Búsqueda de compuestos bioactivos que interfieran con la lipoilación de proteínas en microorganismos patógenos

El ácido lipoico (AL) es un compuesto organosulfurado distribuido ampliamente en la Naturaleza. Es un cofactor esencial requerido para el funcionamiento de seis complejos multienzimáticos involucrados en el metabolismo oxidativo (piruvato deshidrogenasa, PDH; 2-oxoglutarato deshidrogenasa; deshidrogenasa de cetoácidos ramificados; oxoadipato deshidrogenasa y acetoína deshidrogenasa) y de un carbono (sistema de clivaje de la glicina, GCS). El AL se encuentra unido covalentemente mediante un enlace amida a residuos de lisina presentes en dominios de lipoilación (DL) que se encuentran altamente conservados dentro de las subunidades E2 de las deshidrogenasas o la subunidad H del GCS (GcvH). Gran parte del conocimiento sobre el metabolismo del AL proviene de investigaciones realizadas en bacterias modelo como Escherichia coli y Bacillus subtilis. Mientras que la bacteria modelo Gram-negativa emplea la vía clásica para el metabolismo del AL, la Gram-positiva utiliza el mecanismo del "lipoyl-relay". En esta última, la octanoiltransferasa (LipM) modifica exclusivamente GcvH. La octanoil-GcvH generada se convierte en sustrato para la lipoato sintasa (LipA), que inserta dos átomos de azufre en los carbonos 6 y 8 del octanoato, culminando en la lipoilación de GcvH. Posteriormente, la amidotransferasa LipL, una enzima presente únicamente en la vía de tipo lipoyl-relay, transfiere la porción lipoílo a los restantes complejos enzimáticos dependientes de AL. Además, se identificó que esta bacteria utiliza la acción combinada de una lipoato ligasa (LplJ) y de LipL para modificar sus apoproteínas con AL proveniente del medio extracelular. Las vías de lipoilación, inicialmente descubiertas en bacterias, ofrecen información crucial sobre el metabolismo del AL en organismos eucariotas. En el caso de las plantas, emplean vías similares a las observadas en E. coli, mientras que los hongos y mamíferos utilizan rutas metabólicas más parecidas a las encontradas en B. subtilis. La investigación de las rutas de biosíntesis y utilización de AL en microorganismos ha ganado gran relevancia, especialmente en relación con la patogénesis, por lo que se constituye en un prometedor blanco para nuevas terapias antimicrobianas. En este trabajo nos propusimos identificar compuestos que afecten la actividad de enzimas requeridas para la lipoilación proteica en bacterias Gram-positivas patógenas y parásitos responsables de diversas enfermedades desatendidas a nivel mundial. Staphylococcus aureus es una bacteria Gram-positiva que puede causar enfermedades en prácticamente cualquier tejido y se manifiesta más comúnmente como bacteriemia, osteomielitis, neumonía e infecciones de la piel. Esta bacteria puede evadir los leucocitos fagocíticos produciendo factores de virulencia que inhiben su actividad antimicrobiana. Se demostró que S. aureus secreta la subunidad E2 de la PDH lipoilada al medio extracelular, que actúa como un inmunosupresor, promoviendo la virulencia de la bacteria. Por el contrario, la presencia de la E2-PDH no modificada, induce una mayor producción de citoquinas proinflamatorias por parte del huésped, permitiendo el control de la infección. La vía de rescate de AL en S. aureus incluye dos lipoato ligasas, LplA1 y LplA2, dos proteínas H y la amidotransferasa LipL, que da como resultado la lipoilación de los complejos deshidrogenasa, incluida la PDH. Para intervenir la lipoilación proteica, planteamos una estrategia que consiste en utilizar análogos de sustrato que puedan ser ligados a las E2s y afectar su funcionalidad. Se diseñaron compuestos dirigidos al sitio activo de LplA2 y se analizó su efecto en el crecimiento de dos bacterias Grampositivas, S. aureus y B. subtilis. Tres análogos afectaron el crecimiento en medio mínimo de una cepa salvaje de S. aureus, en concentraciones que oscilaron entre 6,6 y 24 µM, mientras que no produjeron ningún efecto en B. subtilis. Realizando un análisis más detallado con el compuesto más potente, Lpl-004, pudimos observar que el mismo estaba siendo transferido a las subunidades E2 de los complejos deshidrogenasa. Como consecuencia se generó un impacto negativo en su funcionalidad, que pudo restaurarse agregando los productos de los complejos enzimáticos dependientes de lipoato. No se observó efecto de este compuesto sobre el crecimiento de una cepa de S. aureus doble mutante en las lipoato ligasas, lo que nos permitió concluir que la inhibición de Lpl-004 es dependiente de la actividad ligasa. Cuando Caenorhabditis elegans fue infectado con la cepa salvaje de S. aureus, la presencia de Lpl-004 causó una esperanza de vida significativamente mayor en comparación con la condición sin el compuesto. Asimismo, pudimos observar que la presencia del compuesto no produjo