Caracterización estructural y funcional de las proteínas sensoras de los sistemas de resistencia a β-lactámicos de Staphylococcus aureus

Staphylococcus aureus resistente a meticilina (MRSA) es una de las amenazas clínicas multirresistentes más importantes a nivel mundial. MRSA posee dos mecanismos primarios de resistencia a antibióticos β-lactámicos: la producción de una serin-β-lactamasa, PC1, y la adquisición de una transpeptidasa accesoria, PBP2a, con baja afinidad por los antibióticos. Los genes que codifican para estas dos proteínas junto con los que codifican para los reguladores BlaI/MecI y BlaR1/MecR1, forman parte de los operones bla y mec, respectivamente. Las proteínas BlaR1 y MecR1 son proteínas integrales de membrana denominadas sensoras/transductoras, que presentan un dominio sensor extracelular capaz de detectar el antibiótico en el medio y disparar una señal al interior celular, que deriva en la transcripción de los genes involucrados en la resistencia. Sin embargo, hasta el momento el mecanismo de transducción de la señal es desconocido. Una de las dificultades más grandes radica en la expresión, purificación y caracterización de estas proteínas en sus versiones completas. La comprensión del mecanismo de transducción de señal es de sumo interés dado que ambas proteínas son posibles blancos para el diseño de nuevos inhibidores que puedan emplearse junto con los antibióticos actualmente disponibles. A fin de esclarecer el funcionamiento de ambos sistemas, nos propusimos comenzar con una primera caracterización estructural de la proteína MecR1. Luego de sobre-expresar, solubilizar y purificar la proteína de interés, determinamos que la misma se encuentra como dos especies en micelas de detergente. A partir de ensayos de SEC-MALS confirmamos las especies como dímero y monómero. Ensayos de dicroísmo circular nos permitieron determinar que ambas especies se encuentran plegadas en detergente y empleando diferentes antibióticos β-lactámicos probamos que el dominio sensor de ambas se encuentra correctamente plegado y es funcional. Además, realizamos dos screenings iniciales de condiciones para la preparación de grillas que permitan determinar la estructura de MecR1 empleando Cryo-EM. Si bien, hasta el momento no se han encontrado las condiciones de vitrificación óptimas, los resultados fueron alentadores para continuar trabajando en ello. Por otro lado, buscamos condiciones alternativas para la solubilización y purificación de la proteína de membrana. Se ensayaron dos polímeros para la preparación de nanodiscos, logrando la solubilización y purificación con el polímero SMALP 300 (3:1). Sin embargo, los rendimientos han sido menores que empleando detergentes, por lo que se debe continuar trabajando en la puesta a punto de las condiciones de solubilización. Al momento de comenzar este trabajo, sólo se conocían las estructuras cristalográficas de los dominios sensores de las proteínas BlaR1 y MecR1, en ausencia y en presencia de antibiótico. Sin embargo, las estructuras no mostraban diferencias que pudieran aportar información acerca del mecanismo de transducción de la señal hacia el dominio metaloproteasa, luego de la unión del antibiótico. Con el objetivo de dilucidar este mecanismo, propusimos desarrollar una metodología empleando el uso de lantánidos que permita evaluar los cambios conformacionales que ocurren en la proteína MecR1 al producirse la unión del antibiótico. Para ello, se introdujeron sondas espectroscópicas en bucles citoplasmáticos de MecR1 a partir de las cuales se pudieron obtener medidas de distancia, empleando Espectroscopia de Resonancia Paramagnética Electrónica (EPR) de alto campo y Transferencia de Energía de Luminiscencia por Resonancia (LRET). Esta metodología nos permitirá a futuro continuar con el estudio de los cambios conformacionales que ocurren en MecR1 al estar unida a antibióticos βlactámicos o en presencia del represor MecI. La cepa de referencia empleada para el estudio del mecanismo de resistencia de Staphylococcus aureus mediado por el operón bla es S. aureus NRS128. La cepa S. aureus MN8, presenta la misma secuencia que NRS128 para los genes blaI, blaZ y la región operadora, pero presenta una mutación puntual en el gen blaR1 que genera un cambio en el marco de lectura y un codón de STOP prematuro. Sin embargo, MN8 fue reportada como resistente a antibióticos βlactámicos. A lo largo de este trabajo se intentó esclarecer si alguna de las versiones truncas generadas en MN8, que poseen tanto el dominio metaloproteasa como el dominio sensor se estaría expresando y presentaría actividad metaloproteasa, dando lugar a la manifestación de resistencia. Confirmamos la presencia de la mutación puntual en MN8 y la resistencia frente a los antibiótico ampicilina y penicilina G. Además, empleando ensayos con el antibiótico cromogénico nitrocefina y utilizando cepas de S. aureus reporteras, confirmamos la expresión inducible de los genes que componen el operón bla en la cepa NRS128, en contraste con una expresión constitutiva en la cepa MN8. Esta tesis aporta nuevos avances en el estudio de la proteína integral de membrana MecR1. Además, se ha innovado en el uso de nanodiscos para la purificación de proteínas de membrana y la determinación de la estructura empleando la técnica de vanguardia Cryo-EM. Por otro lado, se dejan sentadas las bases del desarrollo de una nueva metodología empleando EPR y LRET para la determinación de medidas de distancias en diferentes condiciones, que permitirán continuar con el estudio del mecanismo de transducción de la señal empleado tanto por MecR1 como por BlaR1.