos investigaciones estructurales y funcionales de TAG-340, un ortólogo de la proteína humana STARD3, que une esteroles y genera sitios de contacto entre los endosomas/lisosomas y el retículo endoplásmico o mitocondrias. Utilizamos técnicas de dicroísmo circular y resonancia magnética nuclear para examinar la unión del colesterol, y también determinamos la estructura del dominio START de TAG-340/STARD3 mediante cristalografía de rayos X. Elucidamos las estructuras cristalinas del dominio STAR solo y en complejo con colesterol, lo que proporcionó información valiosa sobre el mecanismo de unión del lípido. También descubrimos que el silenciamiento por ARNi de TAG-340 intensifica el arresto dauer en el desarrollo de los dobles mutantes ncr-2-(-);ncr-1-(-), lo que indica que TAG-340/STARD3 está involucrada en la regulación del transporte intracelular de colesterol en C. elegans. En general, nuestros resultados demuestran la primera estructura cristalina de un dominio START en complejo con colesterol y proporcionan evidencia de que TAG-340/STARD3 funciona como una proteína de transferencia de lípidos y participa en el flujo vesicular de colesterol en C. elegans.