Modulación de sistemas de biotransformación y proteínas ABC por el antichagásico benznidazol

Los xenobióticos, son compuestos de naturaleza química muy variada, que se encuentran en el medio ambiente de forma natural o surgen como resultado de la actividad humana. Los organismos vivos se encuentran constantemente expuestos a una gran variedad de estos compuestos, que al ingresar al organismo, se distribuyen en los distintos compartimentos pudiendo ser metabolizados y/o acumulados (Kovacic y Somanathan, 2009; Bhattacharya y Keating, 2011; Lima y col., 2011). Estos compuestos son generalmente apolares y lipofílicos, característica que les permite atravesar con facilidad las membranas biológicas, imposibilitando su excreción por orina o heces y acumulándose en tejidos grasos. Por esto, suelen sufrir procesos de biotransformación, o metabolización, generando metabolitos más hidrosolubles, que facilitan su eliminación. La biotransformación es definida entonces como la suma de todas las reacciones químicas que alteran la estructura, solubilidad en agua y eventual distribución de endo- y xenobióticos. Los organismos biológicos poseen sistemas enzimáticos que catalizan estos procesos de biotransformación que procuran disminuir la toxicidad global de los xenobióticos, aunque en algunos casos se generan intermediarios aún más tóxicos o activos (Martinez-Cabot y col., 2005; Zhou y col., 2007). Las reacciones de biotransformación han sido clasificadas en: reacciones de fase I (como aquellas catalizadas por el sistema de citocromo P450 -CYP-); y reacciones de fase II (catalizadas por familias de enzimas denominadas: glutation- S-transferasas -GST- y uridín-difosfo-glucuronosiltransferasa -UGT-, entre otras). Por otra parte, la magnitud de acumulación de una droga y/o sus metabolitos, en un determinado tejido, es frecuentemente limitada no tanto por su habilidad para entrar a la célula sino como su tendencia a dejarla. Esto está relacionado con los mecanismos de eflujo presentes en la membrana celular que juegan un rol crítico en limitar la absorción y acumulación de sustancias potencialmente tóxicas o de uso terapéutico, y que pueden conferir resistencia a esos compuestos. Se define entonces la fase III del metabolismo o la eliminación de endo- o xenobióticos y/o sus metabolitos, que está representada por los procesos de transporte. Los transportadores involucrados en los mecanismos de excreción de la fase III, son miembros de la familia de transportadores ABC que comprenden aquéllas proteínas denominadas MDR (del inglés: “multidrug resistance protein”, como P-glicoproteína, P-gp) y MRP (del inglés: “multidrug resistance-associated protein”, como la proteína asociada a resistencia a múltiples drogas 2, Mrp2), entre otros. Estos proveen una importante barrera contra la penetración de drogas y/o un eficiente mecanismo de eliminación (Mottino y col., 2000; Ayrton y Morgan, 2001; Chan y col., 2004). Luego del hígado, la mucosa gastrointestinal y la corteza renal son los tejidos más activos en la biotransformación y eliminación de compuestos tanto endógenos como exógenos (Rowland y Walter, 1983; Chhabra y Eastin, 1984). Si bien los sistemas de biotransformación y transportadores ABC se expresan diferencialmente en distintos tipos celulares (macrófagos, epitelios absortivos o secretores, etc.), esta expresión no es estática ya que las células tienen una remarcable capacidad para regular la cantidad de estas proteínas tanto a nivel transcripcional como post-transcripcional. El tratamiento con determinados compuestos es capaz de alterar la expresión y actividad de los mismos en distintos tejidos y con ello modificar su farmacocinética y biodisponibilidad, como así también la de drogas co-administradas que son también sus sustratos (Ibrahim y col., 2001). Por otra parte, la enfermedad de Chagas es una enfermedad endémica en América Latina, que afecta a 15 millones de personas (OMS, 2007, http://www.who.int/mediacentre/factsheets/fs340/es/). En la Argentina y otros países endémicos, la única droga