Eventos moleculares que modulan la adquisición de capacidad fecundante del espermatozoide de mamíferos

En mamíferos, los espermatozoides recién eyaculados no pueden fecundar al ovocito; deben experimentar un proceso denominado capacitación, que ocurre en el tracto reproductor femenino. Este proceso involucra modificaciones postraduccionales (MPT) de proteínas, ya que los espermatozoides son transcripcional y traduccionalmente inactivos. La capacitación puede inducirse in vitro en medios con HCO₃ ⁻ y Ca²⁺ , que activan la adenilato ciclasa soluble (sAC) y aumentan el AMPc, activando la proteína quinasa A (PKA). La PKA regula múltiples eventos asociados a la capacitación, incluidos cambios en la motilidad y la respuesta acrosómica. La subunidad catalítica de PKA (PKAc) presenta una estructura bilobular: un lóbulo N-terminal (implicado en la unión de ATP) y un lóbulo C-terminal (que contiene el sitio catalítico y de unión al sustrato). En el lóbulo N-terminal destaca el “bucle de glicinas” (G-loop), esencial para coordinar el ATP y su correcta orientación para la transferencia del grupo fosfato. En este trabajo se estudió cómo la acetilación de lisinas en PKAc modula su actividad. La acetilación de lisinas, catalizada por acetiltransferasas y revertida por deacetilasas, es una MPT con un rol regulador en diversas funciones celulares. Recientemente se ha evidenciado que proteínas espermáticas, incluidas subunidades de PKA, presentan acetilaciones que varían con la capacitación. Resultados previos mostraron que la hiperacetilación farmacológica aumenta la fosforilación de sustratos de PKA en espermatozoides de ratón, incluso en ausencia de AMPc. El objetivo principal de la tesis fue dilucidar los mecanismos por los cuales la acetilación de lisinas modula la actividad de PKAc. Para ello, se purificó PKAc recombinante (recPKAc) y se sometió a acetilación in vitro usando extractos de espermatozoides de ratón con acetiltransferasas endógenas. Se utilizaron inhibidores de deacetilasas (TSA y NAM) y Acetil-CoA como donador de grupo acetilo. La acetilación se verificó mediante Western blot y se identificaron tres lisinas acetiladas (Lys168, Lys279 y Lys309) usando espectrometría de masas. La Lys168, ubicada en el bucle catalítico, interacciona con los grupos fosfato β y γ del ATP y es clave para la unión de ATP y la catálisis. Mediante Resonancia Magnética Nuclear (RMN) de recPKAc marcada con 15N se detectaron cambios estructurales tras la acetilación, especialmente en el bucle de glicinas y en el sitio de activación. Esto sugiere que la acetilación induce modificaciones que podrían impactar en la unión de ATP y la catálisis Finalmente, se evaluó la actividad enzimática de recPKAc acetilada y no acetilada usando un ensayo electroforético (KiMSA). La acetilación aumentó significativamente la actividad catalítica de PKAc. Se descartó que este efecto se debiera a variaciones en la fosforilación de la Thr197 (pivotal para la activación en células somáticas). Mediante cinética enzimática se observó que la acetilación disminuye la Km de PKAc para ATP en un orden de magnitud, lo que indicaría mayor afinidad por ATP y, en consecuencia, mayor actividad catalítica. En conjunto, estos resultados sugieren que la acetilación de lisinas modula la actividad de PKAc al alterar su estructura y aumentar su afinidad por ATP, desempeñando un papel clave en la regulación de la capacitación espermática.