Ingeniería metabólica para la producción de nuevos compuestos lipídicos en Escherichia coli

Abstract

La sociedad moderna depende en gran medida de los combustibles fósiles, como el petróleo y el gas natural, para una amplia gama de productos industriales. Sin embargo, estos recursos son finitos y su combustión contribuye significativamente al cambio climático. Los oleoquímicos, productos industriales derivados de lípidos naturales ofrecen una alternativa renovable y neutra en carbono a los petroquímicos. Estos compuestos tienen diversas aplicaciones industriales, desde jabones y lubricantes hasta biocombustibles y cosméticos, y su aplicabilidad depende de la estructura química del lípido del cual deriva. En la actualidad, la mayor parte de la industria oleoquímica depende de aceites de origen vegetal como materia prima. Si bien estos aceites tienen relativamente bajo costo de obtención, la producción de oleoquímicos a partir de aceites comestibles genera fuertes debates sociopolíticos respecto al uso de tierras cultivables y alimentos para la producción de productos químicos y biocombustibles. Además, los ácidos grasos que los componen presentan limitada diversidad estructural respecto al largo de cadena y un alto grado de instauración, otorgándoles inestabilidad térmica y oxidativa, lo que restringe su espectro de aplicaciones. En este contexto, los microorganismos emergen como una plataforma con gran potencial para la producción de oleoquímicos. Por un lado, comparados con organismos superiores como las plantas, los microorganismos poseen un ciclo de vida mucho más corto, se requiere pequeñas superficies para su crecimiento y ofrecen la posibilidad de utilizar fuentes de carbono alternativas y sustentables. Por otro lado, la ingeniería genética y de proteínas, permite manipular su metabolismo para generar lípidos con mayor diversidad estructural que puedan cubrir los distintos requerimientos de la industria. En esta tesis, se aplicaron estrategias de ingeniería metabólica y biología sintética en la bacteria Escherichia coli para modificar su vía nativa de síntesis lipídica, y establecer y optimizar rutas de biosíntesis de lípidos no-naturales. En particular, los esfuerzos se centraron en la obtención de ácidos grasos y ésteres metil-ramificados. La introducción de una cadena lateral corta en una molécula acilada con alto grado de saturación, impide el empaquetamiento a bajas temperaturas por motivos estéricos, disminuyendo su punto de fusión, mientras mantiene inalterada su estabilidad química. Ambas propiedades son deseadas, por ejemplo, en el desarrollo de biocombustibles avanzados y biolubricantes. El primer capítulo aborda la producción de ésteres de cadena larga multi-metil-ramificados, a través de la introducción de metil-ramificaciones en el motivo alcohol de dichos ésteres. Previamente, el grupo de trabajo donde se realizó esta tesis desarrolló una plataforma para la síntesis de ésteres metil-ramificados (EMR) en E. coli, mediante la introducción y adaptación del sistema de síntesis del ácido micoserósico de Mycobacterium tuberculosis. Estos EMR consistían en ácidos grasos tetra-metilramificados, esterificados con el alcohol de cadena lineal n-octanol, y demostraron tener propiedades fisicoquímicas compatibles con un potencial uso como biolubricante. En esta tesis, se amplió la diversidad estructural de estos EMR, adaptando y optimizando el sistema para la biosíntesis de EMR de alcoholes de cadena ramificada, isobutanol e isopentanol. Se implementó una vía metabólica para la síntesis endógena de estos alcoholes a partir de intermediarios del metabolismo de aminoácidos. Además, se diseñó una estrategia de co-cultivo compuesto por una cepa dadora de isobutanol y otra que lo utiliza para sintetizar los EMR. Este sistema resultó en productividades de novo similares a las obtenidas por el agregado externo de alcoholes. Por último, se evaluó la funcionalidad del co-cultivo en fermentaciones de alta densidad celular de tipo fed-batch. El segundo capítulo, tuvo a los ácidos grasos de E. coli como blanco para la introducción de metil-ramificaciones. El objetivo fue emular las propiedades del "ácido isoesteárico", un producto que consiste en una mezcla de ácidos grasos metil-ramificados (AGMR), y se considera que posee propiedades “ideales” para ser utilizado como biocombustible y biolubricante. Sin embargo, se obtiene mediante síntesis química a partir del ácido oleico presente en aceites vegetales, y su producción es costosa y limitada. Por lo tanto, este capítulo se centra en la reprogramación de la maquinaria nativa de síntesis de ácidos grasos (FAS II) de E. coli para producir AGMR. Se demostró que la FAS II posee la plasticidad necesaria para incorporar metilmalonil-ACP como unidad extensora, logrando sintetizar una mezcla compleja de ácidos grasos con grupos metilo en posiciones pares al azar (R-AGMR). Mediante la introducción de enzimas aciltransferasas para aumentar el suministro de la unidad extensora, la expresión de tioesterasas heterólogas específicas, y el cultivo en fermentaciones de alta densidad celular, se lograron incrementar significativamente los títulos alcanzados. Finalmente, el tercer capítulo se enfoca en superar las limitaciones catalíticas de la FAS II nativa mediante el diseño de sistemas de selección basados en el acoplamiento de la producción al crecimiento, con el fin de habilitar futuros procesos de evolución dirigida y aumentar los títulos de RAGMR producidos. Se exploraron dos estrategias: i) manipulación de los pools de acil-coenzima A mediante inhibición bioquímica de la acetil-CoA carboxilasa, en combinación con el control de precursores mediante el agregado exógeno de malonato/metilmalonato, buscando favorecer el uso de metilmalonil-CoA; y ii) evaluación de rol funcional de AGMR en la membrana. Mediante la construcción de cepas auxótrofas para ácidos grasos insaturados, se demostró que los AGMR (específicamente el ácido 10-metilheptadecanoico) son capaces de reemplazar a los ácidos grasos insaturados nativos, restaurando la fluidez de membrana y la viabilidad celular. Este hallazgo valida un sistema de presión selectiva para evolucionar enzimas con mayor especificidad hacia sustratos ramificados.