disponible para el tratamiento de la fase aguda de esta enfermedad es el benznidazol (BZL). Sin embargo, sus efectos tóxicos pueden llevar a suspender el tratamiento, con la consiguiente progresión de la enfermedad a la fase crónica. Además, uno de los mayores obstáculos en el éxito del tratamiento de enfermedades neoplásicas e infecciones por microorganismos o parásitos es el desarrollo de resistencia a multidrogas. Entre los mecanismos propuestos caben destacar la sobre-expresión y mayor actividad de sistemas enzimáticos de biotransformación de dichas drogas así como de proteínas transportadoras capaces de facilitar su excreción (o de sus metabolitos) (Catania y col., 2004). La resistencia a drogas tiene también un alto impacto en la quimioterapia de la enfermedad de Chagas, limitando las opciones al tratamiento e incrementando el número de tratamientos fallidos. Como antecedentes de nuestro grupo de trabajo, observamos que BZL induce la expresión y actividad de CYP3A4, GSTπ, P-gp y MRP2 de manera dependiente de la concentración, en células HepG2 utilizadas como modelo de célula hepática (Rigalli y col., 2012). Sin embargo, hasta el presente no existe información concerniente a la expresión y actividad de sistemas de biotransformación y transportadores en un modelo in vivo y sus potenciales consecuencias en la farmacocinética de BZL o de drogas co-administradas. Por todo esto, en este trabajo de Tesis nos propusimos evaluar el impacto del pretratamiento con BZL (25; 50 y 100 mg/kg/día i.p., por 3 días consecutivos) sobre la expresión y actividad de proteínas involucradas en el metabolismo de Fase I (CYP3A), de Fase II (UGT1A, GSTs), eliminación (P-gp y Mrp2) y sobre la biodisponibilidad del propio BZL (evaluando la farmacocinética de una dosis testigo de BZL: 5 mg/kg, intraduodenal, pos-tratamiento). Observamos que el tratamiento con BZL incrementa el flujo biliar, sin alterar la velocidad de excreción biliar de glutation total ni GSSG, determinantes mayoritarios del flujo biliar independiente de sales biliares; permitiéndonos sugerir que el incremento observado en el flujo biliar podría deberse a la excreción biliar de metabolitos de BZL vía Mrp2 y/o P-gp. Además, las ratas tratadas con BZL presentan un leve aumento en los niveles de GPT sin alteraciones en la excreción biliar de bilirrubina, ni de niveles séricos de otras enzimas utilizadas como marcadores de daño hepático (LDH, FA, GOT). Al presente, poco es conocido sobre los efectos de BZL sobre los sistemas de biotransformación. En nuestro trabajo, el tratamiento con BZL produjo un aumento en la expresión de la familia de CYP3A (responsable de la primera etapa de biotransformación en hígado del 50 % de las drogas de uso clínico, Köhle y Bock, 2009), con un concomitante aumento en la actividad de CYP3A4. Por otro lado, mientras que la expresión de UGT1A no se vio alterada por BZL en ninguno de los tejidos analizados, observamos inducción de la expresión de GSTμ en hígado y GSTα en intestino, y de la actividad global, pudiendo ser un mecanismo compensatorio pre-sistémico contra derivados electrofílicos resultantes del metabolismo de BZL. Además de los sistemas de biotransformación, el incremento en la depuración de endo- y xenobióticos puede asociarse frecuentemente a altos niveles de expresión de proteínas transportadoras de eflujo, como P-gp y/o MRPs (Greiner y col., 1999; Fromm y col., 2000). Al evaluar el efecto de BZL sobre la expresión y actividad de P-gp y Mrp2, en órganos involucrados en la absorción y excreción de distintos fármacos que pudieran administrarse simultáneamente con BZL, observamos que el tratamiento de ratas Wistar macho adultas con BZL indujo un aumento en los niveles de expresión y actividad de ambos transportadores en hígado y yeyuno, no así en íleon ni en riñón. Estos resultados nos sugieren que la inducción de P-gp y Mrp2 en hígado, podría alterar la capacidad de excreción biliar de diversos compuestos y llevar a interacciones droga-droga a nivel hepático. Además, el sustancial incremento en los