Rol del eje AMPc/PKA en los eventos asociados a la capacitación de espermatozoides de mamíferos

La capacitación espermática es un proceso fundamental que deben atravesar los espermatozoides para adquirir capacidad fecundante. Se caracteriza por: 1) un cambio en el patrón de motilidad flagelar (hiperactivación); y 2) la adquisición de la capacidad para sufrir la reacción acrosómica (RA) al exponerse a progesterona. Al incubar espermatozoides en un medio capacitante se estimula la activación temprana de la Proteína Quinasa A (PKA), una Ser/Thr quinasa de amplio espectro involucrada en la regulación de distintos procesos celulares. El adenosín monofosfato cíclico (AMPc), generado al inicio de la capacitación por la adenilato ciclasa soluble (sAC), es el primer eslabón de esta cascada, y su principal blanco es la activación de PKA. PKA es un heterotetrámero compuesto por dos subunidades catalíticas (PKA-C) y dos subunidades regulatorias (PKA-RII), que permanecen unidas en su estado inactivo. La activación de esta enzima depende, en gran parte, de su adecuada localización en regiones subcelulares específicas. En este contexto, las proteínas de anclaje a PKA (AKAPs) actúan como andamiajes para la formación de microdominios de señalización, restringiendo la actividad de PKA a sitios determinados. A pesar de los avances en el estudio de PKA, aún no se comprende completamente qué ocurre con sus subunidades cuando el AMPc se une a las subunidades regulatorias. Existen dos modelos que podrían explicar su activación: el modelo de disociación y el modelo de no disociación. Dado que los procesos mediados por PKA son esenciales para la adquisición de la competencia fecundante, comprender cómo esta quinasa se regula en el espacio y el tiempo es crucial para dilucidar los pasos de la capacitación espermática. En primer lugar, nos propusimos desarrollar un método sencillo, robusto y confiable para medir la actividad de PKA. Por otro lado, aunque numerosos estudios han abordado el rol de esta quinasa en la capacitación, aún no se conoce con exactitud la totalidad de eventos moleculares que regula ni su localización precisa en el espermatozoide tras este proceso. Por ello, resulta fundamental determinar la ubicación de sus subunidades y su interacción con proteínas de anclaje, lo que permitirá identificar los diferentes signalosomas en los que PKA actúa y los eventos que regula, ya sea directa o indirectamente. Dentro de los cambios moleculares claves que suceden tras la capacitación se encuentra también la hiperpolarización del potencial de membrana plasmática (Em), un evento asociado a la RA. SLO3 es el canal de potasio responsable de este evento, es un canal sensible a pH y experimentos utilizando como farmacología inhibitoria H89, han vinculado a PKA con este proceso. Además, se ha observado que ratones knockout (KO) para el canal de potasio específico de espermatozoides SLO3 no hiperpolarizan su Em y son infértiles. En esta tesis, investigamos el mecanismo molecular que dispara la hiperpolarización de la membrana plasmática en los espermatozoides, ya sea antes o después de la activación de PKA. Para ello, utilizamos espermatozoides murinos wildtype (WT) y transgénicos (KO) como modelos experimentales. Aplicamos inhibidores farmacológicos específicos para sAC y PKA, así como análogos permeables de AMPc. Para determinar las concentraciones óptimas de estos compuestos, realizamos ensayos de Western Blot (WB) y actividad de PKA mediante el método “KiMSA” (versatile kinase mobility shift assay), desarrollado en nuestro laboratorio y explicado en el primer capítulo de esta tesis. Luego, de los distintos tratamientos, evaluamos el potencial de membrana mediante fluorimetría poblacional utilizando el fluoróforo DISC 3,5 para tal fin. Sorprendentemente, encontramos que la inhibición de PKA con sPKI no impide la hiperpolarización del potencial de membrana (Em). En contraste, la inhibición con H89 bloquea este