Identificación de biomarcadores seminales con utilidad pronóstica en tratamientos de reproducción asistida

El factor masculino es responsable de aproximadamente la mitad de los casos de infertilidad en las parejas. Un desafío importante en andrología son los pacientes con parámetros seminales normales que no logran embarazar a sus parejas, no habiéndose encontrado causas de infertilidad femenina. A dichos casos se los denomina como infertilidad masculina inexplicada (UMI, por sus siglas en inglés). En la actualidad, el espermograma constituye el análisis clásico para el diagnóstico de infertilidad masculina. Sin embargo, este método tiene una utilidad limitada para evaluar calidad espermática y no es apropiado para predecir el desarrollo embrionario en tratamientos in vitro. Esto expone la necesidad de hallar nuevos biomarcadores capaces de evaluar la calidad espermática, que complementen la información provista por los análisis clásicos. En este sentido, los ARNs derivados de ARNt inducidos por estrés (tiARNs), se han propuesto como potenciales biomarcadores de infertilidad masculina. Se ha demostrado la existencia de asociaciones entre la expresión aberrante de estas moléculas y distintos tipos de infertilidad. Por este motivo, en este trabajo de tesina se estudió el potencial empleo de la cuantificación de 5’-tiARNs abundantes en plasma seminal como biomarcadores pronósticos en procedimientos de reproducción asistida. Para llevar a cabo los objetivos propuestos se realizó un estudio prospectivo con parejas que se sometieron a uno o más tratamientos de ICSI (inyección intracitoplasmática de espermatozoides) con ovocitos donados, para minimizar los posibles factores de infertilidad femenina, en el Centro Médico PROAR. En función del resultado del procedimiento las muestras de plasma seminal fueron divididas en tres grupos: ICSI (+), parejas que lograron el embarazo, 1FIC, aquellas que realizaron solo un ciclo sin embarazo (en inglés, “1 failed ICSI cycle”) y +2FIC, parejas que se sometieron a más de un procedimiento de ICSI sin éxito (posibles casos de UMI). Específicamente para esta tesina se incorporaron al estudio 17 nuevas muestras de semen, alcanzando un n total de 59 (31 ICSI (+), 17 1FIC y 11 +2FIC). Luego se cuantificaron por RT-qPCR los niveles de 5´-tiARN-Gly , 5´-tiARN-Glu , 5´-tiARN-Lys , 5´-tiARN-Val, todos ARNs pequeños abundantes y potencialmente funcionales en plasma seminal según diversos relevamientos bibliográficos y nuestros estudios preliminares. Las cuantificaciones realizadas por RT-qPCR no arrojaron asociaciones significativas entre los niveles de dichas moléculas y el éxito/fracaso de los procedimientos de ICSI, en oposición a resultados preliminares del laboratorio. En la cohorte analizada, esta técnica mostró limitaciones en cuanto a sensibilidad y reproducibilidad, razón por la cual se llevó a cabo la puesta a punto de una técnica alternativa para dicho fin, la ddPCR, que promete una sensibilidad superior y resistencia a los inhibidores de la PCR. La cuantificación de 5’-tiARN-Gly seminal mediante ddPCR mostró niveles significativamente superiores de esta molécula en el grupo de pacientes con reiterados procedimientos de ICSI fallidos, lo que coincide con investigaciones previas del laboratorio. En líneas generales, la ddPCR demostró ser un método superador a la RT-qPCR para la cuantificación de estos marcadores en plasma seminal, en términos de los niveles de detección alcanzados y el coeficiente de variación de los datos. La incorporación de tiARNs en los espermatozoides ocurre durante su maduración en el epidídimo. Este órgano está poblado por macrófagos que, integrando señales sistémicas, regulan el funcionamiento del epidídimo a través de metabolitos producidos por estas células. En esta tesina también se inició la caracterización de los mecanismos que regulan la producción y secreción de 5’-tiARNS en el epitelio epididimal mediante estudios in vitro, evaluando el rol de mediadores inmunoendócrinos. Para explorar la comunicación epiteliomacrófago tisular, desarrollamos un modelo in vitro empleando macrófagos derivados de la línea celular monocítica humana THP-1. Estas células fueron tratadas con dexametasona (D), un glucocorticoide sintético derivado del cortisol, para emular una respuesta sistémica al estrés y en dichas condiciones se determinó la producción de 5'-tiARNs y de la enzima central de su síntesis, angiogenina.Nuestros resultados demuestran que ante el tratamiento con glucocorticoides, los macrófagos liberan 5’-tiARNs al medio extracelular de manera dosis dependiente, sugiriendo un potencial rol de estas moléculas en la comunicación intercelular. En suma, los estudios realizados en este trabajo de tesina validan un perfil de ARNs pequeños alterado en plasma seminal de pacientes normozoospérmicos que se sometieron a más de un ciclo fallido de ICSI con ovocitos donados (posibles casos de UMI) y demuestran la superioridad de la técnica ddPCR respecto a la RT-qPCR para la cuantificación de estas moléculas. Asimismo, nuestros estudios in vitro en la línea celular THP-1 aportar información preliminar de relevancia para la caracterización del rol del macrófago residente en la respuesta inmunoendócrina del tejido epididimal.