Bases moleculares de la resistencia sistémica inducida por Trichoderma atroviride en maíz

Las plantas, como miembros de comunidades complejas, han ido estableciendo interacciones con microorganismos de diversa naturaleza. Como resultado de esta coevolución, las mismas pueden establecer interacciones compatibles, ya sean benéficas o patogénicas, o incompatibles. Algunas de las interacciones benéficas se establecen con lo que se denominan agentes de biocontrol o controladores biológicos de fitopatógenos. La utilización de estos microorganismos, ha cobrado gran importancia últimamente en el control de enfermedades que deterioran la calidad de los cultivos y comprometen el estado fitosanitario de las cosechas. La relevancia del uso de estos agentes radica en que no solo contribuyen a proteger los cultivos y estimular su productividad, sino que también ayudan a proteger el medioambiente al disminuir el uso de agroquímicos y pesticidas. El género Trichoderma, define un conjunto de especies de hongos filamentosos que pueden actuar como antagonistas de organismos fitopatógenos y que a su vez pueden estimular el sistema inmune vegetal reduciendo la incidencia posterior de diferentes enfermedades. Si bien Trichoderma spp. puede colonizar la raíz, uno de los fenómenos más destacados de la interacción entre este hongo y sus hospedadores vegetales es la activación de la resistencia sistémica inducida (ISR). Se sabe que la colonización de raíces por Trichoderma permite una respuesta más rápida y efectiva en los tejidos distales durante el posterior ataque de patógenos que reduce la incidencia y la severidad de las enfermedades. Este proceso fisiológico es denominado cebado o “priming” del sistema inmune vegetal y se conoce muy poco acerca de los mecanismos regulatorios que controlan su efectividad. Los mecanismos moleculares y fisiológicos que subyacen al resultado del priming y la ISR se consideran actualmente como las estrategias centrales utilizadas por Trichoderma spp. para contrarrestar el desarrollo de enfermedades. Sin embargo, la naturaleza de la ISR activada por Trichoderma spp. aún se encuentra en discusión. En la presente Tesis, se propuso identificar y caracterizar las bases moleculares de la resistencia sistémica inducida por Trichoderma atroviride en maíz. Dicho estudio se focalizó en dos tejidos sistémicos de la planta, los estigmas y las hojas. Para ello, planteamos dos sistemas experimentales claves, basados en la triple interacción Zea mays, T. atroviride y un patógeno hemibiotrofo. En la primera parte de la Tesis, el sistema tripartito incluía al patógeno hemibiotrofo Fusarium verticillioides, principal agente causal de la podredumbre de la mazorca y la contaminación del grano con micotoxinas. La relevancia de este análisis reside en el estudio de un patosistema de alto impacto a nivel mundial. En este sentido, realizamos un análisis transcriptómico y proteómico en los estigmas de plantas de maíz. Esto, nos permitió seleccionar los genes y proteínas de priming involucrados en la resistencia sistémica inducida por T. atroviride. Estos resultados se complementaron con ensayos bioquímicos tradicionales que nos permitieron cuantificar hormonas, compuestos fenólicos y lignina y determinar el ancho de la pared celular de los estigmas. Los resultados revelaron la existencia de una compleja modulación en la expresión de genes y proteínas, además de una reorganización fisiológica en las células de los estigmas, en respuesta al priming luego del ataque de F. verticillioides. Sumado a ello, hemos demostrado que el ácido salicílico (SA) actúa como un elemento central de señalización durante esta respuesta de ISR. En la segunda parte, procedimos a estudiar la ISR en hojas de plantas de maíz. Para ello, nos propusimos evaluar los eventos moleculares y epigenéticos vinculados, en primera instancia, a la inoculación con Trichoderma y en segunda instancia a la infección de Colletotrichum graminicola, patógeno foliar hemibiotrofo y agente causal de la antracnosis del maíz. Este estudio nos permitió revelar el comportamiento de los genes de priming (previamente seleccionados en los estigmas) y de genes marcadores de las vías hormonales. En este contexto, pudimos evidenciar que a nivel transcripcional se produce una inducción tanto de la vía de señalización del SA como la del ácido jasmónico (JA) a tiempos tempranos de la inoculación con T. atroviride. Sin embargo, la cuantificación de los niveles de dichas hormonas reveló un aumento en los niveles de SA, no encontrándose variaciones a lo largo del tiempo en los niveles de JA. Por lo cual, estas observaciones nos indicarían que el priming desencadenado por Trichoderma en hojas, estaría relacionada principalmente con la vía de señalización del SA, al igual que en los estigmas. Posteriormente, nos focalizamos en el estudio de la regulación epigenética del priming del sistema inmune vegetal. Por un lado, en el sistema conformado por Z. mays y T. atroviride, cuantificamos las estructuras G-cuádruplex (G4) a nivel de ADN de hojas de maíz. Los resultados revelaron un aumento significativo de estructuras G4- ADN a los 6 días post-inoculación, lo cual nos permitió concluir que T. atroviride produce cambios epigenéticos a nivel de ADN en un tejido sistémico de la planta. Estas modificaciones podrían estar actuando como “memoria” para desencadenar las respuestas de manera más rápidas y eficientes ante una situación de estrés. Por otro lado, evaluamos el estado de compactación/relajación de la cromatina y determinamos los niveles de acetilación y metilación de histonas luego de la infección de C. graminicola. Estos resultados, sumamente novedosos, revelaron que los genes de priming se encuentran en un estado de cromatina “abierta” y presentan un aumento en la marca epigenética que corresponde a la activación génica y una concomitante disminución de la marca de represión. Estas evidencias, nos permitieron inferir que las plantas bajo estado de priming pueden responder más eficientemente al ataque por el patógeno debido a una activación transcripcional más rápida de los genes vinculados a la respuesta. A modo de conclusión general, el desarrollo de esta Tesis de Doctorado contribuyó significativamente al entendimiento a nivel molecular de los procesos fisiológicos y regulatorios asociados a la resistencia sistémica inducida por Trichoderma en una planta de gran interés agronómico.