proceso, pero dicho efecto es reversible mediante el análogo de AMPC, 8Br-AMPc, lo que confirma la inespecificidad de H89, cuyo mecanismo de acción es la competencia con ATP. Estos resultados nos permitieron descartar que la actividad catalítica de PKA sea un requisito para la hiperpolarización. Sin embargo, nuestros hallazgos sugieren que el AMPc está directamente involucrado en la activación de SLO3, ya que análogos permeables de este nucleótido promueven la hiperpolarización, mientras que inhibidores de su producción, como TDI10220, bloquean este efecto. En conjunto, estos resultados respaldan la hipótesis de que el AMPc regula el potencial de membrana a través de un blanco distinto a la PKA. Exploramos distintos análogos de AMPc para identificar el target responsable de la hiperpolarización. Se encontró que el intercambiador Na+/H+(sNHE), especifico de espermatozoides, cuya función principal es alcalinizar el interior celular y que, además, posee un sitio de unión a AMPc es un eslabón crucial en este proceso. Ratones KO para sNHE no logran hiperpolarizar, y esta deficiencia no se revierte con análogos de AMPc como 8Br AMPc o db-AMPc, pero sí con alcalinización farmacológica, lo que sugiere que SLO3 se activa mediante la alcalinización inducida por sNHE. Además, descubrimos que la acción de sNHE no es independiente, ya que otro intercambiador, NHE1, también participa en este proceso. Este segundo intercambiador, cuya función se desconoce bastante, podría ser activado por calcio ya que posee un sitio de unión a calcio/calmodulina. Analizamos el papel del calcio en la hiperpolarización y observamos que los espermatozoides de ratones KO para CatSper I no logran hiperpolarizar su membrana, pero recuperan el fenotipo tras la inducción de alcalinización farmacológica. Estos hallazgos demuestran un rol dual de ambos intercambiadore, activados por AMPc o por calcio, necesarios para el umbral de alcalinización requerida para la activación de SLO3. Aunque descartamos el rol catalítico de PKA en la hiperpolarización, estudios publicados anteriormente, resaltan la importancia de su localización subcelular específica para que ocurran eventos asociados a la capacitación. En consecuencia, nuestro siguiente objetivo fue detallar la localización de las subunidades catalíticas y regulatorias de PKA durante la capacitación espermática y su asociación con AKAPs, con énfasis en AKAP4, el AKAP predominante en espermatozoides. Mediante microscopía confocal con detector Airyscan y superresolución (DNAPAINT), analizamos la ubicación de PKA-RII, PKA-C y AKAP4 en espermatozoides capacitados y no capacitados. Encontramos que las subunidades regulatorias y catalíticas se separan drásticamente durante la capacitación: PKA-C se localiza en el centro del flagelo, mientras que PKA-RII migra hacia la periferia, donde se encuentra AKAP4. No se detectó asociación entre PKA y AKAP4 en espermatozoides no capacitados, lo que sugiere la posible existencia de otros AKAPs o proteínas de anclaje en el estado inactivo de PKA. Además, PKA-RII se redistribuyó en la vaina fibrosa (FS) en una conformación de cuatro columnas, coincidente con la ubicación del canal CatSper. En espermatozoides KO para CatSper, esta estructura se perdió, lo que sugiere que CatSper es crucial para la relocalización de PKA-RII y que esta subunidad podría desempeñar un papel en la señalización dentro de esta región clave para la capacitación espermática. En base a los resultados obtenidos, concluimos que: 1) El AMPc es esencial para la activación del canal de potasio SLO3, pero su acción no está mediada por la actividad catalítica de PKA. 2) La hiperpolarización de la membrana espermática requiere la acción coordinada de dos intercambiadores de Na⁺/H⁺, sNHE y NHE1. 3) La localización subcelular de las subunidades de PKA cambia drásticamente durante la capacitación espermática. 4) La presencia del canal CatSper es fundamental para la correcta relocalización de PKA-RII.