Plásmidos de tipo Rep_3 en la diseminación de genes de beta-lactamasas tipo OXA y la resistencia a carbapenemes en Acinetobacter baumannii

La combinación entre el uso poco racional de antimicrobianos y la capacidad de diferentes bacterias patógenas de adquirir y acumular genes de resistencia a los mismos ha conducido a la selección de poblaciones bacterianas con fenotipos de multirresistencia (MR) en el ambiente nosocomial, y por lo tanto a una disminución acentuada de las opciones terapéuticas para el tratamiento de infecciones. Entre estos, Acinetobacter baumannii es uno de los patógenos de relevancia en infecciones asociadas con altas tasas de morbi-mortalidad. Este microorganismo Gram-negativo, aeróbico no fermentativo, causa complicaciones clínicas tales como neumonía, bacteriemia, infecciones del tracto urinario, infecciones en piel y tejidos blandos, meningitis secundaria, infecciones en heridas y quemaduras, especialmente en pacientes inmunocomprometidos. Ha demostrado una sorprendente capacidad de evolucionar MR ante el tratamiento con diversos antimicrobianos, y la rápida adquisición y diseminación de resistencia adicional a los -lactámicos carbapenemes, uno de los últimos recursos terapéuticos disponibles, constituye así un serio problema para el tratamiento de infecciones. Recientemente la Organización Mundial de la Salud (OMS) estableció una lista de patógenos MR de prioridad para el desarrollo de nuevas herramientas terapéuticas, siendo A. baumannii categorizado de prioridad crítica por su rápida capacidad de adquirir nuevas resistencias incluyendo a los carbapenemes (https://www.who.int/mediacentre/news/releases/2017/Antimicrobial_resistance_VPC_27FEB2017.pdf?ua=1). Abordar este problema en forma racional requiere un conocimiento avanzado de la fisiopatología de este organismo, incluyendo los mecanismos implicados en la adquisición y diseminación de resistencia antibiótica. Los objetivos del presente trabajo de Tesis Doctoral abarcaron el estudio de los principales mecanismos de resistencia a carbapenemes desarrollados por A. baumannii, incluyendo la contribución de reducciones en la permeabilidad de ME y la caracterización detallada de plásmidos de resistencia involucrados en la diseminación del gen de la carbapenemasa blaOXA-58 entre la población nosocomial de este patógeno, con énfasis en cepas del complejo clonal CC15 (esquema Pasteur) prevalente en nuestra región. Los resultados del primer objetivo sobre la contribución de la proteína de membrana externa (PME) CarO de A. baumannii a la resistencia a carbapenemes utilizando estudios genéticos en la cepa modelo de A. baylii ADP1 expresando las distintas variables de CarO de A. baumannii avalan la existencia de diferentes canales con selectividad diferencial hacia sustratos como aminoácidos básicos e imipenem en la ME. También nos indican que reducciones en la permeabilidad a carbapenemes por pérdidas de PME en A. baumannii pueden contribuir a, pero no son determinantes principales de, dichas resistencias. Estudios utilizando geles de poliacrilamida bidimensionales (2D) indicaron que CarO se encuentra en la ME de cepas de A. baumannii así como de recambiantes de ADP1 formando tanto complejos homo-oligoméricos como hetero-oligoméricos con OmpA, la proteína mayoritaria de la ME. Ello apoya la hipótesis de que estos oligómeros podrían generar canales acuosos de mayor diámetro que facilitarían el ingreso de aminoácidos básicos o de carbapenemes a través de esta barrera de permeabilidad. Los resultados del segundo objetivo sobre la caracterización de plásmidos de resistencia a carbapenemes presentes en cepas clínicas locales de A. baumannii perteneciente al CC15 contribuyen a comprender la capacidad de las mismas de diseminar el gen de la carbapenemasa OXA-58 (blaOXA-58) en el ambiente nosocomial. Dichos plásmidos se encuentran en un estado dinámico de formación y resolución de co-integrados mediado por eventos de recombinación sitio-específica empleando sitios reconocidos por recombinasas XerC/D. Ello conduce a la generación de diferentes multi-replicones portando módulos de adaptabilidad conteniendo al gen blaOXA-58, lo cual contribuye a su movilización y diseminación en la población bacteriana mediante transferencia horizontal de genes. La presencia de diferentes módulos de replicación en una misma molécula de plásmido confiere evidentes ventajas para la diseminación y persistencia del co-integrado durante el tránsito por múltiples hospedadores, pero genera interrogantes sobre si todos estos replicones son efectivamente activos o sobre posibles conflictos que conduzcan a la pérdida del mismo o del módulo de adaptabilidad que esta porta. Encontramos que los 4 diferentes módulos replicativos que componen estos multi-replicones se mostraron activos al ser clonados en forma individual en diversos hospedadores del género Acinetobacter, incluyendo cepas nosocomiales y ambientales. Ello indica para los mismos un amplio rango de hospedador frente a eventos de transferencia horizontal, permitiendo así la rápida diseminación de la resistencia dentro de especies del género coexistiendo en el ambiente nosocomial. La caracterización detallada de la secuencia de los distintos módulos replicativos, sumada a ensayos funcionales, indicaron que todos ellos responden al modelo de iterones con regulación negativa del número de copias y donde cada uno posee un gen distintivo para una proteína de inicio de la replicación RepAci de la superfamilia Rep_3. El número de copias por célula de los módulos de replicación clonados en forma individual, medido en hospedadores modelo del género Acinetobacter, varió entre 5 a 8 ubicándolos en el espectro moderado. En uno de ellos identificamos regiones repetitivas independientes de los iterones las cuales se mostraron como reguladores negativos de su replicación, con potencial impacto en la resistencia antibiótica. Demostramos, asimismo, y por vez primera, que replicones Rep_3 de plásmidos de A. baumannii presentan incompatibilidad funcional, desarrollando una metodología a tal efecto. Nuestros resultados indicaron además que las clasificaciones basadas en identidades de secuencia de proteínas RepAci no son buenas predictoras de incompatibilidad funcional, y por ende de la posible coexistencia de diferentes replicones en una misma célula. En síntesis, esta tesis contribuye a definir algunos de los factores involucrados en la evolución y diseminación de resistencia a carbapenemes mediada por plásmidos en la población nosocomial de especies del género Acinetobacter, y pueden contribuir al diseño racional de medidas y herramientas farmacológicas para el control de infecciones debidas a patógenos oportunistas multirresistentes en el ámbito hospitalario.