niveles de expresión y actividad de P-gp y Mrp2 observados en el intestino proximal podría llevar a un incremento en la secreción de sustancias presentes en la sangre o a una reducción de la absorción de drogas que son administradas oralmente, como el propio BZL. Estos resultados sugieren que bajo tratamiento con BZL, podrían ser observadas interacciones droga-droga, especialmente en los niveles de excreción, alterando las vías de depuración de compuestos endógenos y exógenos. El hecho de que el pre-tratamiento con BZL no haya producido alteraciones en la expresión de CYP3A, GST, P-gp y Mrp2 en riñón es desconocido, poniéndose en evidencia un efecto órgano-específico, mediado posiblemente por el receptor de pregnanos X, un receptor nuclear que regula la expresión tanto de enzimas de biotransformación de Fase I y Fase II como así también de transportadores de xenobióticos (Kliewer y col., 2002; Klaassen y Aleksunes, 2010;) y cuya expresión en riñón es baja en comparación con los otros tejidos (Kliewer y col., 1998). Adicionalmente, nos propusimos estudiar si las alteraciones en las proteínas transportadoras observadas podrían tener algún efecto sobre la biodisponibilidad de una dosis testigo de BZL (5 mg/kg) en ratas. Los parámetros farmacocinéticos de la dosis testigo de BZL calculados mostraron un aumento en la velocidad de eliminación plasmática (k) y una menor AUC plasmática en el grupo pre-tratado con BZL en comparación al grupo control, indicando un aumento en la depuración plasmática. Además, la Cmáx de BZL en plasma fue menor en los animales pre-tratados con BZL, sugiriendo una menor absorción intestinal de BZL. Cuando evaluamos la cantidad de BZL excretada por la vía biliar observamos un aumento significativo en este parámetro en animales pre-tratados con BZL en comparación a los animales controles. La cantidad de BZL excretada en orina fue similar entre ambos grupos experimentales, por lo sugerimos que el aumento en la depuración plasmática podría deberse al menos en parte debido a la vía biliar. Al observar además una disminución en la Cmáx alcanzada durante la administración de la dosis testigo de BZL en animales pre-tratados con BZL en comparación al grupo control, decidimos evaluar si la capacidad de absorción intestinal podría estar afectada estudiando el transporte intestinal seroso-mucoso de BZL mediante el modelo de saquitos intestinales. Los resultados obtenidos confirmaron nuestra hipótesis, dado que la velocidad de transporte de BZL desde el lado mucoso al lado seroso fueron menores en el grupo pre-tratado con BZL, que en el grupo control, a lo largo de todo el experimento. Este efecto fue revertido por el co-tratamiento con PSC833 (inhibidor específico de P-gp, análogo no inmunosupresivo de la ciclosporina A), indicando que P-gp podría estar mediando dicho efecto. Antecedentes previos de nuestro grupo de investigación, confirmaron la participación de P-gp en el eflujo de BZL en células (Rigalli y col., 2012). La información obtenida durante esta tesis sugiere la posibilidad de una disminución progresiva en la absorción de BZL y/o incremento en la metabolización/eliminación después de su administración terapéutica. Desafortunadamente, no encontramos evidencia en la literatura de esta posibilidad, o una conexión con la disminución en la eficacia terapéutica. Al presente, también se desconoce si podría existir una inducción de sistemas de biotransformación y transportadores en pacientes tratados con BZL. En conclusión, el incremento de la expresión y actividad de P-gp y Mrp2 en hígado y yeyuno proximal junto con el aumento en la expresión y actividad de CYP3A4 en hígado, y GST hepática e intestinal, debidas al pretratamiento con BZL, podrían dar lugar a la aparición de interacciones droga-droga con otros fármacos que pudieran ser co-administrados durante el tratamiento, pudiendo implicar principalmente sistemas involucrados en la depuración de compuestos endógenos y exógenos; así como modificar la farmacocinética del propio BZL, en pacientes tratados con BZL.