El rol de proteínas adaptadoras de proteasas en la fisiología bacteriana

Abstract

ClpS es la N-recognina de la vía bacteriana de la regla N-terminal y dirige proteínas portadoras de N-degrones al complejo proteolítico ClpAP. Este trabajo buscó identificar proteínas asociadas a ClpS y determinar si la disponibilidad de Mg²⁺ y la fuente de carbono modulan dichas asociaciones. Mediante LC-MS/MS cuantitativa se caracterizaron los proteomas basales de Escherichia coli cultivada bajo cuatro combinaciones de bajo o alto Mg²⁺, con glucosa o glicerol. Además, se implementó una estrategia de marcaje por proximidad in vitro basada en las fusiones ClpS(WT)-TurboID y ClpS(AA)-TurboID, esta última mutada en el bolsillo de reconocimiento de N-degrones. El análisis proteómico reveló perfiles de abundancia específicos de cada combinación. Bajo limitación de Mg²⁺, el glicerol se asoció con una mayor representación del metabolismo energético y una reducción de funciones de mantenimiento y biosíntesis, mientras que con glucosa predominaron ajustes relacionados con el ADN, la transcripción y la envoltura celular. Con Mg²⁺ suficiente, el glicerol se vinculó con el metabolismo del carbono, la biogénesis de la membrana externa y la adquisición de hierro; la glucosa, con funciones biosintéticas, homeostasis redox y mantenimiento celular, junto con una menor representación de rutas para utilizar fuentes de carbono alternativas. El análisis de presencia y ausencia identificó además un conjunto reducido de proteínas exclusivas de determinadas condiciones. Estos resultados definieron el contexto fisiológico y la referencia de abundancia para interpretar el marcaje por proximidad. Ambas proteínas quiméricas se obtuvieron en forma soluble, y la espectrometría de masas confirmó su identidad y las sustituciones esperadas en ClpS(AA). La detección de sitios adicionales de biotinilación tras agregar biotina fue compatible con la actividad de TurboID, aunque no permitió determinar su eficiencia. Los ensayos realizados con tres de las cuatro condiciones identificaron un número reducido de proteínas biotiniladas, sin diferencias reproducibles entre ClpS(WT) y ClpS(AA). Por lo tanto, no fue posible detectar asociaciones dependientes del reconocimiento de N-degrones ni establecer su modulación por el estado fisiológico. El trabajo caracteriza la remodelación proteómica de E. coli y aporta herramientas para optimizar futuros estudios de sustratos e interactores de ClpS.