Implementación de sistemas de expresión de grado alimentario en Lactococcus lactis para la producción de proteínas heterólogas con aplicación agroindustrial

Abstract

La producción ganadera en la provincia de Santa Fe enfrenta desafíos críticos debido a la variabilidad en la calidad de los forrajes y la necesidad de implementar prácticas de producción agrícola sostenibles. Lactococcus lactis es una bacteria ácido láctica (BAL) reconocida como segura (estatus GRAS), ampliamente utilizada como inoculante en ensilados para mejorar la conservación y el valor nutricional del alimento animal. Sin embargo, la aplicación industrial de cepas recombinantes requiere la eliminación de marcadores de resistencia a antibióticos para cumplir con las normativas de grado alimentario (food-grade en inglés). El objetivo general de este trabajo fue desarrollar los componentes de un sistema de expresión food-grade en L. lactis para la producción de enzimas con aplicación en la degradación de biomasa vegetal, utilizando una xilanasa como modelo. Para ello, se diseñó una estrategia de selección metabólica basada en la complementación del gen de la enzima alanina racemasa (alr), esencial para la síntesis de la pared celular bacteriana. Se construyó un vector quimérico termosensible, para mediar la deleción del gen alr cromosómico mediante un protocolo de doble evento de recombinación homóloga. Utilizando esta metodología, se logró obtener la cepa mutante auxótrofa L. lactis “NZ9000-alrKO” (NZ9000-Δalr), confirmada su deleción por PCR, selección fenotípica y secuenciación del locus delecionado. Posteriormente, se desarrolló un vector de expresión food-grade portador del gen de complementación alr, bajo un promotor constitutivo (P32). La funcionalidad del sistema diseñado se validó en dos instancias. Por un lado, se comprobó la eficiencia del promotor P32 para dirigir la expresión y secreción continua de la enzima reportera xilanasa. Por otro lado, la validación final del sistema de grado alimentario consistió en la exitosa restauración de la viabilidad celular de la cepa mutante en medios carentes de D-alanina tras su transformación con el vector de complementación desarrollado. Este desarrollo sienta las bases para una biotecnología local transferible al sector productivo, promoviendo una bioeconomía circular y sostenible.