Caracterización molecular de haplotipos Rh variantes. Implicancia en medicina transfusional

El sistema Rh posee gran importancia clínica debido a la inmunogenicidad de sus antígenos, y a la participación de sus anticuerpos en la patogénesis de la enfermedad hemolítica fetoneonatal, de reacciones hemolíticas transfusionales y de algunas anemias hemolíticas autoinmunes (8, 73). El locus RH está compuesto por dos genes homólogos denominados RHD y RHCE, que codifican las proteínas transmembranales eritrocitarias RhD y RhCE, respectivamente (180). Este sistema presenta gran variabilidad alélica, que se traduce en fenotipos con expresión parcial o débil de los antígenos y en deleciones parciales o totales de las proteínas (15). El gran número de variantes fenotípicas descriptas y la elevada variabilidad en los patrones de reactividad que éstas muestran con los antisueros monoclonales restringe la aplicación de métodos serológicos para su correcta determinación. La caracterización molecular de las variantes alélicas resulta un recurso apropiado para resolver los problemas en aquellas situaciones clínicas donde la serología presenta limitaciones. El conocimiento de las bases genéticas del sistema Rh permitirá implementar estrategias moleculares útiles para identificar inequívocamente el alelo responsable del fenotipo Rh. En este trabajo de Tesis hemos investigado los eventos genéticos responsables de la variabilidad en la expresión de los antígenos Rh y analizado la asociación entre variantes alélicas RHD y RHCE. Además, hemos validado una estrategia molecular para la detección de sustituciones, insersiones y deleciones nucleotidicas, presencia/ausencia y variación del número de copias de exones de los genes RH para la identificación de fenotipos con genotipo desconocido. En este trabajo de Tesis se analizaron las bases moleculares responsables de alteraciones en la expresión de los antígenos D y E encontradas en un donante de sangre y su familia. Mediante diferentes estrategias de biología molecular se han elucidado las bases genéticas que subyacen en la expresión aberrante de estos antígenos. Los resultados obtenidos mostraron que el donante y sus dos hijos son portadores del haplotipo RHD*DEL43-RHCE*ce.37. La baja frecuencia poblacional de las variantes alélicas RHD y RHCE halladas en este estudio sugiere un desequilibrio de ligamiento entre las mismas. Para confirmar este hallazgo, se estudiaron posteriormente 17 muestras de ADN de donantes portadores del alelo RHD*DEL43 y su asociación con la variante alélica RHCE*ce.37. Este estudio permitió identificar el haplotipo RHD*DEL43-RHCE*ce.37 en el 64,71% de las muestras estudiadas, demostrando una fuerte asociación entre ambas variantes RH. Posteriormente, se estudió la asociación entre los alelos RHD*D débil tipo 1 en R0 y RHD*D débil tipo 4, hallados con alta prevalencia en individuos con fenotipo D variante de nuestra población (104, 164), con los polimorfismos más frecuentemente encontrados en variantes alélicas RHCE (c.48C en el exón 1 y c.733G en el exón 5). Se estudiaron 32 muestras de ADN provenientes de individuos con genotipo RHD*D débil tipo 1 en R0 (n=15) y de individuos con fenotipo Dccee (n=17 como grupo control) y su asociación con los polimorfismos c.48C y c.733G en RHCE. Los resultados obtenidos mostraron que en el 100% de las muestras portadoras del alelo RHD*D débil tipo 1 en R0 y en el 76,47% de las muestras con fenotipo Dccee se identificaron los polimorfismos c.48C y c.48G. Estos estudios moleculares sugieren un desequilibrio de ligamiento entre los alelos RHD*D débil tipo 1 y el alelo RHD normal cuando se encuentran en haplotipo R0 con la variante alélica RHCE*ce (48C). En cuanto al estudio llevado a cabo para la detección del polimorfismo c.733G, los resultados moleculares sugieren que no existe asociación entre las variantes RHD analizadas y el alelo RHCE*ce (733G). En una etapa posterior, se estudiaron 61 muestras RHD*D débil tipo 4 y su asociación con los polimorfismos c.48C y c.733G en RHCE. Los resultados de este análisis permitieron determinar que hay una asociación del 86,89% entre el alelo RHD*D débil tipo 4 y los polimorfismos c.48C, c.733G. Con el objetivo de establecer si los polimorfismos c.48C y c.733G presentes en el 86,89% de las muestras RHD*D débil tipo 4 se encuentran en cis, formando parte de un alelo RHCE*ce(c.48C, c.733G) (haplotipo RHD*D débil tipo 4- RHCE*ce(c.48C, c.733G)) o formando parte de los haplotipos RHD*D débil tipo 4-RHCE*ce(c.48C) o RHD*D débil tipo 4-RHCE*ce(c.733G) en trans con los haplotipos RHD*01N.01 -RHCE*ce(c.733G) o RHD*01N.01 -RHCE*ce(c.48C), respectivamente, se analizó la presencia de los SNVs c.48C y c.733G en 304 muestras de ADN con una deleción homocigota del gen RHD. Este estudio mostró una baja asociación entre el alelo RHD*01N.01 con los polimorfismos c.48C y c.733G. El 2,30% de las muestras resultaron portadoras del polimorfismo c.733G y el 2,96% de las muestras resultaron portadoras del polimorfismo c.48C. Ninguna de las muestras analizadas fue portadora de ambos polimorfismos concomitantemente. Estos hallazgos sugieren que en el 86,89% de las muestras RHD*D débil tipo 4 los polimorfismos c.48C y c.733G se encuentran en cis formando el haplotipo RHD*D débil tipo 4- RHCE*ce(c.48C, c.733G). Para evaluar la presencia de otros polimorfismos en el exón 5 del gen RHCE, se realizaron estudios de secuenciación en muestras portadoras del haplotipo RHD*01N.01-RHCE*ce(733G). Los resultados mostraron que este