Desarrollo de un método rápido para detectar actividad fosfodiesterasa

Abstract

El sistema Tat (de sus siglas en inglés Twin Arginine Translocation), permite el transporte de proteínas completamente plegadas a través de membranas citoplasmáticas bacterianas, de arqueas y membranas tilacoidales de cloroplastos. La fosfatasa alcalina PhoD, es el único sustrato conocido del sistema TatAdCd de B.subtilis. PhoD es una enzima extracitoplasmática con actividad fosfoesterasa. Para su transporte PhoD inmadura (prePhoD) contiene en su extremo N-terminal una secuencia señal de 57 residuos que una vez transportada es escindida quedando PhoD madura (mPhoD). En este trabajo, prePhoD y mPhoD recombinantes se expresaron como proteínas de fusión con el dominio SUMO. Conteniendo además una secuencia blanco Strep en el extremo N-terminal que permitió su purificación. Con el propósito de desarrollar un método para determinar de manera sencilla la presencia de prePhoD y mPhoD, se evaluó su comportamiento en geles nativos de distintos porcentajes de acrilamida y pHs. La actividad fosfomonoesterasa y fosfodiesterasa de prePhoD y mPhoD se determinó utilizando los sustratos colorimétricos pNPP y bispNPP. Además, se puso a prueba la actividad de prePhoD en detergentes, comúnmente utilizados en estudios de interacción entre los componentes del sistema Tat. Por último, se utilizó la filtración en gel analitica para seguir la actividad fosfomonoesterasa de la proteína. Resultando esto, un método novedoso y eficiente para detectar de manera específica la presencia de PhoD en la muestra.