Vías de señalización involucradas en la internalización de transportadores canaliculares en colestasis de origen intrahepática. Estudio de la sal biliar taurolitocolato

La sal biliar taurolitocolato (TLC) es un potente agente colestásico y su administración en ratas induce colestasis aguda y reversible. Un punto clave en la patogénesis de la colestasis inducida por TLC, es la internalización del transportador canalicular Mrp2 (proteína asociada a resistencia a multidrogas 2) hacia un compartimiento de reciclado endosomal. Hasta el momento, se han reportado diferentes proteínas de señalización intracelular mediando este proceso, tales como PI3K, PKCε y MARCKS; sin embargo, el receptor inicial de TLC sigue siendo desconocido. Unos pocos receptores acoplados a proteína G interactúan con las sales biliares en los hepatocitos, entre ellos, el receptor 2 de esfingosina 1-fosfato (S1PR2). En este trabajo de Tesis se postuló como hipótesis la participación de dicho receptor y sus posteriores efectores, adenilato ciclasa (AC) y PKA, en la internalización de Mrp2 inducida por TLC. Finalmente, se pretendió integrar las vías estudiadas con otras cascadas de señales involucradas en el proceso. En los modelos in vitro utilizados, el bloqueo de S1PR2, por inhibición con su antagonista o por knock-down con ARNi, previno parcialmente la disminución de la actividad de Mrp2 inducida por TLC. De la misma manera, la inhibición de AC y PKA en duplas de hepatocitos de rata, tuvo un efecto beneficioso sobre la alteración de la función de Mrp2. Además, los efectos preventivos de los inhibidores de AC y PKA no se sumaron con la protección del inhibidor de S1PR2, sugiriendo que todas estas proteínas forman parte de la misma vía de señalización. Este último supuesto, fue corroborado mediante western blot, donde el aumento de los niveles de sustratos fosforilados de PKA producidos por TLC fue impedido en presencia de los inhibidores de S1PR2, AC y PKA. Los hallazgos anteriores fueron validados en un modelo de mayor complejidad como es el hígado aislado y perfundido de rata. La administración de TLC provocó una disminución en el flujo biliar y en la excreción biliar de dinitrofenil-glutatión, sustrato de Mrp2. Los inhibidores de S1PR2 o AC no modificaron la caída inicial, pero aceleraron la recuperación de estos parámetros, indicando que la vía está involucrada en la prevención de la reinserción espontánea del transportador en la membrana canalicular. Los cambios en la función de transporte de Mrp2, en los modelos in vitro así como también en hígado aislado y perfundido, ocurrieron en paralelo con una modificación en la localización del transportador, el cual abandona la membrana canalicular hacia compartimentos endosomales. En todos los casos, en presencia de los inhibidores correspondientes, el fenómeno de desinserción dejó de ser visible en las imágenes de microscopía confocal. La vía dependiente de PI3K/Akt también fue evaluada. El bloqueo con sus respectivos inhibidores, previno parcialmente el daño funcional de Mrp2 inducido por la sal biliar en duplas. El tratamiento conjunto de estos inhibidores con el antagonista de S1PR2 no provocó efectos de sumación, conectando S1PR2/AC/PKA y PI3K/Akt en una misma vía de señalización. A su vez, TLC produjo aumento de fosforilación (activación) de Akt, lo que fue bloqueado por los inhibidores de S1PR2/AC/PKA, reafirmando la dependencia de PI3K/Akt con la vía caracterizada en este trabajo. Por otro lado, los resultados obtenidos por inhibición de p38 MAPK (recientemente reportada como blanco de TLC) in vitro, sugieren que esta proteína actúa en una ruta complementaria a S1PR2/AC/PKA/PI3K, debido a que los efectos protectores de los inhibidores se sumaron, si bien no alcanzaron juntos la protección total. En el modelo de hígado aislado y perfundido se determinó que p38 participa en la prevención de la reinserción del transportador ya que no evitó la caída del flujo biliar pero mejoró la recuperación del mismo, al igual que la vía S1PR2/AC/PKA. Es decir, p38 MAPK y S1PR2/AC/PKA participan en vías que no se vinculan con la desinserción sino con procesos que mantienen desinsertado al transportador. A partir de datos bibliográficos, se puede hipotetizar que la MAPK estaría implicada en un paso intermedio, actuando inmediatamente después de la endocitosis de Mrp2, mientras que la vía que termina en PI3K/Akt participaría frenando la reinserción del mismo desde los endosomas de reciclado a la membrana canalicular. En síntesis, la sal biliar TLC induce la internalización del transportador canalicular Mrp2 y la subsecuente colestasis, a través de mecanismos complementarios que dependen de la activación de un receptor inicial (S1PR2), seguido de cascadas de señales constituidas por AC/PKA, PI3K/Akt y p38 MAPK. El entendimiento de los mecanismos por los cuales ocurre el proceso colestásico contribuye al conocimiento de la fisiopatología de este síndrome e identifica blancos promisorios para nuevas estrategias terapéuticas .