polimorfismo fue detectado en estado heterocigota en todas las muestras analizadas, sugiriendo que el alelo RHCE hallado es RHCE*ceVS.01. Los resultados obtenidos en los estudios de asociación entre variantes alélicas RHD y RHCE permitieron detectar desequilibrios de ligamiento que involucran a las variantes RHD*DEL43, RHD*D débil tipo 1 y RHD*D débil tipo 4 con alelos RHCE responsables de expresiones alteradas de los antígenos c, E y e. La identificación de variantes RHCE por métodos moleculares permite superar las limitaciones de las técnicas serológicas convencionales que no detectan expresiones aberrantes de los antígenos c, E y e en muestras que portan una copia normal del gen RHCE en trans. La detección de estos polimorfismos del gen RHCE por métodos moleculares permite prevenir eventos de aloinmunización cuando las variantes RHCE*ce.37 y RHCE*ce (48C, 733G) se encuentran en trans con los alelos normales RHCE*Ce, RHCE*Ce o RHCE*CE. En este trabajo de Tesis se validó una nueva estrategia molecular (PCR multiplex cuantitativa de fragmentos cortos fluorescentes: PCR-QMPSF) para investigar el número de copias de todos los exones, tanto del gen RHD como RHCE. Inicialmente se estudió un grupo de muestras portadoras de genes normales y genes híbridos D-CE con genotipos conocidos para validar su utilidad y robustez. A través de esta estrategia logramos caracterizar 4 variantes alélicas RHD, identificando 3 alelos nulos, RHD-RHCE(3-9)-D (n=2), RHD*01N.07 y un alelo D parcial RHD*DVI tipo 4, de una forma mucho más rápida, menos laboriosa y disminuyendo el error asociado al operador. Sin embargo, se trata de una metodología costosa que debe ser empleada criteriosamente. Esta estrategia presenta muchas ventajas, incluido el hecho de que la reacción se lleva a cabo en un formato de tubo cerrado, reduciendo así la exposición química de los operadores a compuestos potencialmente nocivos. El método aprovecha el etiquetado fluorescente universal, que utiliza un solo cebador conjugado con marcación fluorescente para etiquetar todos productos de PCR, contribuyendo así a reducir el coste de los reactivos. Finalmente hemos investigado las bases moleculares responsables de la expresión alterada de los antígenos RhCE en 4 donantes de sangre, logrando caracterizar la estructura molecular de los alelos responsables. Se estudió un grupo familiar donde se observó una discrepancia en la herencia de los antígenos RhCE. Los resultados moleculares obtenidos han permitido demostrar la presencia de un nuevo haplotipo nulo RHD*08N.01- RHCE*01.16(807G). Cabe señalar que tanto los alelos RHD como RHCE en este haplotipo son silenciados por el mismo SNV c.807T>G, posiblemente como consecuencia de la recombinación homóloga entre las secuencias RHD y RHCE. Esta sustitución nucleotídica es responsable de la generación de un codón de terminación prematuro y proteínas Rh truncas que no se integran en la membrana del eritrocito. Estudios previos (118, 107, 178, 179) han reportado que el mismo codón de terminación generado por la mutación en la posición nucleotídica 807 es responsable de 9 alelos RH silentes (8 RHD y un alelo RHCE). Teniendo en cuenta todos estos hallazgos resulta lógico suponer que esta posición en la secuencia de ADN presenta una inestabilidad inherente susceptible a adquirir mutaciones debido a una alta tendencia a la conversión génica o a sustituciones de nucleótidos simples. El análisis de segregación familiar mostró que este haplotipo se heredó por vía materna. Por otro lado, se investigó la presencia de la inserción de 4 pb en el exón 8 del gen RHD en muestras portadoras del gen RHD*08N.01, previamente genotipificadas en nuestro laboratorio. La estrategia QMPSF permitió demostrar que en nuestra población todas las variantes RHD*08N.01 halladas muestran un desplazamiento de 4pb en el exón 8 del gen RHD, lo cual constituye un nuevo polimorfismo que podría ser utilizado para la caracterización del pseudogen RHDΨ. Finalmente, se identificaron los mecanismos moleculares responsables de fenotipos con deleción parcial de los antígenos RhCE en 3 donantes. En una muestra se halló una mutación puntual (c.659G > A) que genera un codón de terminación prematuro y una proteína trunca RhCE incapaz de integrarse en la membrana del eritrocito (fenotipo D--). En las otras dos muestras estudiadas se detectaron nuevos alelos híbridos RHCE-D-CE responsables no solo de los fenotipos D- - y Dc- sino también de la sobreexpresión de antígeno D y de la expresión de un antígeno c variante, respectivamente. En este trabajo de Tesis evidenció que distintos mecanismos moleculares pueden ser responsables de un mismo fenotipo con deleción parcial de los antígenos RhCE (D--). En todos los casos estudiados se brindó asesoramiento genético a los donantes en caso de requerir transfusiones o cursar embarazos a lo largo de su vida. Las estrategias moleculares diseñadas en este trabajo de Tesis permitieron profundizar los conocimientos sobre los eventos genéticos responsables de la expresión variante de los antígenos del sistema Rh. Hemos demostrado que los estudios serológicos no son suficientes para identificar todas las variantes antigénicas. Los resultados obtenidos en este trabajo de Tesis establecen la importancia del estudio del polimorfismo molecular del locus RH, para desarrollar estrategias de tipificación de ADN confiables, que permitan realizar la genotipificación RH y optimizar la selección de unidades hemocompatibles en los servicios de medicina transfusional.