cambios en la vida media del gusano al ser infectado con la bacteria deficiente en ambas lipoato ligasas. Como sucede en humanos, C. elegans no posee vía de salvataje de AL por lo que este compuesto no puede afectar la viabilidad del hospedador. Nuestros resultados proporcionan evidencia de que las moléculas pequeñas que pueden ser tomadas por la vía de recuperación de AL representan una estrategia innovadora para el desarrollo de nuevas sustancias antimicrobianas. El conocimiento sobre el mecanismo involucrado en la lipoilación de proteínas en protozoarios parásitos, como los causantes de la enfermedad del sueño, de la enfermedad de Chagas y la malaria, es crucial para la generación de nuevos fármacos que apunten a esta vía. Estos parásitos, que causan enfermedades infecciosas en los seres humanos, constituyen una importante amenaza para la salud y son responsables de más de un millón de muertes al año. Hay evidencia en la bibliografía de que el ácido 8-bromo-octanoico (BrO), un análogo del AL, afecta la sobrevida de diferentes parásitos. Utilizando colecciones de mutantes de B. subtilis defectuosas en el metabolismo de AL, reunimos evidencia que nos permitió proponer por primera vez que la vía de tipo lipoyl-relay también está presente en protozoos parasitarios. Mediante un enfoque genético inverso asignamos actividad amidotransferasa a los productos de los genes Tb927.8.630 (TblipL) de Trypanosoma brucei y PF3D7_0923600 (LipL2) de Plasmodium falciparum. El modelo de B. subtilis nos permitió, además, identificar las amidotransferasas de estos parásitos como blanco del BrO, explicando la pérdida completa de la lipoilación de proteínas y el deterioro del crecimiento causado por este compuesto en T. cruzi. Un análisis exhaustivo de las secuencias aminoacídicas y de los modelados estructurales de diferentes amidotransferasas procariotas y eucariotas nos permitió identificar residuos que se encuentran conservados e involucrados en el mecanismo de acción de estas proteínas. Como se había reportado anteriormente, las amidotransferasas procariotas realizan la transferencia del lipoilo a través de un residuo de cisteína, que está ausente en las de origen eucariota. Propusimos que TbLipL utilizaría una lisina altamente conservada, tanto en enzimas procariotas como eucariotas, para transferir el residuo lipoilo. Mediante mutagénesis sitio dirigida cambiamos ese residuo de lisina por una alanina. La expresión de la proteína mutante no revirtió el defecto de crecimiento de la mutante ΔlipL de B. subtilis, indicando la pérdida de la actividad amidotransferasa de la enzima del parásito. Esta lisina conservada no resultó ser esencial para la actividad de la amidotransferasa de B. subtilis. Este resultado indica que, si bien las amidotransferasas eucariotas y procariotas catalizan la misma reacción, los mecanismos de reacción serían diferentes. Otra característica destacable es que las amidotransferasas eucariotas están conformadas por dos dominios, mientras que las bacterianas están compuestas por un único dominio. El dominio N-terminal de TbLipL presenta homología estructural con la totalidad de LipL de B. subtilis. La eliminación del dominio adicional de TbLipL, que denominamos TbLipLC, generó una pérdida en la actividad proteica. Estos resultados indican que este segundo dominio sería importante para la catálisis o para la correcta estructuración de la proteína de los parásitos. Las amidotransferasas tienen un rol esencial en organismos que emplean un lipoyl-relay para modificar sus apoproteínas, siendo fundamentales tanto en las vías de síntesis como en las de utilización del AL. Por consiguiente, planteamos que estas enzimas poseen un gran potencial como blancos para el desarrollo de nuevos compuestos antimicrobianos y antiparasitarios. Para detectar posibles inhibidores de amidotransferasas bacterianas y de protozoos a través de un screening de alto rendimiento, diseñamos una cepa reportera de B. subtilis. Esta cepa carece de amidotransferasa y expresa la octanoiltransferasa LipB de E. coli. La falta de LipL nos permitió estudiar el comportamiento de las amidotransferasas PfLipL2 o TbLipL cuando eran expresadas bajo el control de un promotor inducible por xilosa. La capacidad del BrO para inhibir las amidotransferasas parasitarias nos sirvió para evaluar la factibilidad de nuestra estrategia reportera. Este modelo podría ser fundamental para la detección de quimioterapéuticos selectivos y más eficientes contra enfermedades producidas por bacterias patógenas o parásitos. Además, los genes que codifican para las amidotransferasas de diferentes organismos también podrían introducirse en la cepa reportera, lo que demuestra una gran versatilidad en la metodología. Hasta donde sabemos, este es el primer método de screening utilizado con éxito para identificar inhibidores de amidotransferasas.