Optimización de medidas de distancia por transferencia de energía para estudios de topología de las proteínas de membrana VraT y VraS de Staphylococcus aureus

El surgimiento acelerado de la resistencia bacteriana a antibióticos representa un desafío para el tratamiento de enfermedades infecciosas. Las cepas de S. aureus resistentes a meticilina y a vancomicina son una gran amenaza para la salud pública. Es necesario identificar nuevos blancos para diseñar compuestos inhibidores que reestablezcan la efectividad de los antibióticos disponibles contra estos patógenos. El sistema de tres componentes VraTSR es un excelente blanco para inhibidores. Está involucrado en la inducción del estimulón del estrés de la pared celular, y aumenta la resistencia de S. aureus contra un amplio rango de antibióticos que afectan la pared celular. Está formado por VraS (histidin-quinasa sensora), VraR (regulador de respuesta) y VraT, una proteína de membrana de función desconocida pero fundamental para la activación del sistema. La señal sensada por VraTSR aún no ha sido dilucidada. Trabajos previos en nuestro grupo sugieren que el dominio N-terminal de VraS podría ser importante en la detección directa de antibióticos. La topología de VraT respecto de la membrana y de VraS está aún en discusión, pero se ha reportado que interacciona con VraS. Con el objetivo de generar una herramienta que permita confirmar la interacción directa de VraS con los antibióticos β-lactámicos y posteriormente definir la topología de VraT, en este trabajo se caracterizó una variante de VraS en la que se introdujo una etiqueta de unión a lantánidos. Se optimizaron la expresión y purficación de esta proteína, así como la determinación de la distancia entre el N-terminal y el sitio de unión a β-lactámicos por transferencia de energía por resonancia de la luminiscencia. Además se clonaron construcciones para co-expresar variantes de VraS y VraT para, en el futuro, realizar estudios de interacción empleando las técnicas optimizadas en esta tesina. Los ensayos de transferencia de energía por resonancia de la luminiscencia permitieron observar la interacción de LBT-VraS con el antibiótico fluorescente bocilina FL, y determinar la distancia entre el LBT y el sitio de unión a antibióticos.