Estructura e interacciones de proteínas reguladoras del desarrollo en plantas: estudio de HYL1 y la familia GRF

Abstract

El crecimiento y desarrollo de las plantas depende de complejos mecanismos regulatorios que controlan de forma precisa y concertada eventos moleculares que ocurren en momentos y tipos celulares determinados. La expresión génica desempeña un papel esencial en la coordinación espaciotemporal de estos procesos, garantizando su correcta ejecución y adaptabilidad a señales internas y externas. Su regulación puede llevarse a cabo mediante diversos mecanismos, incluidos la regulación transcripcional y el silenciamiento génico postranscripcional mediado por microARNs (miARNs). Los factores reguladores del crecimiento (GRFs) y la proteína HYPONASTIC LEAVES 1 (HYL1) desempeñan funciones regulatorias fundamentales durante el desarrollo de las plantas. Mientras que los GRFs son factores de transcripción que participan en procesos que abarcan desde el desarrollo foliar a la tolerancia a la sequía, la proteína HYL1 es un componente del complejo microprocesador que participa en la biogénesis de los miARN. Ambos tipos de proteína comparten la particularidad de poseer una arquitectura estructural en donde su rol biológico se encuentra determinado por las características individuales de dominios funcionalmente divergentes que se encuentran espaciados por regiones conectoras. En ambos casos, su función regulatoria depende de la acción sinérgica de sus dominios modulares, cuya capacidad para reconocer componentes celulares específicos depende de su estructura o motivos a nivel de su secuencia primaria. Sin embargo, los determinantes estructurales que definen la función de ambas proteínas no han sido descriptos en detalle. En esta tesis doctoral se caracterizaron las propiedades estructurales que definen a la familia GRF y a la proteína HYL1. A través de análisis bioinformáticos se encontraron motivos conservados en el dominio de transactivación de los GRFs que sugieren la existencia de cuatro subfamilias funcionalmente divergentes y, además, se identificaron determinantes intrínsecos en su dominio de unión a ADN (WRC) que los distinguen de otras proteínas. Utilizando técnicas biofísicas de alta y baja resolución se logró caracterizar la estructura del dominio WRC, un dedo de zinc no canónico, y se identificaron los residuos responsables de reconocer secuencias cis-regulatorias de los GRFs. A su vez, se caracterizó el carácter modular e independente de los dominios que conforman la arquitectura de HYL1, describiendo su naturaleza monomérica in vitro, y la plasticidad conformacional de su dominio C-terminal desestructurado. En este sentido, el estudio detallado de su dominio de dimerización putativo, un dsRBD no canónico, permitió identificar un puente disulfuro que impone restricciones estructurales esenciales para la función in vivo de HYL1. Los conocimientos generados en este trabajo no solo aportan nueva información sobre la relación estructura-función de proteínas que gobiernan la regulación del desarrollo vegetal sino también contribuyen al desarrollo de las herramientas biotecnológicas emergentes basadas en el módulo regulatorio GRF:GIF.

Plant growth and development relies on complex regulatory mechanisms that finely tune molecular events occurring at specific times and cell types. Gene expression plays a crucial role in the spatiotemporal orchestration of these processes, ensuring their proper execution and adaptability to internal and external cues. This regulation can be achieved through various mechanisms, including transcriptional regulation and post-transcriptional gene silencing mediated by small RNAs (miRNAs). Growth-regulating factors (GRFs) and the HYPONASTIC LEAVES 1 (HYL1) protein perform fundamental regulatory functions during plant development. While GRFs are transcription factors involved in processes ranging from leaf development to drought tolerance, HYL1 is a component of the microprocessor complex that participates in miRNA biogenesis. Both protein types share a modular structural architecture in which their biological roles are determined by the functional characteristics of divergent domains interconnected by linker regions. Their regulatory functions depend on the synergistic action of these modular domains, whose capacity to recognize specific cellular components is dictated by their structure or sequence motifs. However, the structural determinants underlying the function of both proteins remain poorly understood. This doctoral thesis explores the structural properties defining the GRF family and the HYL1 protein. Through bioinformatic analyses, conserved motifs in the GRF transactivation domain were identified, suggesting the existence of four functionally divergent subfamilies. Additionally, intrinsic determinants within the DNA-binding domain (WRC) were uncovered, distinguishing GRFs from other proteins harbouring WRC domains. Using high- and low-resolution biophysical techniques, the structure of the WRC domain, a non-canonical zinc finger, was characterized and the residues responsible for recognizing GRF cis-regulatory sequences were identified. Furthermore, the modular and independent nature of the domains comprising HYL1 was characterized, describing its monomeric nature in vitro and the conformational plasticity of its disordered C-terminal domain. Detailed analysis of its putative dimerization domain, a non-canonical dsRBD, revealed a disulfide bond that imposes structural constraints essential for HYL1's in vivo function. The findings from this work provide novel insights into the structure-function relationship of proteins governing plant developmental regulation. Additionally, they contribute to the advancement of emerging biotechnological tools based on the GRF:GIF regulatory module.